天然产物已被证明是阐明核糖体催化蛋白质生物合成的宝贵工具。翻译抑制剂已成为治疗细菌感染的有效疗法。当前的大流行凸显了对抗传染病的特定药物的需求。这种需求不仅限于病毒或细菌感染的治疗，还扩展到寄生虫病。
2025年1月10日，日本理研可持续资源科学中心Minoru Yoshida在Nat Commun在线发表题为“Girolline is a sequence context-selective modulator of eIF5A activity”的文章。揭示海洋天然产物girrolline是翻译因子eIF5A的序列选择性调节剂。girrolline干扰核糖体- eif5a相互作用，并在翻译进展受阻的地方诱导核糖体停滞，包括在aaa编码的赖氨酸上。
摘要
天然产物作为蛋白质生物合成的探针已经有很长的历史了，其中许多化合物被用于治疗。海洋天然产物girrolline被描述为蛋白质合成的抑制剂。然而，它的确切作用机制仍不清楚。我们在这里提供的数据表明girrolline是翻译因子eIF5A的序列选择性调节剂。girrolline干扰核糖体- eif5a相互作用，并在翻译进展受阻的地方诱导核糖体停滞，包括在aaa编码的赖氨酸上。我们的数据进一步表明，eIF5A在核糖体相关的质量控制和维持翻译进展的效率中起着生理作用。girrolline帮助我们加深了对生理条件下蛋白质生成和质量控制之间相互作用的理解，并提供了一种有效的化学工具来选择性地调节基因表达。
1.Giro 诱导的核糖体停滞
Girolline 1（Giro，也称为吉罗达唑，图 1a）首先从新喀里多尼亚海洋海绵Cymbastela cantharella（最初称为 Pseudaxinyssa cantharella Lévi）中分离出来，被描述为一种抗肿瘤剂以及抗疟疾活性。天然 Giro 的樟脑磺酸盐的 X 射线分析确定其绝对构型为 ( 2S,3S )。从同一块海绵中寻找微量代谢物使得获得额外数量的 Giro 用于生物学和作用方式研究成为可能。首先，我们着手表征 Giro 对哺乳动物细胞蛋白质合成的抑制活性。通过用O-炔丙基-嘌呤霉素（OP-puro）（图 1b ）对新合成的蛋白质进行代谢标记，O-炔丙基-嘌呤霉素是一种氨酰基-tRNA 模拟物，带有点击化学兼容的炔烃，可以与荧光染料缀合，我们确实观察到Giro 以剂量依赖性方式合成蛋白质。当通过蔗糖密度梯度离心观察核糖体群体的体外分布时[32 P]-标记的兔网织红细胞裂解物中的兔β-珠蛋白mRNA（图 1c），我们观察到早期多核糖体部分的增加。为了获得核糖体沿 ORF 遍历的全局视图，我们在 Giro 处理的 HEK293T 细胞上进行了核糖体（或单体）分析，这是一种基于深度测序的方法，用于分析 RNase 消化产生的核糖体足迹 。鉴于该化合物可能导致核糖体停滞，我们还采用了二体分析，对由前导核糖体缓慢伸长引起的两个紧密相邻核糖体保护的 mRNA 片段进行测序。ORF 5′端的单体和二体足迹均增加（图 1d），而二体群体中终止密码子周围的群体减少（图 1e）。这表明朝向 5' 末端的停滞增加，到达终止密码子的核糖体更少。我们注意到没有终止密码子通读的迹象（图 1e），这与 Giro 干扰翻译终止的早期报道相矛盾。更定量地，我们计算了足迹读数的极性分数，该值指示平均读数分布是否向 5' 端（负）或 3' 端（正）移动。正如预期的那样，我们在单体和二体分析中看到极性得分向 5' 端移动（图 1f、g）。这些数据表明，Giro 并没有完全阻断翻译活性，尽管观察到的蛋白质输出减少可能源于核糖体停滞的增加。
图 1：Giro 阻止核糖体的延长
2.序列选择性停顿
除了 Giro 对延伸的整体影响之外，我们还研究了核糖体停滞是否发生在特定序列元件上。因此，我们重点关注二体分析数据，并分析了核糖体 A、P 和 E 位点中单个氨基酸的过度表达（图 2a）。对二体富集或耗尽的氨基酸的分析进一步缩小了 Giro 介导的核糖体暂停的序列范围。1 和 10 µM Giro 均导致类似的序列富集：E、P 和 A 位点上的 Lys/Pro-Pro-Pro 和 Lys/Pro-Phe-Pro（图 2b）。然后我们考虑了同时占据 E 和 P 位点或 P 和 A 位点的二肽基序。含有二氨基酸对 Lys-Pro 和 Lys-Phe 的 E 和 P 位点中的高二体占据率进一步强调了这些序列对于 Giro 活性的重要性（图 2c）。以类似的方式，当考虑 Giro 处理下的 P 和 A 位点占据（包括 Pro-Pro）时，我们观察到包含 P 位点 Pro 的二氨基酸基序显著增加。COX6C ORF 内的单个 Lys-Pro 位点上的二体形成例证了 Giro 的上下文特异性（图 2d）。沿着 COX6C mRNA 绘制的单体数据也显示核糖体密度向 3' 端减少。鉴于Lys在E-site中的富集，我们想知道Giro在诱导核糖体停滞时是否会偏爱两个Lys密码子中的一个（AAA或AAG）。有趣的是，我们发现对于二体的形成，e -位点AAA比AAG的增加更明显（图2e）。E和p位点的二体被双密码子对占据，如AAA-CCU （Lys-Pro）、AAA-UUU （Lys-Phe）和AAA-CCG (Lys-Pro)，进一步突出了这一点（图2f）。
图 2：序列选择性停顿
3.eIF5A的位移
为了确定Giro结合是否影响eIF5A和核糖体之间的相互作用，我们使用flag标记的eIF5A进行下拉实验。蛋白质印迹法（Western blot）显示，标记的野生型eIF5A确实降低了核糖体，而eIF5A的碱基缺陷型Lys50-to-Ala （K50A）突变体似乎与核糖体没有相互作用（图3a）。由于大多数过表达的eIF5A被报道为非hypusinated，因此我们将DHS和DOHH与标记的eIF5A一起共表达，DHS和DOHH负责生成去羟化丝柄素，然后在Lys 5026,27上生成丝柄素。Giro能够干扰eIF5A与核糖体的结合（图3a）。它进一步以剂量依赖性方式阻断结合（图3b）。这表明Giro对eIF5A结合的影响不是由于一般的翻译抑制。此外，我们进行了体内多体分析，也观察到多体群体的增加，虽然80S核糖体出现耗用，而40S和60S群体也增加。80S核糖体的耗损与Giro减缓翻译延伸一致，这增加了每个mRNA的核糖体数量。值得注意的是，当我们分离体内多体谱，并通过蛋白质印迹法测量eIF5A含量和核糖体分布时，我们发现增加的多体部分并不包含很多eIF5A（图3c）。
我们在单个基因水平（图3d-f）和所有显著暂停位点（图3e）上查询了Giro处理是否诱导了与eIF5A缺失（eIF5A- kd）引起的暂停相同的附近核糖体暂停（图3d-f）。当我们比较Giro处理的细胞和rnai敲除eIF5A的细胞之间的二体足迹分布时，我们发现在许多转录本（如ATP5B、COX7A2和NDUFC1）中，Giro应用在与eIF5A敲除完全相同的位置产生了核糖体停滞（图3d）。宏基因分析证实了这一发现（图3e）。针对10µM Giro处理下检测到的显著暂停位点，我们在Giro诱导的暂停位点的上游和下游绘制了eIF5A敲除30个核苷酸引起的暂停位点。Giro处理和eIF5A敲除引起的停顿位置几乎相同，但略有差异。eIF5A缺失显示在主要暂停位点的3 '端有许多较小的峰。在其他一些情况下，Giro引起的失速位点与eif5a敲低引起的失速位点不同（图3f）。
图3:Giro干扰核糖体- eif5a相互作用
4.AAA-selective stalling on reporter transcripts by Giro
该报告从一个转录本产生三个独立的多肽：EGFP作为内部对照、连接子和RFP作为实验读数（图4a）。如果转换在链接器上停止，则产生的RFP会更少。细胞分选前48 h转染载体，并用1µM Giro处理细胞16 h。我们使用空连接器作为对照，正如预期的那样，没有看到Giro对EGFP或RFP表达的任何影响（图4b）。然后，我们继续使用连接子序列，该连接子序列包含分别由（AAA）20或（AAG）20编码的连续20个赖氨酸（图4c， d）。正如之前报道的46，与空连接子控制相比，连续的20个AAA密码子诱导了翻译停滞，并略微减少了RFP输出。然而，Giro处理进一步显著降低了RFP产量（图4c）。在许多情况下，RFP水平降低但未完全耗尽，这在FACS图谱中可见，在RFP阴性细胞和RFP高表达细胞之间填补了“谷值”（箭头）。Giro仅在（AAA）20-连接子之前影响RFP的表达，而在包含20个连续aag -密码子的连接子上没有明显的影响（图4d）。这证实了我们的猜测，Giro需要翻译速度减慢才能发挥作用，而20个aaa编码的赖氨酸似乎比12个更慢。这些数据表明，Giro是一种依赖于序列上下文的翻译调节因子，偏向于核糖体在aaa编码的Lys上停滞。
图4:FACS报告基因上的序列选择性失速
然后，我们评估了eIF5A的参与，在rnai降低eIF5A水平的细胞中测试我们的FACS载体。在转染非靶向siRNA的细胞上，Giro显示出与未转染细胞中观察到的相同的RFP表达减少（图5a）。即使在没有Giro的情况下，eIF5A敲低细胞在含有（AAA）20-连接子的报告基因上显示出RFP生成减少（图5b）。经1µM Giro处理后，eIF5A敲除细胞的FACS特征与eIF5A正常水平的细胞几乎无法区分（图4c）。用Giro处理eIF5A敲低的细胞进一步降低了RFP的表达，可能是通过阻止残留的eIF5A与核糖体相互作用来实现（图5b）。eIF5A敲除只影响（AAA）20连接子的翻译；使用（AAG）20构建，eIF5A敲除不会导致RFP输出的可检测变化（图5c， d）。这些数据表明Giro与eIF5A竞争与核糖体结合。
图5:eIF5A对于AAA的正常翻译是必需的
5.RQC激活导致翻译提前终止
这促使我们研究Giro对RQC诱导的影响。我们修改了我们的FACS报告（图4a），以监测翻译提前终止和核糖体停滞（图6a）。我们删除了n端P2A位点，并在连接子的末端添加终止密码子。该构建体现在产生了带有c末端尾部序列的EGFP，由20个aaa密码子或20个GAA密码子组成。如果翻译顺利进行，我们预计将看到约48kda的全长带。通过针对EGFP的Western blotting检测，延迟和提前终止会产生缩短的蛋白。正如预期的那样，对照组细胞出现了一定程度的细胞停滞，添加Giro后情况更糟（图6b），表现为小于48 kDa的可检测蛋白增加。eIF5A敲低本身导致这些缩短蛋白的增加，类似于1µM Giro处理（图6b）。这进一步证实了eIF5A有助于poly-A延伸的翻译。
当RQC触发因子ASCC3或ZNF598被敲低时，Giro失去作用，翻译到全长（图6b）。在poly-A序列上停滞的翻译复合体应该仍然具有翻译能力，如果RQC不参与，则它们自己可以继续到阅读框的末端。当下游RQC因子Ltn1和NEMF被耗尽时，更多的停滞蛋白积累，这可能是因为这些因子的耗尽减缓了停滞的新生肽的清除（图6b）。重要的是，提前终止的肽只在（AAA）20结构上观察到，而（GAA）20或（AAG）20的翻译完全不受阻碍，无论Giro处理或RQC因子敲低（图6c）。
图6:Giro诱导RQC
结论
我们提出了一种eIF5A活性的序列选择性调节剂，它阻止其靶蛋白和大核糖体亚基之间的相互作用，并诱导核糖体停滞，包括在Pro-containing序列和aaa编码的Lys上。我们证明，eIF5A确保快速翻译，并通过核糖体相关的质量控制途径在防止新生肽的过早降解中发挥作用。我们的研究结果表明，Giro有潜力作为一种化学探针来了解eIF5A在各种生理环境中的作用，并可能为开发进一步的序列选择性翻译调节剂提供基础。
我们的数据支持以下模型。对于翻译减慢的序列（包括带正电荷的氨基酸延伸、解码不良和肽基转移缓慢），需要eIF5A来维持翻译延长，以防止缓慢的核糖体出现停滞。缓慢的翻译为Giro提供了在核糖体e位点附近结合的机会。当脱酰基tRNA释放后，缓慢的解码和肽基转移使e -位点空的时间比平时更长时，就可能发生这种情况。Giro结合阻止eIF5A协助下一轮肽基转移，从而将缓慢转变为停滞。
a, 对于翻译减慢的序列，包括但不限于poly-Pro，需要eIF5A来加快翻译延伸。b,慢翻译使Giro能够与核糖体结合，阻止eIF5A协助肽基转移，从而将核糖体慢化为核糖体停滞，并随后与后续核糖体碰撞。这提前激活了核糖体相关质量控制途径（RQC）， RQC将核糖体亚基分离并开始破坏新生的肽。
Schneider-Poetsch T, Dang Y, Iwasaki W, Arata M, Shichino Y, Al Mourabit A, Moriou C, Romo D, Liu JO, Ito T, Iwasaki S, Yoshida M. Girolline is a sequence context-selective modulator of eIF5A activity. Nat Commun. 2025 Jan 10;16(1):223. doi: 10.1038/s41467-024-54838-2.
