APSB | 隐丹参酮通过 JNK1/2/Iron/PARP/calcium途径诱导癌细胞非酶nqo1依赖性坏死

文摘   2025-01-15 18:30   江苏  
隐丹参酮 (CTS) 是丹参中第二丰富的丹参酮,具有多种药理作用,包括抗癌、抗炎、神经保护和抗纤维化。 CTS对肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和白血病等癌症的抗癌作用已在文献中得到充分证实,但其潜在机制和分子靶点仍不清楚。
2024年12月9日,澳门大学中医研究所陈修平团队在Acta Pharmaceutica Sinica B(IF=14.8)上发表了题为“A small molecule cryptotanshinone induces non-enzymatic NQO1-dependent necrosis in cancer cells through the JNK1/2/Iron/PARP/calcium pathway”的文章,隐丹参酮(CTS)可诱导NQO1依赖性坏死,选择性地杀死NQO1阳性癌细胞。CTS直接与NQO1结合,但不激活其催化活性。此外,CTS能够激活JNK1/2和PARP、铁和Ca2+的积累,以及导致ATP和NAD+耗竭,抑制NQO1异种移植模型中的肿瘤生长,这被NQO1抑制剂和NQO1敲除逆转。总之,CTS通过JNK1/2/iron/PARP/NAD/Ca2+信号通路诱导NQO1依赖性坏死,研究证明了NQO1在诱导细胞死亡中的非酶功能,并为NQO1靶向抗癌药物的设计和开发提供了新的途径。
摘要
人NAD(P)H:醌氧化还原酶1 (NQO1)是一种黄素酶,在多种实体肿瘤中高表达,使其成为抗肿瘤药物的一个有吸引力的靶点。以NQO1为靶点的生物活性药物,如β-lapachone (β-lap),目前正处于治疗癌症的临床试验阶段。β-Lap通过催化激活NQO1诱导活性氧簇(ROS)选择性杀伤NQO1阳性(NQO1+)癌细胞。在这项研究中,我们证明了一种天然的化合物隐丹参酮(CTS)可以诱导NQO1依赖性坏死而不影响NQO1的活性。CTS通过诱导NQO1依赖性坏死选择性杀伤NQO1+癌细胞。有趣的是,CTS直接结合NQO1,但不激活其催化活性。此外,CTS能够激活JNK1/2和PARP,积累铁和Ca2+,消耗ATP和NAD+。此外,CTS选择性地抑制NQO1+裸鼠移植瘤的生长,NQO1抑制剂和NQO1 shRNA可逆转这种抑制作用。综上所述,CTS通过JNK1/2/iron/PARP/NAD+/Ca2+信号通路诱导nqo1依赖性细胞坏死。本研究揭示了NQO1诱导细胞死亡的非酶功能,为NQO1靶向抗癌药物的设计和开发提供了新的途径。
1 . CTS 诱导 NSCLC 中的非凋亡性坏死
CTS 以浓度依赖性方式显着降低 NQO1 +肺癌细胞系(A549 和 H460)的细胞活力。此外,CTS 导致 ATP 快速减少、LDH 释放和 PI 渗透到细胞中(图 1 A 和 B)。CTS 诱导两种细胞系中 7-AAD(+)/Annexin V(-) 细胞显着增加(图 1 C)。此外,CTS对caspases 3/7/8的裂解和caspases 3/7的活性(图1D)没有影响。相反,化疗药物顺铂会诱导 caspase 裂解并增加 caspase 活性(图 1D)。泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD-FMK 未能逆转 CTS 诱导的细胞死亡(图 1 E)。这些结果表明 CTS 触发非凋亡性坏死细胞死亡。
图1 CTS 诱导 NSCLC 细胞非凋亡性细胞死亡
2. cts诱导的坏死是nqo1依赖性的
DIC是NQO1的有效竞争性抑制剂,可显著逆转cts诱导的细胞死亡(图2A和B)。NQO1的瞬时沉默和稳定敲低显示出相似的效果(图2C-E)。CTS对NQO1阴性(NQO1 -)细胞株H596和HEK293T无细胞毒性作用。相比之下,NQO1转染显著增敏CTS的作用(图2F)。这表明CTS选择性地杀死NQO1+癌细胞。
图2 CTS诱导nqo1依赖的非凋亡细胞死亡
3. NQO1的非酶功能有助于cts诱导的坏死
在CETSA测定中,CTS显著增加了A549和H460细胞中的NQO1稳定性,表明CTS与NQO1的直接结合(图3A)。CTS和NQO1之间的相互作用通过荧光猝灭实验证实(图3B)。虽然CTS上调了NQO1的mRNA水平,但并不影响NQO1的易位和蛋白表达(图3C)。特别是,在使用A549和H460细胞裂解物(图3D)和重组NQO1蛋白进行的酶活性测定中,CTS对NQO1催化活性无影响。相反,NBD β-lap显著增加了NQO1活性,而DIC抑制了NQO1活性(图3D)。为了进一步了解CTS与NQO1相互作用的分子决定因素,我们利用NQO1与抑制剂DIC复合物的x线结构(PDB 5FUQ,未发表结果)作为参考模型进行了分子对接,并将其与其他已报道的NQO1结构进行了比较。NOQ1与CTS的对接结构显示,CTS位于Tyr129和Phe233之间,其方向与NQO1与DIC复合体(PDB 5FUQ)的x射线结构中报道的方向相似(图3E)。然后,我们进一步比较了底物与CTS的对接结构,包括β-lap、化疗药物E09 (PDB 1GG5)37和MAM(我们课题组之前报道的对接结构)(图3F)。结果表明,与其他底物/抑制剂相比,CTS在NQO1中定位了不同的结合位点,这些结合位点通过与FAD平行定位的异氧嗪环与NQO1相互作用。此外,我们的对接结果表明,CTS的结合模式也与观察到的DIC非常相似,在Phe107、Tyr129、Gly150和His195处与酶形成氢键相互作用(图3G)。因此,这些结果表明,CTS不是在NQO1的典型催化位点上结合,而是在NQO1附近结合。这可能是CTS不影响NQO1活性的主要原因。
图3 CTS靶向NQO1的非酶功能
4. JNK 1/2激活参与了cts诱导的细胞坏死
在NQO1过表达的MDA-MB-231细胞38和胚胎成纤维细胞中,JNK1/2的活化积极促进了β-lap诱导的细胞死亡。CTS诱导持续的JNK1/2磷酸化(图4A)。此外,JNK1/2抑制剂SP600125预处理或JNK1/2敲低可以显著逆转CTS诱导的ATP减少(图4B和C)。此外,DIC或NQO1敲低显著降低了JNK1/2的磷酸化(图4D和E)。因此,这些结果表明,JNK1/2在CTS诱导的NQO1依赖性坏死中起着至关重要的作用。
图4 CTS触发持续的JNK1/2激活
5. nqo1介导的铁释放参与了cts诱导的坏死
CTS诱导calcein-AM荧光显著淬灭,表明细胞内铁水平增加(图5A和B)。CTS诱导的细胞铁增加进一步通过ICP-MS检测(图5C)。溶酶追踪器定位和钙黄绿素- am染色的结合表明,CTS处理后溶酶体中的铁增加(图5D)。此外,铁螯合剂DFO和DFP显著逆转了CTS的细胞毒性(图5E和F),而铁供体FeSO4和柠檬酸铁铵增强了CTS的细胞毒性(图5G)。然而,Fer-1不能逆转CTS诱导的坏死,并且CTS对GPX4的表达无影响(图S2D和S2H)。相反,DIC显著抑制cts诱导的铁增加(图5H),并且在NQO1沉默中观察到类似的逆转作用(图5I)。
图5 铁参与cts诱导的细胞死亡
6. NAD+的缺失促进了cts诱导的坏死
PARP活化和NAD+耗竭介导nqo1诱导的细胞死亡,以响应β- lap14,16。虽然CTS对NQO1的激活没有影响,但它增加了PAR,减少了总NAD+和NADH(图6A和B)。此外,PARP抑制剂奥拉帕利和PARP沉默均可显著逆转CTS诱导的PAR积累、NAD+消耗和细胞死亡(图6C-E,图8D)。补充NAD+有效地逆转了cts诱导的细胞死亡(图6F)。同时,NQO1 shRNA和DIC均显著逆转了cts诱导的PAR积累和NAD+消耗(图6G和H)。因此,cts诱导的坏死涉及NQO1介导的PARP激活和NAD+消耗。
图6 NAD+的缺失促进了cts诱导的细胞死亡
7. 胞浆和线粒体Ca2+超载触发cts诱导的坏死
Ca2+在介导β-lap诱导的细胞死亡中是PARP-1激活和DNA修复的上游调节剂。CTS以时间依赖性方式增加细胞质Ca2+水平(图7A)。Ca2+指示质粒显示类似结果(图7B)。线粒体Ca2+水平在CTS处理后也显著增加(图7C和D)。细胞内Ca2+螯合剂BAPTA显著逆转了CTS诱导的细胞死亡,而细胞外Ca2+螯合剂EGTA则不能(图7E和F)。Ca2+通道抑制剂2-APB显著逆转了CTS触发的细胞质和线粒体Ca2+水平和细胞死亡(图7G)。此外,DIC显著逆转cts触发的胞质和线粒体Ca2+水平(图7H和I)。因此,胞质和线粒体Ca2+是cts诱导的细胞死亡的重要介质。
图7 胞浆和线粒体Ca2+超载触发cts诱导的坏死
8. CTS诱导NQO1/JNK1/2/Iron/PARP/Ca2+依赖的细胞坏死
SP600125显著降低了cts诱导的铁增加和PAR激活(图8A和D)。虽然DFO和DFP对cts诱导的JNK1/2激活没有影响(图8B),但它们显著防止了PAR的过度消耗(图8C)。奥拉帕利或NAD+预处理显著逆转了细胞质和线粒体Ca2+积累(图8E和F)。与DIC和SP600125不同,奥拉帕利未能抑制JNK1/2激活(图8D)。这些观察结果表明,NQO1在CTS反应中上游调控JNK1/2激活、铁释放、NAD+消耗和Ca2+积累。
图8 CTS诱导NQO1/JNK/铁/PARP/钙依赖性坏死
9. CTS抑制nqo1依赖性肿瘤生长
CTS显著抑制H460裸鼠移植瘤的体积和重量。然而,DIC共管理消除了这一效应(图9A-C)。CTS对H460/shNQO1异种移植裸鼠模型无抗癌作用(图9D-F)。此外,CTS显著增加了肿瘤组织中的铁含量,这一作用被DIC联合给药和NQO1沉默逆转(图9G和H)。在CTS处理的肿瘤组织中观察到PAR和JNK1/2的激活,这一作用也被DIC联合给药抑制(图9I)。
图9 CTS可抑制裸鼠移植瘤的生长
结论
综上所述,CTS诱导了nqo1依赖的非凋亡性坏死,这是通过JNK1/2和PARP的激活,铁和Ca2+的积累来介导的。与NBDs相比,CTS不激活NQO1的酶活性。本研究揭示了CTS的潜在分子靶点,并提出了一种基于NQO1的抗肿瘤药物开发新策略,即利用NQO1的非酶功能。
隐丹参酮调节NQO1的非酶功能,并通过调节JNK1/2/铁/PARP/钙通路诱导NQO1+癌细胞中NQO1依赖性坏死。

天然产物靶点发现
天然产物靶点鉴定及文献解析交流,专注抗衰老相关天然产物
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