衰老在肿瘤转移中的作用尚不确定。癌症和老龄化具有基因组不稳定性和慢性炎症等若干特征。与此同时，某些类型的癌症在较年轻的患者中被诊断为更有攻击性。鉴于老龄人口不断增加,以及世界卫生组织预测到2050年将有16%以上的人口超过65岁,需要进一步研究,以探讨老龄化对癌症转移和进展的影响。当衰老过程中,免疫系统进入一种称为"炎症-衰老"的系统性低等级慢性炎症状态。这种持续性炎症不仅导致组织变性和功能障碍,而且与肿瘤转移密切相关。
2024年12月30日，上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科苏文如团队在Nature communications（IF=14.7）在线发表题为“Aging-induced immune microenvironment remodeling fosters melanoma in male mice via γδ17-Neutrophil-CD8 axis”的研究论文。该文章发现衰老的雄性小鼠会通过γδ17-中性粒细胞-CD8轴介导免疫微环境重塑，加速衰老驱动的黑色素瘤转移。Senolytic—原花青素 C1逆转衰老衰介导的免疫微环境重塑，抑制肿瘤转移。
摘要
衰老与肿瘤转移增加和不良预后相关。然而，免疫系统衰老是如何促成这一过程的尚不清楚。单细胞RNA测序显示，在雄性小鼠中，衰老使肺免疫微环境向转移前微环境转变，其特征是表达il -17的γδT （γδ17）和中性粒细胞的比例增加。在机制上，免疫转运受体S1pr1的年龄依赖性下调驱动γδ17的扩增。与年轻小鼠相比，扩增的γδ17招募了CD62L表达水平较低、C-kit和CXCR4表达水平较高的促肿瘤中性粒细胞。这些中性粒细胞抑制老龄雄性小鼠CD8+ T细胞的干性和肿瘤杀伤功能。因此，抗体介导的γδT或中性粒细胞清除可减少老年动物的肿瘤转移灶，而给予senolytic剂原花青素C1可逆转观察到的衰老的免疫介导的促肿瘤作用。因此，我们揭示了γδ17-中性粒细胞- cd8轴促进衰老驱动的雄性小鼠肿瘤转移，并为治疗转移性肿瘤提供了潜在的见解。
1.衰老导致组织驻留免疫细胞发生显著变化
为了了解衰老在黑色素瘤发病机制中的作用，我们通过向年轻和老年C57BL/6J小鼠尾静脉注射B16F10细胞建立了肺转移瘤模型。与年轻小鼠相比，我们观察到在注射后3周，老年小鼠的肺转移灶数量增加了3倍（图1a）。由于黑色素瘤也发生在脉络膜中，我们通过视网膜下注射的方法在眼原位黑色素瘤模型中比较了老年和年轻小鼠之间的转移模式。如图1b所示，眼内肿瘤在年轻小鼠和老年小鼠中均形成。老龄小鼠肝脏微转移灶数量明显增多，提示老龄促进肝转移。推测上述现象可能与衰老改变免疫微环境有关。为了验证这一推测并进一步揭示潜在的机制，我们对四组小鼠的肺组织常驻免疫细胞进行了单细胞RNA-seq （scRNA-seq）分析，这四组小鼠包括年轻对照组（YC），老年对照组（AC），年轻模型组（YM）和老年模型组（AM）。模型组经尾静脉注射B16F10细胞建立上述肺转移瘤模型，对照组不接种肿瘤细胞。实验程序的图形展示示于图1c中，肺组织中的高度纯化免疫细胞被分选用于以下scRNA-seq。根据经典谱系标志物的表达，我们确定了5个主要的免疫细胞谱系（图1d），包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK）、中性粒细胞、单核细胞以及“巨噬细胞和树突状细胞”（mo ø dc）。
我们首先研究了衰老对YC和AC组的影响。衰老增加了中性粒细胞的比例，降低了B细胞和NK细胞的比例，对momo ø dc的影响较小（图1d）。为了确定与衰老相关的基因表达标签，我们进一步分析了YC和AC小鼠之间所有免疫细胞的差异表达基因（DEG）（图1e）。一些黑色素瘤转移相关基因如Cxcr2， Mmp9和Tgfbi也在AC小鼠中上调。AC小鼠中下调的基因包括naïve表型相关基因Ccr7，同时激活标志物Cd44表达水平较高（图1e），这可能表明衰老导致了表型极化的免疫细胞。炎症反应和血管生成途径的正向调节也被上调（图1f）。有趣的是，Il-17信号通路被确定为主要的白细胞介素通路之一。与AC小鼠中B细胞数量减少一致，下调的通路（图1g）包括淋巴细胞相关的通路，包括淋巴细胞分化、B细胞受体的信号传导、抗原处理和呈递，以及翻译相关的通路（核糖体大亚基组装、翻译起始）。衰老相关分泌表型（SASP）是衰老细胞产生的一系列生物活性分子，可促进肿瘤转移。我们的数据显示，随着年龄的增长，SASP基因的丰度增加（图1h），衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色，细胞衰老的经典标志，也在所有免疫细胞和中性粒细胞亚群中增加（图1i）。综上所述，我们建立了老年肺组织常驻免疫细胞的整体概况，并发现随着中性粒细胞的募集和活化，衰老导致了促炎症和促血管生成表型。
图1：研究设计和老年人肺部免疫微环境的scRNA-seq分析
2.衰老改变了mo ø dc和T细胞的功能和分化
我们进一步将MOMøDC重新聚集成巨噬细胞、单核细胞、1型常规树突状细胞（cDC1）、2型常规树突状细胞（cDC2）、浆细胞样树突状细胞（pDC）和富含免疫调节分子的成熟树突状细胞（mregDC）（图2a）。GO和通路富集分析表明，il - 17a相关通路在AC小鼠各亚群髓系细胞中均上调；血管生成相关通路在单核细胞和pDC中富集，细胞死亡和细胞衰老相关通路仅在树突状细胞中富集（图2b）。肿瘤浸润性T细胞在肿瘤转移中具有双重作用，如调节性T细胞（Treg）具有肿瘤促进作用和CD8+ T细胞具有肿瘤抑制作用。这促使我们对T细胞进行更详细的检查。我们将T细胞分为5种亚型（图2c）：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、自然杀伤T细胞（NKT）、γδT细胞和增殖T细胞。AC小鼠的CD4+ T细胞和增殖T细胞比例降低，CD8+ T细胞、γδT细胞和NKT细胞比例升高（图2c）。鉴于CD4+/CD8+ T细胞比值降低表明免疫衰老状态，我们通过流式细胞术分析进一步证实了这一观察结果（图2d）。对每个T细胞亚型的GO和通路分析显示，炎症相关通路在所有亚型中均上调，其中IL-17信号通路在γδT细胞中表达水平最高，炎症反应通路在NKT细胞中最突出，这意味着T细胞参与了衰老相关的炎症（图2e）。癌症中的通路和PD-1相关通路在大多数亚型中增强，而适应性免疫应答相关通路在增殖T细胞和CD8+ T细胞中下调，再次指出了衰老T细胞和癌症发展之间的潜在联系（图2e）。
接下来，我们使用SCENIC软件包对衰老的转录因子调控网络进行了预测，以确定复杂的转录调控网络是如何被衰老调控的。通过比较AC和YC小鼠所有细胞的相对调控活性，我们获得了前10个年龄依赖性上调和下调的转录因子。其中，与YC相比，IL-17的关键调节因子Rora在AC小鼠中显示出最高的转录活性增加（图2f）。另一个调节IL-17家族成员的转录因子Rorc也表现出较高的活性（图2f）。为了确定这些转录因子具有活性的T细胞亚型，我们在YC和AC小鼠的不同细胞亚型中进行了调节子特异性评分分析。在AC小鼠中，γδT细胞中Rora和Rorc调节因子的调节特异性评分高于其他亚群，其活性水平也远高于YC小鼠（图2g）。此外，基于scRNA-seq数据，在所有T细胞亚群中，IL-17A在γδT细胞中表达水平最高（图2h）。有报道称γδ17细胞具有促肿瘤作用，结合AC小鼠中γδ17数量增加的结果（图2c），我们推测衰老增强的肿瘤转移可能与γδ17细胞的扩增有关。然后，我们检测了衰老过程中γδT|中性粒细胞和中性粒细胞|CD8+ T细胞之间的前三个增强的配体-受体对（图2i）。这些结果提示γδ17、中性粒细胞和CD8+ T细胞可能参与了增龄导致的转移倾向增加。
图2:scRNA-seq揭示了老年髓系和T细胞亚群的变化
3.衰老促进γδ17的扩增和中性粒细胞的募集
在发现老龄小鼠中γδ17、中性粒细胞和CD8+ T细胞的变化之后，我们决定分析这些变化是否在年龄诱导的癌症转移中确实具有重要意义。我们首先评估了这些细胞在YC， YM， AC和AM小鼠中的比例。在肺中，γδT细胞的比例随着年龄的增长而显著增加，这种差异在荷瘤小鼠中进一步加剧，scRNA-seq表明，并进一步通过流式细胞术验证（图3a）。这与定量数据一致（图3b）。为了进一步研究导致肺内γδT增加的因素，我们分析了四组两两比较之间γδT的差异表达基因（图3c）。我们观察到CD69在老龄小鼠肺、淋巴结和脾脏的γδT细胞中有较高的表达（图3d）。相应地，S1pr1的表达在老龄小鼠肺组织的γδT细胞中下调（图3e），在淋巴结中上调，在脾脏中没有显示出统计学意义。有趣的是，中性粒细胞脱颗粒途径和中性粒细胞趋化途径在肿瘤负荷和衰老过程中增强，这可能表明γδT细胞和中性粒细胞之间的相互作用增强。scRNA-seq和流式细胞术的数据进一步支持在老年组中IL-17表达上调，并且肿瘤负荷进一步增加了老年小鼠的IL-17表达，而在年轻小鼠中未观察到明显差异（图3f， g）。这些结果表明，衰老可能通过S1pr1的差异表达增加γδ17细胞的比例，而肿瘤的存在似乎进一步增强了这种差异。
鉴于IL-17可以募集中性粒细胞，我们随后研究了中性粒细胞比率在衰老过程中的变化。单细胞和流式细胞术数据一致地表明，衰老会增加肺内驻留的中性粒细胞（图3h， i）。此外，流式细胞术分析证实，在这一背景下，肿瘤与衰老表现出协同效应（图3h， i）。总之，衰老增加了中性粒细胞的比例，这种增加在荷瘤老龄小鼠中尤其明显。
图3：衰老促进组织内γδ17和中性粒细胞的募集
4.γδ17使中性粒细胞在衰老过程中倾向于更倾向于肿瘤的表型
鉴于中性粒细胞扩增和IL-17通路增加的结果，我们研究了它们之间的联系，以探索衰老过程中免疫重塑的可能机制。我们检测了骨髓中性粒细胞中CXCR2的表达水平，发现在老年组中CXCR2的水平增加，无论肿瘤的存在，表明随着年龄的增长，从骨髓到外周组织的动员信号更强（图4a， b）。接下来，我们进一步研究了衰老对中性粒细胞功能的影响。通过对中性粒细胞的GSVA分析，我们发现荷瘤和衰老增加的主要通路在试剂盒相关通路中（图4c）。C-kit是与肿瘤侵袭相关的早发中性粒细胞的标志。我们观察到，无论是否有肿瘤，随着年龄的增长，其在肺部显著增加（图4d）。从GO和通路分析中，我们发现老年小鼠的中性粒细胞总体代谢活性降低，相对较高水平的Rho gtp酶相关信号和活性氧物质过程相关信号（图4e）。重要的是，在荷瘤小鼠中，我们发现衰老促进了中性粒细胞胞外诱捕网的形成（图4e）。通过流式细胞术，我们证实，衰老增加了CXCR4的表达，在模型小鼠中效果更明显，并降低了AC和AM肺组织中CD62L的表达（图4f）。这些发现可能部分解释了在衰老小鼠中观察到的中性粒细胞活性增加。
为了确定这些中性粒细胞表型变化是否与γδ17细胞相关，我们使用抗γδ tcr抗体44清除小鼠的γδT细胞。AM小鼠的肺转移灶数量显著减少，但在YM小鼠中没有（图4g，h）。尽管γδ t清除降低了YM和AM小鼠的总中性粒细胞比例和数量，但它只逆转了AM小鼠中未成熟中性粒细胞比例的增加，CXCR4表达升高，CD62L表达降低（图4i， j）。总之，衰老增加了γδ17细胞的数量。可以招募中性粒细胞并可能诱导其转变为促肿瘤表型。
图4:γδ17使中性粒细胞在衰老状态下呈现出更接近肿瘤的表型
5.中性粒细胞通过Arg2抑制CD8+ T细胞增殖
如图4e所示，与YM小鼠相比，AM小鼠表现出对t细胞增殖途径的负调控增加。由于CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用，我们进一步研究了中性粒细胞对CD8+ T细胞的影响。从这些对YC， YM， AC和AM小鼠中性粒细胞的GSVA分析中，我们观察到几个精氨酸相关的通路被衰老改变，如精氨酸酶活性，精氨酸代谢和分解代谢过程（图5a）。精氨酸酶催化精氨酸的分解，从而抑制活化T细胞的增殖。我们进一步的scRNA-seq分析显示，精氨酸酶2 （Arg2）在AM小鼠的中性粒细胞中表达水平高于YM小鼠（图5b）。流式细胞术还显示，在荷瘤小鼠的肺和骨髓中性粒细胞中，Arg2的表达较高（图5c， d）。为了进一步研究中性粒细胞来源的Arg2对CD8+ T细胞的影响，我们首先检测了血清和骨髓来源的中性粒细胞培养上清中Arg2的水平。我们发现血清和中性粒细胞培养液中Arg2的浓度在两个年龄组中都升高（图5e， f）。随后，我们设计了体外共培养实验。从YC小鼠脾脏分离出的CD8+ T细胞与YM和AM小鼠的骨髓中性粒细胞培养，加入或不加入BEC盐酸盐（BEC盐酸盐具有Arg2抑制剂的作用）（图5g）。我们发现来自AM小鼠的中性粒细胞显著抑制了CD8+ T细胞的增殖，并且这种抑制作用被额外的BEC盐酸盐逆转（图5h）。由于PD-1通常被肿瘤细胞用来逃避免疫检测，并且可以抑制T细胞增殖，我们还评估了CD8+ T细胞中PD-1的表达水平。CD8+ T细胞与AM小鼠中性粒细胞共培养后，PD-1+ CD8+ T细胞耗竭比例显著升高（图5i）。
图5：中性粒细胞通过Arg2抑制老年荷瘤小鼠CD8+ T细胞的增殖
6.老年雄性小鼠中性粒细胞抑制CD8+ T细胞干性
考虑到中性粒细胞在衰老微环境中的促肿瘤作用，我们使用ly6g特异性抗体来消耗中性粒细胞。中性粒细胞的减少导致AM小鼠的肺转移灶显著减少，而对YM小鼠没有明显影响（图6a， b）。我们聚焦于CD8+ T细胞，以剖析关于中性粒细胞在衰老过程中如何调节T细胞的详细机制。GSVA分析显示，老年CD8+ T细胞中的免疫抑制通路上调，同时增殖和细胞杀伤相关通路下调（图6c）。上述所有改变都指向CD8+ T细胞干性在衰老过程中的丧失。然后，我们研究了CD8+ T细胞干性的降低是否可归因于中性粒细胞。因此，我们继续采用中性粒细胞耗竭策略。在老年小鼠肿瘤部位的CD8+ T细胞内，TCF1（由Tcf7编码）和Ki67（增殖的生物标志物）的表达显著上调（图6d， e），提示干性状态增强。去除老年小鼠的中性粒细胞后，肿瘤浸润的CD8+ T细胞表现出较高的CD44-CD62L+ （naïve）、CD44+CD62L+（中央记忆）百分比，以及较低的CD44+CD62L-（效应记忆）表型百分比(图6f）。结合Ki67结果，中性粒细胞对CD8+ T细胞的作用可能与年龄有关。此外，中性粒细胞清除降低了AM小鼠肺中Tim3+PD-1+CD8+ T细胞的比例（终末耗竭），而在YM小鼠中则没有这种作用(图6g）。CD8+ T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用表现为分泌IFN-γ、TNF和GZMB。我们发现，中性粒细胞清除后，在老年小鼠的肿瘤微环境中，IFN-γ+TNF+CD8+ T细胞和GZMB+CD107a+CD8+ T细胞的百分比（CD107a是活跃脱颗粒的标志）均增加（图6h，i）。所有这些结果强调，中性粒细胞清除可以挽救衰老小鼠CD8+ T细胞的干性。
干细胞样CD8+ T细胞，被注释为PD1+TCF1+Tim3-CD8+ T细胞，是最近发现的负责免疫检查点阻断的细胞群。在我们的研究中，我们进一步将CD8+ T细胞聚集，并观察到老年小鼠中干细胞样CD8+ T细胞比例降低（图6j）。这种减少被中性粒细胞减少逆转（图6k）。
图6：老年雄性小鼠中性粒细胞抑制CD8+ T细胞的干性
7.原花青素C1可逆转衰老的促肿瘤作用
PCC1是新近发现的一种植物化学senolytic剂，据报道可有效清除由各种应激源诱导的衰老细胞。鉴于以上结果表明衰老发挥了关键作用，因此我们试图探索这种senolytic剂是否可以改善与年龄相关的免疫抑制，进而抑制肿瘤转移。我们给AM小鼠注射PCC1，给对照组注射等量的溶剂。令人鼓舞的是，PCC1的应用显著减少了肺肿瘤转移灶的数量（图7a， b）。为了进一步了解潜在的机制，我们评估了参与γδ17-中性粒细胞- cd8轴的关键细胞的比例。PCC1给药后，在肿瘤微环境和外周淋巴器官中均观察到γδT和γδ17比值的显著降低（图7c、d）。肿瘤局部部位的中性粒细胞比例及其CXCR4表达呈现类似的降低趋势（图7e、f）， CD62L呈现增加趋势（图7g）。SA-β-gal和P53是细胞衰老的经典标志物。我们发现PCC1降低了γδT细胞和中性粒细胞中SA-β-gal和P53的表达（图7h， i）。这些改变可能部分解释了PCC1对γδ17-中性粒细胞- cd8轴的抑制机制，但由于PCC1的研究仍处于早期阶段，需要进一步的研究。综上所述，我们的研究结果表明，PCC1可以对抗衰老诱导的γδ17-中性粒细胞- cd8轴的变化，从而有效地减少肿瘤转移。
图7：原花青素C1可以逆转衰老的促肿瘤作用
结论
PCC1是一种来源于葡萄籽提取物的新型抗衰老剂，据报道可诱导衰老细胞的线粒体功能障碍，并选择性地触发这些细胞的凋亡，从而促进肿瘤消退和延长寿命。在我们的研究中，PCC1的应用通过抑制γδ17-中性粒细胞- cd8轴显著减少肺转移灶的数量。其机制可能与清除衰老的γδT细胞和中性粒细胞，以及降低中性粒细胞PD-L1表达有关。这种新型溶瘤剂对治疗老年小鼠肿瘤具有良好的应用前景。然而，对PCC1的研究仍然有限，未来还需要更多的实验来全面探索其能力和机制。
综上所述，我们的研究代表了衰老在促进黑色素瘤转移中的作用的调查。我们采用传统的肺转移模型和眼内肿瘤模型来全面探索衰老对转移的影响。利用尖端的scRNA-seq技术，我们深入研究了衰老引起的肺部免疫微环境的变化及其对肿瘤转移的影响。我们的研究结果揭示了老年免疫环境与肿瘤转移之间的复杂关系，表明衰老通过降低γδ17-中性粒细胞- cd8轴的抗肿瘤活性促进肿瘤转移。在小鼠中，PCC1可以部分逆转这些衰老引起的疾病。然而，正如之前的研究所述，由于雄性小鼠对肿瘤的易感性，我们只使用了雄性小鼠。男性和女性之间存在明显的免疫差异。因此，有必要进一步研究衰老诱导的免疫差异及其对雌性动物肿瘤转移的影响。
Duan R, Jiang L, Wang T, Li Z, Yu X, Gao Y, Jia R, Fan X, Su W. Aging-induced immune microenvironment remodeling fosters melanoma in male mice via γδ17-Neutrophil-CD8 axis. Nat Commun. 2024 Dec 30;15(1):10860. doi: 10.1038/s41467-024-55164-3.
