2025年1月13日，上海中医药大学栾鑫/张卫东/张莉君团队在Cell Reports Medicine（IF=11.7）发表了题为“Dual ferroptosis induction in N2-TANs and TNBC cells via FTH1 targeting: A therapeutic strategy for triple-negative breast cancer”的文章，揭示隐丹参酮（CTS）的衍生物CT-1同时诱导N2型TANs和TNBC细胞发生铁死亡。机制上，CT-1通过靶向FTH1促进NCOA4与铁蛋白的相互作用，触发铁自噬介导的铁死亡。
•CT-1双靶点N2型TANs和TNBC细胞对抗TNBC
•CT-1选择性地清除N2型TANs而不影响其他免疫细胞
•CT-1通过靶向FTH1诱导铁自噬介导的铁死亡
•CT-1促进FTH1的溶酶体自噬降解
摘要
肿瘤相关中性粒细胞（Tumor-associated neutrophils, TANs）在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）的进展和预后中起着至关重要的作用，其中n2型TANs以其促肿瘤特性而闻名。本研究引入了一种隐丹参酮衍生物CT-1，它可以有效地抑制TNBC的生长，同时选择性地降低肿瘤组织中n2型TANs的比例。值得注意的是，CT-1同时诱导n2型TANs和TNBC细胞发生铁死亡，这一双重机制增强了CT-1的治疗效果。铁代谢的关键蛋白铁蛋白重链1 （FTH1）是CT-1的直接作用靶点。通过靶向FTH1， CT-1促进NCOA4与铁蛋白的相互作用，触发铁自噬介导的铁死亡。这些发现将CT-1定位为一种有前景的治疗药物，通过诱导n2型TANs和癌细胞的铁死亡提供了一种对抗TNBC的策略。这一方法强调了FTH1作为TNBC治疗靶点的潜力。
1.N2 型 TAN 和 TNBC 细胞更容易发生铁死亡
乳腺癌组织中存在大量中性粒细胞浸润，N2型TAN的患病率高于N1型TAN（图1A）。中性粒细胞浸润与乳腺癌的预后呈负相关（图1B）。此外，与其他亚型乳腺癌相比，TNBC 中的中性粒细胞丰度显著升高，N2 型 TAN 标记物的表达量相对于 N1 型 TAN 更高（图 1 C 和 1D）。TNBC 组织的免疫荧光分析证实了这些发现（图 1E 和 1H)。与N1型TAN共培养后，人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的存活和迁移受到抑制，而N2型TAN则促进存活和迁移（图1F 和 1G）。进一步分析发现，铁死亡相关基因在TNBC癌上皮细胞和中性粒细胞中升高（图1I）。油红 O 染色还表明，N2 型 TAN 比 N1 型 TAN 具有更高的脂质含量（图 1 J ），表明 N2 型 TAN 更容易发生铁死亡。最近的文献报道TANs可以通过抵抗铁死亡来促进乳腺癌的转移。因此，同时促进 N2 型 TAN 和肿瘤细胞的铁死亡可能是治疗 TNBC 的有效策略。此外，确定能够在 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞中同时诱导铁死亡的精确靶点也很重要。
图1 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞更容易发生铁死亡
2.CT-1 诱导 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞同时发生铁死亡
CT-1是中药丹参活性成分CTS的衍生物，其结构、1 H-NMR、1 3 C-NMR和质谱(MS)谱如图2A所示。CCK-8和RTCA结果表明，CT-1能够以剂量依赖性方式抑制人和鼠TNBC细胞系（MDA-MB-231、4T1和实验性乳腺肿瘤-6 [EMT6]）的增殖（图2 B、2C )。为了研究 CT-1 对中性粒细胞的影响，使用模型细胞系 HL-60 建立了 N1 型和 N2 型 TAN。细胞计数试剂盒8（CCK-8）结果显示N2型TAN对CT-1更敏感（图2K）。
利用转录组 RNA 测序 (RNA-seq) 进行进一步的机制研究。基因集富集分析（GSEA）表明，CT-1 调节的首要通路与细胞内铁稳态和铁死亡相关。然后，使用铁死亡抑制剂（ferrostatin-1 [Fer-1]、liproxstatin-1 [Lip-1]和去铁胺[DFO]）来探讨CT-1是否可以诱导铁死亡。所有三种铁死亡抑制剂均可逆转 CT-1 对 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞的抑制作用（图 2D、2L )，表明CT-1通过铁死亡发挥其抗肿瘤作用。透射电子显微镜（TEM）显示CT-1增加了4T1细胞的铁死亡形态特征，例如线粒体尺寸减小、线粒体嵴消失和线粒体膜密度增加（图2E）。不稳定铁 (Fe 2+ ) 是铁死亡的关键标志物，可直接或间接增加细胞内铁水平，从而加剧氧化应激和铁死亡。施用CT-1后，Fe 2+水平显著升高（图2F）。谷胱甘肽（GSH）在肿瘤细胞中过度表达，是一种重要的抗氧化剂，可维持氧化还原代谢平衡并保护肿瘤细胞免受活性氧（ROS）介导的损伤。因此，氧化谷胱甘肽（GSSG）水平通常被认为是评估铁死亡强度的重要标志。CT-1处理后GSSG/GSH比值增加，表明GSH被氧化（图2G）。CT-1 还可以抑制 5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基碘化碳花青 (JC-1) 聚合物的形式，证明细胞线粒体膜电位降低（图2 H）。流式细胞术和荧光摄影结果发现，CT-1能够以剂量依赖的方式促进TNBC细胞中ROS的产生和脂质过氧化（图2I、2J）。在 N2 型 TAN 中也观察到了相同的效果（图2M-2O）。这些发现表明 CT-1 可以诱导 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞的铁死亡。
图2 CT-1 诱导 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞同时发生铁死亡
3.CT-1抑制TNBC肿瘤的生长
为了评价CT-1的体内抗肿瘤作用，将4T1和EMT6细胞接种到BALB/c小鼠的第四乳腺脂肪垫中，建立原位乳腺癌模型。荷瘤小鼠每天通过尾静脉注射CT-1，如图3A和3G所示。与对照组相比，CT-1显著抑制4T1和EMT6肿瘤的生长（图3B，3C，3H和3I），减轻肿瘤重量（图3D和3J），并延长生存时间（图3B，3C，3H和3I），降低肿瘤重量（图3D和3J 3K）。过免疫组化染色分析肿瘤组织中铁死亡相关标志物（4-羟基壬烯醛[4-HNE]、ROS、GPX4和FTH1），以证实CT-1在体内诱导铁死亡的作用。结果显示，CT-1处理后，ROS（二氢乙锭[DHE]阳性）和脂质过氧化（4-HNE阳性）显着升高，而GPX4和FTH1的表达显着降低（图3F、3L）。这些发现表明，CT-1 可有效诱导体内铁死亡。此外，小鼠体重稳定表明，CT-1 的给药对受试者没有毒理学影响（图 3E）。这些发现表明 CT-1 通过诱导铁死亡而显著抑制 TNBC 肿瘤生长。
图3 CT-1抑制TNBC肿瘤的生长
4.CT-1 减少促肿瘤 TAN 的浸润
认识到 TAN 在 TNBC 发展中的关键作用，进一步探讨了 CT-1 对 TAN 的影响。建立原位TNBC小鼠模型，并用CT-1或对照溶剂处理14天。然后，通过飞行时间 (CyTOF) 分析收集肿瘤进行细胞计数（图 4 A）。对这些细胞群的比较分析揭示了肿瘤免疫微环境 (TIME) 的显着变化，包括中性粒细胞 (CD11b +在 CT-1 治疗的小鼠中，Ly6G + ）、骨髓细胞（CD45 + CD11b + ）增加以及巨噬细胞显着增加（图 4 B-4D）。这些发现表明，CT-1可能增强各种白细胞向肿瘤的浸润，包括CD8 + T细胞、B细胞、树突状细胞和单核细胞。关于主成分分析 (PCA)，图 4E说明了主要负责群体分化的七个肿瘤群体。为了评估 CT-1 对中性粒细胞分化的影响，进行轨迹分析以研究中性粒细胞的动态进化及其与其他免疫细胞的相互作用。这些发现揭示了幼稚中性粒细胞暂时转变为 CCR2 +和 MMP12 +中性粒细胞亚型（图 4F和 4G）。此外，CT-1抑制中性粒细胞分化为CCR2 +和MMP12 +（图4H）。
CT-1可以降低4T1肿瘤组织内促肿瘤TAN的比例（图4I）。值得注意的是，CD206 被确定为抗肿瘤免疫的抑制剂。22流式细胞术分析证明 CT-1 降低了 4T1 肿瘤内 TAN 中免疫抑制细胞因子 CD206 的表达并增加了 NOS2，支持了这些发现22（图 4J和 4K）。与这些观察结果一致，肿瘤切片的免疫荧光分析表明，CT-1 减少了 CD206 N2 型 TAN 的存在，并增加了 NOS2 N1 型 TAN 的数量（图 4 L）。这些数据表明 CT-1 可以消除促肿瘤 TAN 并逆转中性粒细胞介导的肿瘤免疫抑制。
图4 CT-1 减少促肿瘤 TAN 的浸润
5.FTH1是CT-1的直接目标
FTH1 是铁蛋白的一个亚基，催化 Fe 2+氧化为 Fe 3+，在铁死亡中起着关键作用。为了确定 FTH1 是 CT-1 在铁死亡中的分子靶标，进行了药物亲和力响应靶稳定性 (DARTS) 测定。DARTS 样品的免疫印迹分析显示，在 4T1 细胞中用 100 μM CT-1 处理时，FTH1 在蛋白水解过程中的稳定性降低（图 5 A ）。然后，细胞热位移测定（CETSA）也证明CT-1可以降低完整活体4T1中FTH1的热稳定性（图5B) 49°C 和 52°C。随后使用 CETSA 和 DARTS 检测在 N2 型 TAN 中进行 FTH1 和 CT-1 相互作用验证。这些结果表明CT-1可以降低FTH1的酶稳定性和热稳定性（图5C、5D），表明CT-1以FTH1依赖性方式促进N2型TAN中的铁死亡。
分子动力学模拟显示FTH1与CT-1的结合（图5E）。表面等离子共振（SPR）结果显示CT-1直接与FTH1结合，KD值为17.15 μM（图5 F）。为了验证 Pro128 和 Thr123 在复杂相互作用中的关键作用，对这两个位点进行了突变，并使用微量热泳 (MST) 来测试亲和力。结果显示，CT-1与野生型FTH1的KD值为5.46 μM，而与突变型FTH1没有结合（图5G）。这一结果进一步证实了Pro128和Thr123在CT-1与FTH1结合中的关键作用。这些发现表明 CT-1 优先靶向 N2 型 TAN 的潜在原理。铁死亡、ROS 和脂质过氧化的标志物以剂量依赖性方式显著逆转（图 5H、5I ）。
蛋白质降解主要通过两条途径发生：蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径。最初引入了蛋白酶体抑制剂MG132，揭示其无法拮抗CT-1对FTH1蛋白的降解作用（图5J）。然后，添加溶酶体抑制剂巴弗洛霉素 A1 (BafA1) 或氯喹 (CQ) 可显著抑制 CT-1 诱导的 FTH1 蛋白降解（图 5K、5L）。表明CT-1促进FTH1的溶酶体自噬降解，而不是通过蛋白酶体途径。共聚焦显微镜分析显示，CT-1和BafA1处理增加了FTH1和LC3B的共定位，表明CT-1促进了FTH1的溶酶体自噬（图5M）。用自噬抑制剂BafA1预处理进一步增加了用CT-1处理的细胞中内源性LC3的含量（图5N）。这些发现表明，CT-1 触发的 NCOA4 介导的自噬在 FTH1 蛋白的降解中发挥着至关重要的作用，最终导致 CT-1 诱导的铁死亡。
图5 CT-1靶向FTH1并促进其NCOA4介导的铁蛋白自噬
6.阻断 N2 型 TAN 逆转 CT-1 的抗肿瘤作用
此外，为了确认 TAN 作为介导 CT-1 对肿瘤生长的抑制作用的主要免疫细胞的作用，我们用抗 Ly6G 抗体治疗 4T1 荷瘤小鼠以消耗中性粒细胞。每三天注射一次抗Ly6G抗体，对照组接受免疫球蛋白G（IgG）同种型对照，每天注射CT-1。实验设置如图6A所示。与野生型荷瘤小鼠的同型对照组相比，阻断中性粒细胞导致肿瘤生长减慢，并且CT-1的功效减弱（图6B -6E）。为了进一步证实 CT-1 通过抑制 N2 型 TAN 来减少 TNBC 肿瘤生长，体内进行了过继转移实验（图6F）。如图6G -6J所示，N2型TAN的过继转移恢复了CT-1的抗肿瘤功效。这些结果表明CT-1通过抑制N2型TAN发挥作用。
图6 阻断 N2 型 TAN 逆转 CT-1 的抗肿瘤作用
7.CT-1抑制TNBC PDO的生长
患者来源的类器官（PDO）作为一种临床相关且实用的模型，在药物反应预测方面显示出前景，反映了原始人类肿瘤的形态和特性。特别是在 TNBC PDO 中，先前的研究强调了它们在临床前药物试验和预测治疗结果中的适用性。在本研究中，进行了一项前瞻性观察性调查，以使用 TNBC PDO 模型评估 CT-1 的疗效。CT-1 在六天内以不同浓度给予 PDO，如图7所示A. CT-1 阻碍类器官的形成和活力。利用活/死染色进一步研究 CT-1 对类器官活力的影响，区分存活（绿色）和非存活（红色）类器官。结果显示，CT-1 处理后 TNBC 类器官的数量和活力显著降低，三种不同 PDO 的 IC 50值为 2.35 μM、3.69 μM 和 6.74 μM（图 7B和 7C）。
图 7 CT-1抑制TNBC PDOs的生长
结论
揭示了 FTH1 在促肿瘤 TAN 和 TNBC 细胞中的高表达，凸显了其作为中性粒细胞特异性癌症疗法的治疗靶点的潜力。CT-1 是一种靶向 FTH1 的小分子化合物，代表了一种通过诱导 TAN 和 TNBC 细胞铁死亡来治疗 TNBC 的方法。总之，我们的研究介绍了 CT-1 作为一种小分子，具有对抗 TNBC 的巨大潜在治疗潜力。CT-1通过靶向FTH1并促进NCOA4和铁蛋白之间的相互作用来有效抑制TNBC，从而在N2型TAN和TNBC细胞中诱导铁蛋白自噬介导的铁死亡。这些发现强调了 CT-1 的双重作用机制是通过诱导促肿瘤中性粒细胞和癌细胞同时铁死亡来治疗 TNBC 的一种有前景的策略。靶向 FTH1 来触发 N2 型 TAN 和 TNBC 细胞中的铁死亡已成为 TNBC 治疗的一种引人注目的方法，为未来的临床应用提供了途径
