番荔枝苷元 (ACG) 是一类独特且结构均质的聚酮化合物，源自番荔枝科植物，在多种癌症中表现出有效的抗增殖作用。Squamocin 是 ACG 最活跃的成分之一，对一系列癌细胞和化疗耐药性恶性肿瘤表现出显著的细胞毒性。squamocin 的直接分子靶点和相关信号通路尚未阐明。
2025年1月17日，南方医科大学检验医学与生物技术学院宁云山教授团队在Adv Sci上发表题为“Squamocin Suppresses Tumor Growth through Triggering an Endoplasmic Reticulum Stress-Associated Degradation of EZH2/MYC Axis”的文章。揭示热休克蛋白90α (HSP90α)为番荔枝内酯的直接靶点。机制上，squamocin破坏线粒体呼吸复合物I的功能，减少ATP的产生，并损害HSP90α的功能，引起内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）。
摘要
尽管番荔枝内酯类（ACGs）的抗肿瘤作用取得了长足的进步，但目前尚缺乏明确的生物学作用机制，仍然是其临床应用的主要障碍。在本研究中，我们发现squamocin在多种癌细胞系中有效地减少了EZH2和MYC，包括头颈部鳞状细胞癌，胃癌和结直肠癌，证明了在体内肿瘤模型中有效地抑制这些癌细胞。通过结合表面等离子体共振（SPR）、差示扫描荧光法（DSF）和细胞热位移实验（CETSA），确定热休克蛋白90α (HSP90α)为鳞状细胞蛋白的直接结合靶点。机制上，squamocin破坏线粒体呼吸复合物I的功能，减少ATP的产生，并损害HSP90α的功能，引起内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）。这些肿瘤细胞内的内在事件通过E1激活酶UBA6触发泛素，促进泛素转移到E2结合的UBE2Z，以及增加E3连接酶FBXW7的活性来降解EZH2和MYC，从而增强内质网应激相关的泛素化和降解。这些发现阐明了squamocin通过触发内质网应激相关的UBA6-UBE2Z-FBXW7泛素级联在癌蛋白EZH2和MYC降解中的作用，为加速EZH2/MYC轴驱动的肿瘤靶向治疗提供了新的思路。
1 Squamocin抑制高MYC表达的HNSCC细胞系的增殖
作为ACGs的主要抗肿瘤成分，squamocin是根据报道的程序从番荔枝种子中分离出来的，HPLC纯度达到93.13%。值得注意的是，我们发现squamocin对不同MYC表达水平的细胞表现出不同的作用，因为它对高水平MYC的HNSCC细胞系（CAL27、FADU、SCC15和SCC25）具有高度抑制作用，而对非癌性细胞作用较弱。低 MYC 表达的细胞系（NOK 和 HUVEC）。接下来，SCC15和SCC25用5至20 µg mL -1的squamocin处理12、24 和 48 小时。因此，我们发现鳞状细胞素在两种 HNSCC 细胞系中具有明显的剂量和时间依赖性细胞活力抑制作用（图 1A）。计算SCC15（IC 50 = 11.65 µg mL -1）和SCC25（IC 50 = 10.85 µg mL -1 ）的半最大抑制浓度（IC 50）（图 1A）。Squamocin 处理显着减少了 SCC15 和 SCC25 细胞中的集落数量（图 1B）。细胞周期分析表明 10 µg mL −1在SCC15细胞中，squamocin使细胞周期停滞在S期和G2/M期，而在SCC25细胞中仅在S期停滞（图 1C）。用10 µg mL -1 squamocin 处理后24小时，在SCC15和SCC25细胞中检测到细胞凋亡显著增加（图1D）。一致地，S期生物标志物Cyclin A2和CDK2在SCC15和SCC25细胞中均下调，而G2/M期生物标志物Cyclin B1仅在SCC15细胞中下调（图 1E）。此外，Squamocin 还增加了 Bax、活化的 caspase 3 和 PARP 的蛋白表达（图 1E）。这些结果表明，squamocin 可抑制 HNSCC 细胞的细胞增殖、诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡。
为了研究squamocin的促凋亡活性是否归因于其对线粒体呼吸复合物I的抑制，我们评估了squamocin对两种HNSCC细胞系中线粒体功能的影响。正如预期的那样，squamocin 显著抑制线粒体呼吸复合物 I 的活性，并减少 ATP 的产生（图 1F，G）。当这些细胞用线粒体特异性抗氧化剂 mito-TEMPO 预处理时，ATP 消耗部分恢复（图 1G）。此外，squamocin 提高了两种 HNSCC 细胞系中的活性氧 (ROS) 水平。而当这些细胞用mito-TEMPO预处理时，ROS积累被显著抑制（图 1H）。这些数据证实，鳞状细胞素会损害 HNSCC 细胞中线粒体呼吸复合物 I 的功能。然而，出乎意料的是，流式细胞术显示，用mito-TEMPO（10或100μm）预处理的两种HNSCC细胞系仅部分抑制squamocin诱导的细胞凋亡（图 1I），这表明其他机制可能介导squamocin的抗肿瘤作用。
图1 Squamocin 可抑制 HNSCC 的增殖、阻止细胞周期并促进细胞凋亡
2 HSP90α是Squamocin的直接结合靶点
为了解决这个问题，我们使用 SwissTargetPrediction 数据库通过目标钓鱼分析确定了 squamocin 的 100 个潜在蛋白质目标。随后，我们进行了蛋白质-蛋白质相互作用分析，以研究这些目标中的关键蛋白质，利用STRING数据库筛选具有最高置信水平（0.900）的节点（图 2A）。利用Autodock vina程序对排名前10位的蛋白与squamocin进行分子对接分析，发现squamocin与90 kDa热休克蛋白（HSP90α，由HSP90AA1编码）的N段肽链片段表现出最低的结合能。HSP90α 是一种 ATP 酶导向的伴侣，是最丰富的胞质分子伴侣之一，在调节蛋白质稳态中发挥着重要作用。对接结果表明，squamocin 与 HSP90α 在 Asn51（2.45 Å）、Gly97（3.16 Å）、Phe138（3.07 Å）和 Tyr139（1.87 Å）处形成常规氢键（图 2B，C）。为了验证计算对接结果，采用差示扫描荧光法 (DSF) 和表面等离子共振 (SPR) 分析来评估鳞状蛋白和 HSP90α 的结合能力。在 DSF 测定中， Squamocin 表现出从 2.5 °C 到 9.5 °C 的热位移 (ΔT m 1)，K D值为 1.9 × 10 -5 m在 SPR 测定中（图 2D、E）。为了验证预测的结合模式，我们用 N51A/G97A/F138K/Y139R 生成了 HSP90α 突变体，并使用细胞热位移测定 (CETSA) 重新评估了其结合能力。结果表明，该突变体消除了squamocin与HSP90α的结合（图 2F），表明HSP90α是squamocin的直接靶点。重要的是，我们发现 HSP90α 的敲低降低了 HNSCC 细胞系对鳞状蛋白的敏感性（图 2G））。我们还发现 HSP90α 的敲低导致 SCC15 中 EZH2 和 MYC 蛋白水平降低，表明 HSP90α 参与 EZH2 和 MYC 的稳定。这些结果表明鳞状蛋白诱导的 EZH2 和 MYC 降解可能在很大程度上取决于 HSP90α。
图2 HSP90α是squamocin的直接靶蛋白
3 EZH2直接结合MYC并促进HNSCC中MYC的蛋白稳定性和转录活性
由于 EZH2 可以在转录水平调节 MYC 表达或作为非 PRC2 伴侣在多种肿瘤中促进 MYC 稳定，这促使我们检查鳞状细胞素治疗是否也影响两种 HNSCC 细胞系中的 EZH2 水平。值得注意的是，squamocin以剂量依赖性方式降低了EZH2的稳态蛋白水平，而不影响EZH2的mRNA水平（图 2H），表明squamocin通过转录后机制调节EZH2。Squamocin 耗尽 EZH2 后，整体 H3K27me3（EZH2 沉积的标记）和 MYC 水平也以剂量依赖性方式下降（图 2H）），EZH2 和 MYC 耗尽均发生在细胞质和核部分（图 2I）。重要的是，通过 CCK8 和集落形成测定评估，EZH2 的过度表达在很大程度上挽救了由鳞状细胞素诱导的增殖抑制作用（图 2J，K）。总的来说，这些发现表明，squamocin 主要以 EZH2 依赖性方式抑制 HNSCC 中的肿瘤生长。
接下来，我们研究癌蛋白 EZH2 和 MYC 是否在 HNSCC 的进展中协同作用。20 对 HNSCC 样本的免疫组织化学 (IHC) 染色显示，肿瘤组织中 EZH2 和 MYC 的水平高于邻近正常组织（图 3A）。由于EZH2的异常表达显著影响MYC蛋白水平，同时引起MYC mRNA水平的微小变化（图 3B），我们假设 EZH2 通过蛋白质相互作用促进 MYC 积累。免疫荧光测定显示，EZH2 和 MYC 主要共定位于 SCC15 和 SCC25 细胞的细胞核中，EZH2 的上调和耗尽同样会破坏 MYC 的核积累（图 3C）。此外，相互免疫共沉淀（co-IP）证实了两种 HNSCC 细胞系中 EZH2 和 MYC 之间的相互作用（图 3D）。我们发现 EZH2 的 MYC 中心域 (CD) 和染色质域 Y 样蛋白结合区 (CDYL BR) 负责它们的直接相互作用（图 3E-G）。这些结果证实 MYC 是 EZH2 真正的相互作用伙伴。
接下来我们研究了 EZH2 对 MYC 蛋白质稳定性和转录活性的影响。值得注意的是，时程实验表明，EZH2 的强制表达将内源性 MYC 蛋白的半衰期从 53.7 分钟延长至 81.3 分钟，而 EZH2 的敲低加速了 MYC 蛋白周转，将其半衰期从 58.1 分钟缩短至 24.4 分钟和 22.3 分钟（图 3H）。此外，通过施用蛋白酶体抑制剂 MG132 可以有效挽救 EZH2 耗竭引起的 MYC 损失（图 3I），表明 EZH2 的消除会刺激 MYC 的蛋白酶体降解。MYC 降解中一个充分表征的事件涉及两个关键残基丝氨酸 62 (p-S62) 和苏氨酸 58 (p-T58) 的连续磷酸化，这分别导致 MYC 稳定和不稳定。一致地，异位表达的EZH2对p-S62水平的影响最小，但降低了p-T58水平，相反，EZH2的耗尽导致p-T58水平显著增加（图 3J）。此外，MYC 靶基因如TP53、BMI1、PCNA和CCND1在 EZH2 过表达的 SCC15 细胞中显著增加，而在 EZH2 耗尽的 SCC25 细胞中下调（图 3K），表明 EZH2 增强 MYC 的转录活性。
图3 EZH2 直接与 HNSCC 中的 MYC 相互作用
4 Squamocin 有效抑制 HNSCC 中 EZH2 甲基转移酶活性并促进 MYC 降解
由于squamocin导致H3K27me3水平降低（图 2H，I），我们假设它可能抑制EZH2的酶功能。我们用 10 µg mL -1鳞状蛋白或 25 µm (14 µg mL -1 ) EPZ-6438处理两种 HNSCC 细胞系，EPZ-6438 是美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的第一种 EZH2 酶抑制剂。值得注意的是，尽管EPZ-6438和squamocin在抑制H3K27me3水平方面表现出相当的效力，但只有squamocin显著抑制MYC蛋白积累（图 4A）。为了进一步研究 EZH2 的甲基转移酶活性，我们进行了转录组分析，以评估 H3K27me3 对鳞状蛋白的反应。SCC15和SCC25细胞中squamocin处理与DMSO对照的比较揭示了一组常见的差异表达基因（DEG），其错误发现率（FDR）<0.05，包括3256个上调基因和2770个下调基因（图 4B）。正如预期的那样，几个被 H3K27me3 转录抑制的典型 EZH2-PRC2 靶基因，如UNC5B、SMAD7和GPRC5C，在用鳞状蛋白处理后在 SCC25 细胞系中显著上调（图 4C）。一致地，ChIP-qPCR 测定证实，由于 SCC25 细胞中的鳞状细胞素处理， UNC5B启动子上的整体 H3K27me3 富集减少（图4D、E）。
鉴于squamocin对MYC降解的显著影响，我们研究了squamocin是否调节MYC的转录活性。我们的RNA-seq数据表明，在用squamocin处理后，SCC15和SCC25细胞中MYC失活基因的表达程序上调，而MYC激活基因下调（图 4F）。qRT-PCR证实了squamocin而非EPZ-6438对MYC激活靶标的抑制作用（图 4G）。总的来说，这些结果表明，squamocin 可有效消耗 HNSCC 细胞系中的 EZH2 组蛋白甲基转移酶及其非催化结合配偶体 MYC。我们还研究了squamocin是否可以降解其他EZH2的非催化结合伴侣，例如p300 和RelA。结果表明，在用squamocin处理的两个HNSCC细胞中，p300而非RelA (p65)的积累减少（图 4H）。此外，我们观察到两种 HNSCC 细胞系中EP300 （编码 p300）的 mRNA 水平显着下调，而RELA（编码 RelA）显着上调或不受影响（图 4I）。这些结果表明，squamocin 对 EZH2 其他非催化结合配偶体（包括 p300 和 RelA）的降解影响极小。
图4 Squamocin 可有效抑制 HNSCC 中的 EZH2 甲基转移酶活性并诱导 MYC 降解
5 Squamocin 通过促进内质网 (ER) 应激相关蛋白泛素化和降解来有效降解 EZH2 及其非 PRC2 伙伴 MYC
MYC 过度激活的肿瘤细胞在多种人类癌症中表现出增强的 UPR 激活。squamocin 不仅抑制线粒体呼吸复合物 I，导致活性氧 (ROS) 增加和 ATP 水平降低，而且还损害 HSP90α 和 ATP 的结合，两者协同促进 ER 应激和 UPR。正如预期的那样，基因本体（GO）分析显示，常见上调的DEG在“对ER应激的反应”和“对未折叠蛋白（UPR）的反应”中显著富集（图 5A）。我们发现squamocin处理增强了SCC15和SCC25细胞系中三种ER应激传感器XBP1s、ATF4和ATF6的积累，用特异性抑制剂阻断这些传感器中的任何一个都显著减弱了squamocin诱导的EZH2和MYC的降解（图 5B）。此外，常见上调的 DEG 在“凋亡过程”中显著富集（图 5A），支持由squamocin诱导的细胞凋亡表型（图 1D，E）。
泛素蛋白酶体系统（UPS）和自噬可以调节错误折叠蛋白的降解，从而维持内质网稳态。RNA-seq数据表明，常见上调的DEG在“泛素依赖性蛋白质分解代谢过程”和“泛素依赖性ERAD途径”中显著富集（图 5A），经GSEA验证（图 5C）。为了确定哪条途径参与了squamocin诱导的EZH2和MYC降解，我们首先进行了时程分析，证实squamocin显著缩短了内源性EZH2和MYC蛋白的半衰期（图 5D）。其次，EZH2和MYC蛋白水平的降低被蛋白酶体抑制剂MG132有效地挽救；然而，给予自噬抑制剂氯喹（CQ）并没有产生类似的结果（图 5E），这表明鳞状细胞素介导的EZH2和MYC降解是通过UPS途径发生的。第三，泛素化测定验证了 EZH2 和 MYC 蛋白在两个 HNSCC 细胞系中均被 squamocin 泛素化和降解（图 5F，G）。与通过 siRNA 删除 EZH2 类似（图 3J），我们还在 SCC15 和 SCC25 细胞中观察到经过鳞状细胞素处理后 MYC p-T58 显著增加（图 5H）。这些发现表明，squamocin 激活 ER 应激并促进 EZH2 和 MYC 泛素化，从而促进随后的蛋白酶体降解。
图5 Squamocin 激活内质网应激相关蛋白的泛素化和降解
6 Squamocin 通过 UBA6-UBE2Z-FBXW7 泛素级联介导 HNSCC 中 EZH2 和 MYC 的降解
为了破译squamocin介导的EZH2和MYC降解的具体分子机制，我们分析了RNA-seq数据中的全局UPS。值得注意的是，许多人类泛素酶基因被鳞片素上调（FDR < 0.05，图 6A、B）。目前，只有两种人类E1，即UBA1和UBA6，被确定为UPS的发起者。值得注意的是，我们发现 UBA6 而不是 UBA1 在两种 HNSCC 细胞系中共同上调（图 6A）。敲除UBA6消除了鳞状细胞素介导的EZH2和MYC的泛素化和降解（图 6C，D），表明鳞状细胞素通过UBA6而不是HNSCC中的UBA1激活UPS 。由于UBE2Z（UBA6特异性E2s）在两种squamocin处理的HNSCC细胞系中显著共同上调（图 6B），我们接下来研究UBE2Z是否可以介导EZH2和MYC的降解。结果表明，squamocin 未能降低 UBE2Z 敲低 HNSCC 细胞系中 EZH2 和 MYC 的水平（图 6E，F），表明 UBA6-UBE2Z 级联的增强是squamocin 诱导的 EZH2 和 MYC 蛋白降解的原因。使用特定的siRNA，我们观察到FBXW7敲低明显阻止了squamocin诱导的EZH2和MYC降解，而RING1敲低影响最小（图 6G，H），表明squamocin 主要以 FBXW7 依赖性方式介导 EZH2 和 MYC 的降解。Co-IP 测定证实了 FBXW7 与这两种 HNSCC 细胞系中的 EZH2 和 MYC 结合（图 6I）。此外，生存分析表明，高水平的 FBXW7 与 HNSCC 患者的良好预后相关（图 6J），并且 FBXW7 高表达和 MYC 低表达的患者比 FBXW7 低表达和 MYC 高表达的患者预后更好（图 6K）。总的来说，这些发现表明，在 HNSCC 中，squamocin 通过 UBA6 (E1) 激活 UPS，促进泛素充电至 UBE2Z (E2)，并增加 FBXW7 (E3) 的活性，以 HSP90α 依赖性方式降解 EZH2 和 MYC。
图6 Squamocin 增强 UBA6-UBE2Z-FBXW7 泛素级联介导的 EZH2 和 MYC 降解
7 Squamocin有效抑制多种体内肿瘤模型的肿瘤生长
为了研究squamocin是否可以通过体内靶向EZH2-MYC轴来抑制肿瘤生长，我们建立了稳定EZH2过表达的HNSCC裸鼠异种移植模型。携带EZH2过表达或对照SCC15肿瘤的小鼠每3天用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、EPZ-6438或squamocin进行腹膜内治疗，总共五次。与体外研究结果一致，EZH2 的过度表达导致肿瘤体积和重量显著增加，通过 EPZ-6438 或squamocin 治疗可有效消除这种增加（图 7A-C）。Squamocin和EPZ-6348的肿瘤生长抑制率（TIR）分别为84.06%和65.22%。异种移植物的 IHC 染色表明，EZH2 过度表达伴随着 Ki67、H3K27me3 和 MYC 水平的增加。与EPZ-6438治疗类似，squamocin明显降低了EZH2、Ki67和H3K27me3的水平，但只有用squamocin治疗的肿瘤表现出MYC的显著损失（图 7D）。总的来说，这些结果强调了squamocin相对于针对EZH2酶功能的抑制剂在删除MYC方面的潜在优势，表明squamocin不仅抑制EZH2的催化活性，而且还抑制其非经典活性。
随后，我们评估了鳞状细胞素在其他体内肿瘤模型中的作用。使用AGS和SW480异种移植模型评估squamocin的抗肿瘤功效，证明squamocin有效抑制GC中的肿瘤生长，TIR为56.49%，以及CRC，TIR为53.82%。相比之下，EPZ-6438在GC和CRC中的TIR分别为32.7%和27.43%（图 7E、F）。此外，皮下患者来源的异种移建立CRC小鼠模型以确定squamocin的体内抗癌活性。正如预期的那样，我们发现鳞状细胞素治疗组的肿瘤体积和重量与对照组相比显著减少（图 7G-I），并且没有相关的体重减轻由于治疗（图 7J）。在squamocin治疗组中检测到Ki67、EZH2、H3K27me3和MYC水平降低（图 7K）。重要的是，异种移植物的 IHC 染色表明，squamocin 明显增加了 HNSCC 的裸异种移植物和 CRC 的 PDX 异种移植物中的 UBA6-UBE2Z-FBXW7 级联水平（图 7L），支持体外研究结果。PDX 模型以高保真度准确再现人类肿瘤，并表现出与临床观察到的治疗反应一致的治疗反应
图7 Squamocin 可有效抑制体内多种肿瘤的生长
结论
通过将HSP90α确定为squamocin的直接靶点，我们揭示了一种新机制，通过该机制squamocin不仅抑制线粒体呼吸复合物I，导致ATP产生减少和ROS积累增加，而且还破坏HSP90α与ATP的结合。这些由鳞片蛋白引起的肿瘤细胞内在事件引发了 ER 应激和 UPR，导致 ERAD 介导的 EZH2 和 MYC 降解以及细胞凋亡。重要的是，我们的观察发现了一种由 UBA6、UBE2Z 和 FBXW7 组成的新型泛素化级联，可能调节泛胃肠道肿瘤中鳞状蛋白诱导的 EZH2/MYC 轴的降解
