Baicalin（Bai）是一种源自scutellaria Baicalensis根部的类黄酮，表现出一系列药理活性，包括抗炎和抗氧化作用。然而，其低亲水性和亲脂性对其生物利用度构成了挑战，因此需要进一步的研究以优化其临床应用。Bai 可通过抑制 PI3K 通路、激活 PINK1 通路，激活 IL-1β 诱导的软骨细胞中的线粒体自噬，从而减轻 OA 相关的软骨细胞损伤。然而，Bai 介导的 OA 保护机制仍不完全清楚。
2025年1月22日，暨南大学第一附属医院骨关节外科查振刚/张还添团队联合暨南大学生命科学与技术学院免疫生物学系邢飞跃教授在Adv Sci 在线发表题为“A Baicalin-Based Functional Polymer in Dynamic Reversible Networks Alleviates Osteoarthritis by Cellular Interactions”的文章。基于黄芩苷设计了一种可注射水凝胶可用于减轻骨关节炎。
摘要
骨关节炎（OA）是一种主要影响老年人的全器官疾病，以软骨下骨和软骨的典型改变以及反复发生的滑膜炎症为特征。尽管有各种各样的治疗方法和药物，OA的完全治愈仍然难以实现。本研究通过整合天然生物活性分子开发了新型功能性水凝胶用于OA治疗。具体来说，黄芩苷（Bai）与丙烯酸2-羟乙基酯（HEA）通过酯化反应形成可聚合单体（HEA-Bai），再通过可逆的加成-碎片链转移（RAFT）聚合产生基于黄芩苷的聚合物（Pm）。这些大分子被整合到席夫碱水凝胶中，表现出优异的力学性能和自修复性能。值得注意的是，基于bai的制剂被成纤维样滑膜细胞（FLSs）摄取，并在那里调节糖酵解。在机制上，YAP1的抑制抑制了FLSs的糖酵解，减少了炎症因子的分泌，包括白细胞介素1β (IL-1β)， IL-6和IL-8。此外，功能水凝胶(AG-Pm)-OC作为润滑剂和营养物质，延长了白蛋白在关节的滞留时间，从而减少软骨降解和滑膜炎症。同时，(AG-Pm)-OC通过靶向YAP1信号，抑制巨噬细胞募集和极化，从而减轻关节疼痛。综上所述，这种以黄酮类化合物为基础的可注射水凝胶表现出增强的生物相容性和抗OA的疗效。
在这项工作中，我们通过将可逆加成断裂链转移（RAFT）聚合与酯化相结合合成了一种白基生物活性聚合物（P m ）。P m随后与胺化明胶 (AG) 缀合，并通过席夫碱反应与氧化硫酸软骨素 (OC) 结合（方案 1）。由此产生的可逆交联网络表现出所需的润滑和营养功能，这归因于可注射水凝胶的天然前体硫酸软骨素（ChS）和明胶（Gel）。功能性水凝胶（（AG-P m） - oc）在体外和体内模型中表现出了优质的抗炎活性和软骨保护作用，引入了一种新型范式，用于治疗包括OA在内的退行性关节疾病。
1 功能化AG-Pm的合成与表征
白蛋白具有独特的化学结构，具有天然的生物活性，但其代谢快、生物利用度差，阻碍了其应用为了解决这一问题，我们将Bai与亲水单体HEA结合，形成可聚合单体（HEA-Bai），该单体具有C = C双键，便于后续聚合。值得注意的是，HEA中的羟基和Bai中的羧基能够在保留Bai生物活性的同时构建HEA-Bai如图1A所示，我们通过酯化成功获得HEA-Bai， Bai转化率高达85%。HEA-Bai在545.1297 (C26H24O13, [M + H]+；计算m/z = 545.1290)（图1B）。然后，HEA-Bai通过RAFT聚合得到了基于bai的聚合物（Pm），通过水合骨架来提高渗透率RAFT聚合由硫代羰基硫链转移剂4-氰基-4-[[（十二烷基硫基）羰基硫代基]硫代戊酸（CDSPA）介导，生成分布窄的大分子在图1C中，大分子Pm由d、d ‘、e和e ’峰确定，这些峰对应Pm中的HEA骨架，而a、b、b ‘、c和c ’峰被分配给HEA垂坠物。g、h、j、k、m、n峰表明白蛋白在Pm中存在。如图1D所示，均匀的Pm曲线显示了RAFT聚合的优势，合理的分散度（Mw/Mn）为2.50，分子量（Mn）为36 200 g/mol。根据Bai的标准曲线，确定Pm中Bai的含量为5.86%（图1E），与由Bai和Pm的质量比计算出的理论值8.7%接近。与中性条件（pH 7.4）相比，Pm在pH 6.8时表现出更快的Bai释放（图1F），这与之前的报道一致，即酯键在酸性条件下更不稳定，这可能有利于OA关节环境。与Gel相比，AG中的游离氨基增加到220%，代表了氨基的大量增加（图1G）。随后，以乙基-二甲基-氨基丙基碳二亚胺（EDC）和n -羟基-琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂，将羧基末端末端的Pm接枝到AG上以改善其力学性能。根据FT-IR光谱，AG-Pm和Pm的短键长分别在1735和1732 cm−1处观察到C键长的伸缩振动，这表明AG-Pm中存在Bai（图1H）。综上所述，我们通过一系列化学偶联合成了具有良好表征的AG-Pm和OC。
图1 HEA-Bai，大分子Pm和前体AG-Pm表征
2 功能性(AG-Pm)-OC的流变研究和降解行为
可注射水凝胶因其微创注射能力来适应不规则的关节缺陷，已广泛应用于再生医学。为了研究功能水凝胶的流变性能，我们使用Malvern kinexus pro+休斯仪进行了四种扫描模式。如图2a所示， （Ag -P M）10 -oc 10的应变振幅扫描模式显示了一个线性粘弹性区域，范围从0％到229％，储存模量（G'）超过损耗模量（G ”）。稳定（AG-P M）10 -oc 10的频率依赖性流变行为揭示了其固体样特性和能力，可维持原始网络结构范围为0.1至300 rad S -1，G'保持较高比g'（图 2b）。（Ag-P M）的G'值10 -OC 10在 1% 应变下高于其 G" 值，且网络完整（图 2C）。然而，G' 值迅速降至 G'' 值以下，表明 300% 应变时网络中断。值得注意的是，(AG-P m ) 10 -OC 10在三个循环中表现出恢复行为，当应变从300%降至1%时，G'值超过了G''值，表现出高效的自修复性能。此外，通过剪切稀化测试评估了 (AG-P m ) 10 -OC 10的可注射性，结果表明粘度在 0.1 至 300 s -1范围内下降（图 2D）。流变学研究表明，通过在可逆网络中纳入动态共价键，（Ag -P M）10 -oc 10的机械强度成功改善了。
将水凝胶在1 Hz处承受5 n载荷。如图 2E所示（AG -P M）5 -oc 10(AG-P m ) 10 -OC 10的摩擦系数(COF)分别为0.13和0.18，低于先前报道的关节软骨的摩擦系数(0.2)。此外，图 2F描绘了不同交联度对水凝胶综合性能的影响。(AG-P m ) 10 -OC 10显示出比(AG-P m ) 5 -OC 10 (16.9KPa)更高的压缩应力(24.3KPa) 。对功能性水凝胶进行拉伸性能以综合评估机械性能。同样，(AG-Pm）10 -oc 10高于（Ag -p M）5 -oc 10（图 2G）。水凝胶的不必要的肿胀行为会恶化凝聚力并损害网络的内部结构。（AG-P M）10 -oC 10的肿胀比（Ag-P M）5 -oc 10 ，归因于（AG-P M）10 -oC 10，10 -oc 10的交联密度减少游离水分子的摄取（图 2H）。此外，水凝胶在降解为调节细胞行为和表型的细胞微环境后可能会影响有机代谢。如图 2I，水凝胶的酶促降解显示72小时内显著降解，降解程度与持续时间正相关。m)5-OC10的降解m)10-OC10更高的降解性 (55%)，这是由于其较低的交叉连接密度（图 2J）。在图 2K，在 pH 7.4 下模拟生理条件的水凝胶的降解表现出类似的行为，尽管降解速度稍慢。这种现象源于 (AG-P m )-OC 水凝胶中的希夫碱结合和酯键在酸性条件下不稳定，加速降解。此外，在图2L中观察到 Bai从(AG-P m ) 10 -OC 10中持续释放。这些发现提供了一种可行的方法来延长 Bai 的循环，从而通过调整水凝胶的降解性来克服突释，以维持 OA 治疗的长期稳定性。
图2（Ag-P M ）-oc水凝胶的流变学研究，机械性能和降解
3 P m通过抑制糖酵解调节 FLS 的炎症
细胞摄取 P m (15 µg mL −1）通过将P M用1,1'-二二烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚二氨基苯胺（DID）标记为FLS （DID）。从详细的角度来看，FLS与不同浓度的P M（5、10、15和17.5 µg ML -1 ）共培养12小时，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察（图 3A）。荧光强度逐渐从5 µg mL -1逐渐增加，并在15 µg mL -1时达到饱和度，表明15 µg ml -1是12小时时细胞摄取的理想浓度。同时，在4、8、12和16小时观察到用P M（15 µg mL -1 ）处理的FLS 。如图 3b所示，12小时是FLS吸收P m的最佳间隔。结果还通过荧光激活的细胞分选（FACS）来验证（图 3A，b）。通过在不同间隔（图 3C – E）。值得注意的是，BAI组在最初6小时内表现出比P M组更好的抗炎作用，而IL-1β，IL-6和P M组中的IL-8在24小时内超过了BAI组（图 3C – E）。该观察结果可以通过早期BAI的快速吸收来解释，而P M从P M中受控释放的BAI延长了其循环时间，从而增强了其抗炎活性。研究了P M对FLS糖酵解的影响。用IL-1β处理的FLS显示出最高的细胞外酸化率（ECAR）（图 3F），表明炎症确实增强了细胞糖酵解和糖酵解能力。然而，与BAI和对照组相比 ，P M显著抑制了FLS的糖酵解（图3F – H）。我们使用分子对接和蛋白质印迹 (WB) 的结果确实发现 YAP1 是 Bai 的潜在下游靶标。为了支持这一点，与对照组和单独的 Bai 相比 ，P m剂量依赖性地降低了YAP1 mRNA 水平（图3I，J）。这些结果共同表明 P m可能是通过 YAP1 糖酵解调节来调节炎症细胞因子表达水平的有前途的大分子。
图3 P m通过 YAP1 介导的 FLS 糖酵解调节炎症因子的分泌
4 Bai-Based制剂的长期联合保留和生物分布
我们利用前交叉韧带切断（ACLT）诱导的OA小鼠模型研究了基于bai的制剂的滞留和生物分布。用1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚三碳青氨酸碘化（DiR）对Bai、Pm和（AG-Pm）10-OC10进行化学标记，并通过活体成像系统（IVIS）进行监测（图4A）。各组的荧光强度最初相似，随着时间的推移逐渐降低（图4B）。10天后，（AG-Pm）10- oc10组剩余荧光强度（2.24 × 1011 p sec−1 cm−2 sr−1）高于Bai组和Pm组（图4B）。辐射效率的曲线下面积（area under The curve， AUC）表明（AG-Pm）10-OC10组在OA小鼠中的关节保留率也最好（图4C）。在体内，以Bai为基础的制剂的生物分布和毒性有待阐明。为此，我们观察了单次注射（AG-Pm）10-OC10/DiR、Pm/DiR或Bai/DiR后24 h的OA小鼠。荧光成像显示，水凝胶定位于股骨髁和胫骨平台，但随后它在肝脏内代谢（图4E，F），可能是由于清除机制，包括在滑液中分散、毛细血管吸收、淋巴引流、排泄和肝脏解毒为了进一步确定（AG-Pm）10-OC10在体内的摄取，我们在膝关节切片上进行了典型成纤维细胞标志物PDGFR-α的免疫荧光（IF）染色。我们发现PDGFR-α染色的细胞（绿色）与did标记的（AG-Pm）10-OC10细胞（红色）共定位，表明（AG-Pm）10-OC10对FLSs具有高效的靶向选择性（图4G，H）。这些结果表明，基于bai的制剂可以延长关节保留率，并表现出优于滑膜组织的靶向选择性。
图4 基于Bai的制剂的联合保留，生物分布和共定位
5.（AG-Pm）10-OC10可减轻OA进展和滑膜炎症
步态分析是研究临床前OA模型行为变化的有用工具。因此，我们应用步态分析来评估基于bai的制剂在减轻关节疼痛中的作用。如图5A-C所示，与PBS组相比，（AG-Pm）10-OC10组足印、后肢步幅、单次站立均有明显改善。接下来，我们对OA小鼠的膝关节进行了组织学分析，以评估新开发的制剂的生物安全性和治疗效果。采用苏木素-伊红（he）和番红O/固绿（S/O）染色分析滑膜炎和软骨退变情况。值得注意的是，PBS组表现出明显的滑膜增厚，平均滑膜炎评分为7.7分（图5D，E）。（AG-Pm）10-OC10能有效减轻滑膜炎症，将评分降至4.0分，优于Bai（7.0分）和Pm（5.3分）。在国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International， OARSI）评分为7.8分的PBS组中，我们观察到软骨病变（图5F，G）。（AG-Pm）10-OC10组软骨退变程度明显减轻，评分降至4.0分。由于MMP13是OA的标志，其表达被密切监测来评估OA的进展和治疗效果低表达的MMP13诱导了大量的aggrecan和collagen II，反映了关节软骨的健康代谢状态与之前的研究一致，ACLT手术导致PBS组软骨（图5H，I）和滑膜（图5J，K）中MMP13的高表达水平，假手术组作为阴性对照。而（AG-Pm）10-OC10处理组MMP13的表达明显低于Pm组和Bai组。
我们最近发现，OA小鼠的背根神经节（DRG）中TRPA1表达水平较高因此，我们探索（AG-Pm）10-OC10是否可以调控DRG中TRPA1的表达。与PBS组相比，（AG-Pm）10-OC10处理显著降低了DRG中TRPA1的表达，表明其在缓解疼痛方面的效果更优（图5L，M）。YAP1/GLUT1信号通路在OA和代谢性关节炎中显著增加，导致滑膜炎症在此，我们发现（AG-Pm）10-OC10同时抑制了YAP1和GLUT1的表达（图5N-P）。总之，（AG-Pm）10-OC10通过抑制滑膜炎症反应是一种有效的治疗OA的策略。
图5 基于bai的制剂通过YAP1/GLUT1轴减缓OA进展
6 (AG-Pm)10-OC10通过调节巨噬细胞极化在体外和体内保护OA
与在FLSs中观察到的情况相似，did标记的Pm被RAW264.7细胞以剂量和时间依赖性方式摄取（图6A，B）。同时，对lps诱导的RAW264.7细胞进行M1型巨噬细胞标志物iNOS染色。与其他组相比，Pm组iNOS的表达水平显著降低（图6C，D）。接下来，Pm还通过定量实时PCR （qRT-PCR）下调iNOS mRNA表达水平（图6E）。为了支持这一观点，体内实验结果显示，与其他实验组相比，（AG-Pm）10-OC10组的CD206 （M2巨噬细胞的标志物）表达水平高（图6F，G）。相反，（AG-Pm）10-OC10组中iNOS的表达降低，表明（AG-Pm）10-OC10可能通过调节巨噬细胞极化作为OA的有效治疗策略（图6H，I）。总的来说，基于bai的功能性制剂显示出持续的OA治疗效果，在生物医学应用中具有良好的长期发展潜力。
图6 基于bai的制剂可调节巨噬细胞极化
结论
综上所述，我们通过席夫碱反应制备了一种动态可逆交联水凝胶（AG-Pm）10-OC10，作为OA治疗的功能平台。具体而言，Pm通过酯化和RAFT聚合合成，并随后纳入水凝胶中，通过调节FLSs的糖酵解，进而调节巨噬细胞极化，表现出显著的抗炎活性。生物相容性（AG-Pm）10-OC10由于其共价结合网络而表现出增强的机械和自修复性能。此外，（AG-Pm）10-OC10显示出减缓OA进展的前景，可能与滑膜中YAP1/GLUT1轴的下调有关。这项研究强调了（AG-Pm）10-OC10通过整合白蛋白的抗炎能力，为OA治疗提供了一种新的和有效的方法。
Yang Y, Hu Q, Shao Q, Peng Y, Yu B, Luo F, Chen J, Xu C, Li Z, Tam M, Ju Z, Zhang R, Xing F, Zha Z, Zhang HT. A Baicalin-Based Functional Polymer in Dynamic Reversible Networks Alleviates Osteoarthritis by Cellular Interactions. Adv Sci (Weinh). 2025 Jan 22:e2410951. doi: 10.1002/advs.202410951.
