棕榈酸是一种十六碳的饱和脂肪酸，也是人体中最常见的饱和脂肪酸。棕榈酸既可通过饮食摄取，也可在体内从头合。在健康人体中，棕榈酸的吸收与消耗处在稳态之中。在非酒精性脂肪肝炎（NASH）病人中，棕榈酸转运蛋白表达量上高，增加了棕榈酸细胞摄入量。棕榈酸具有细胞毒性，可诱导脂质堆积和ROS升高，进而导致细胞凋亡和炎症，导致NASH向终末期肝病发展。
2025年1月6日，中国科学院上海药物所罗成教授联合天津医科大学朱宪彝纪念医院内分泌研究所谢向阳教授团队在Nat Commun上在线发表题为“Inhibited peroxidase activity of peroxiredoxin 1 by palmitic acid exacerbates nonalcoholic steatohepatitis in male mice”的文章。发现并确证饱和脂肪酸棕榈酸（palmitic acid, PA）通过上调肝脏活性氧水平，加重NASH的新靶标为过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）。经体外的分子结合、酶活性确证以及细胞水平的酶活性、活性氧检测实验研究发现，棕榈酸是过氧化物还原酶1的酶活性抑制剂。以上结果提示增强PRDX1的过氧化物酶活性是缓解非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的一种潜在方法。迷迭香酸（RA）是PRDX1的有效激动剂。复杂的晶体结构揭示了RA与PRDX1结合并稳定其过氧化物半胱氨酸。RA通过特异性激活PRDX1的过氧化物酶活性缓解NASH。
摘要
活性氧通过氧化大分子加重非酒精性脂肪性肝炎（NASH）；然而，它们如何促进NASH仍然知之甚少。在本研究中，我们发现全肝过氧化物还原酶（PRDX）的过氧化物酶活性在NASH中显著降低，棕榈酸（PA）与PRDX1结合并抑制其过氧化物酶活性。通过三种遗传模型，我们证明了PRDX1在雄性小鼠肝脏中对NASH具有保护作用。机制上，PRDX1通过清除过氧化氢，减轻蛋白酪氨酸磷酸酶的氧化和脂质过氧化，抑制STAT信号通路，保护线粒体功能。我们进一步确定迷迭香酸（RA）是PRDX1的有效激动剂。复杂的晶体结构揭示了RA与PRDX1结合并稳定其过氧化物半胱氨酸。RA通过特异性激活PRDX1的过氧化物酶活性缓解NASH。因此，除了揭示PA促进氧化应激和NASH的分子机制外，我们的研究表明，提高PRDX1的过氧化物酶活性是治疗NASH的一种有前景的干预措施。
1.NASH 中全肝 PRDX 过氧化物酶活性降低
正如NADPH消耗速率降低所表明的那样，HFD显著降低了肝脏中PRDX过氧化物酶的总体活性（图1a）。HFD没有改变大多数PRDX家族酶的蛋白水平，但显著增加肝脏中PRDX4的蛋白水平（图1b）。我们还在另外两种常见的NASH实验模型中评估了肝脏中PRDX过氧化物酶的总体活性，包括由富含脂肪、果糖和胆固醇的西方饮食（WD）诱导的NASH伴肥胖，以及由蛋氨酸和胆碱缺乏饮食（MCD）诱导的NASH不伴肥胖。WD喂养（20周）显著降低了肝脏整体PRDX过氧化物酶活性和PRDX1和PRDX4的蛋白水平，但增加了肝脏中PRDX3的水平（图1c， d）。我们还观察到，MCD喂养（5周）显著降低了肝脏中PRDX过氧化物酶的整体活性（图1e）和PRDX1、PRDX5、PRDX6的蛋白水平，但显著增加了PRDX3的水平（图1f）。综上所述，这些结果证实了NASH患者肝脏中PRDX过氧化物酶活性降低，并提示PRDX过氧化物酶活性降低有助于肝脏氧化应激和NASH发病机制。
图1:NASH时全肝PRDX过氧化物酶活性降低
2.PA与PRDX1结合并抑制其过氧化物酶活性
接下来，我们研究了NASH中PRDX过氧化物酶活性降低的潜在原因。PA是最常见和最丰富的饱和FFA，具有促进NASH35的强毒性作用。PA处理（1小时）在HepG2细胞中显著降低了整体PRDX过氧化物酶活性，增加了细胞内ROS水平（图2a， b）。此外，PA处理在较高浓度（500 μM vs 250 μM）显著增加了HepG2细胞中的H2O2水平（图2c， d）。支持所观察到的整体PRDX过氧化物酶活性的降低是由PA处理直接诱导的。为了测试PA是否直接与PRDX1结合，我们进行了表面等离子共振（SPR）检测，其中棕榈酸钠是由于PA的溶解度差。棕榈酸钠与重组WT PRDX1直接结合，产生75.3±4.5 μM的解离常数（KD）（图2e）。使用细胞热位移分析，我们还观察到在HepG2细胞中，PA结合后PRDX1的热稳定性显著增加（图2f）。我们进一步通过Trx-TrxR-NADPH实验评估棕榈酸钠对重组WT PRDX1过氧化物酶活性的影响。棕榈酸钠以剂量依赖性方式抑制PRDX1的过氧化物酶活性，最大抑制率为46.6%（图2g）。综上所述，这些结果表明PA通过抑制PRDX1的过氧化物酶活性和增加氧化应激来促进NASH。
图2:PA与PRDX1结合并抑制其过氧化物酶活性
3.PRDX1敲除可加重NASH和肝纤维化
为了研究PRDX1在NASH发病机制中的潜在影响，我们产生了一个PRDX1敲除（PRDX1 -/-）小鼠株（图3a），并观察到PRDX1 -/-小鼠中整个肝脏PRDX的过氧化物酶活性显著降低（图3b）。在WD喂养6周后，Prdx1-/-小鼠的体重显著高于其野生型（WT）同窝小鼠（图3c）。值得注意的是，WT和Prdx1-/-小鼠的摄食量没有差异（图3d），这表明Prdx1-/-小鼠体重增加可能是由于能量消耗减少。与WT小鼠相比，Prdx1-/-小鼠的胰岛素敏感性显著降低，通过腹腔内葡萄糖耐量试验（IPGTT）和腹腔内胰岛素耐量试验（IPITT）进行评估（图3e， f），同时血清ALT和AST水平显著升高（图3g）。通过HKPerox-Red、H&E、Oil Red O、Sirius Red和α-SMA染色，Prdx1-/-小鼠肝脏H2O2水平显著增加，脂肪堆积和肝纤维化（图3h-j）。综上所述，这些结果表明PRDX1敲除会加重NASH和肝纤维化。
图3:PRDX1敲除增加NASH和肝纤维化
4.PRDX1过表达可改善NASH和肝纤维化
为了进一步了解PRDX1如何影响NASH，我们建立了PRDX1过表达（Prdx1OE/OE）小鼠系。Prdx1OE/OE小鼠肝脏PRDX过氧化物酶活性显著增加（图4a）。经过8周WD喂养后，Prdx1OE/OE小鼠的体重显著低于WT小鼠（图4b），但摄食量与WT小鼠无差异（图4c），表明Prdx1OE/OE小鼠的能量消耗增加。事实上，与WT小鼠相比，Prdx1OE/OE小鼠在夜间的能量消耗显著增加（图4d），但运动活动相似（图4e）。与WT小鼠相比，Prdx1OE/OE小鼠的胰岛素敏感性显著改善，表现为较低的空腹血糖水平和显著改善的胰岛素耐量（图4f， g），并且血清ALT和AST水平（图4h）、肝脏H2O2水平（图4i和补充图4c）和肝脏脂质过氧化程度（图4j）显著降低。此外，与WT小鼠相比，Prdx1OE/OE小鼠肝脏中的脂质堆积和纤维化显著减少（图4k， l）。与这些表型相一致，Prdx1OE/OE小鼠肝脏中的许多促炎或纤维化基因（如Mcp-1、F4/80、Cd11b、Tnf-α、Il-6、Col1a1、Col3a1、Pdgfa和Pdgfra）显著下调（图4m）。综上所述，这些结果表明PRDX1过表达对NASH和肝纤维化具有保护作用。
图4:PRDX1过表达可改善NASH和肝纤维化
5.PRDX1抑制肝脏STAT1和STAT3信号传导
蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）抑制JAK-STAT信号转导40。既往研究表明，与肥胖相关的ROS可氧化PTPs并使其失活（如PTP1B和T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶[TCPTP]），从而增加肝脏STAT信号传导并促进nafld。我们一致地观察到，在WD和mcd诱导的NASH小鼠模型中，肝PTPs的氧化（图5a， b）以及肝STAT1和STAT3的磷酸化（图5c， d）均显著增加。总之，这些结果表明，通过氧化和失活PTPs， H2O2增加STAT信号传导并促进NASH。
同样，在MCD和wd诱导的NASH中，PRDX1敲除显著增加了肝脏STAT1和STAT3的磷酸化（图5e， f）。相反，在wd诱导的NASH中，PRDX1过表达显著降低了肝脏STAT1和STAT3的磷酸化（图5g）。这些结果表明PRDX1通过清除H2O2和减轻ptp的氧化来抑制STAT信号通路。
图5:PRDX1抑制肝脏STAT1和STAT3的磷酸化
6.PRDX1保护肝脏线粒体功能
使用类似的O2k方法，我们研究了从不同NASH小鼠模型中分离出的肝线粒体的功能。WD（20周）和MCD（5周）均显著降低了WT小鼠肝脏线粒体的RCR（图6a），增加了LCR（图6b）。此外，在两种NASH模型中，柠檬酸合成酶活性（CSA）均显著增加（图6c），这表明存在线粒体功能障碍。值得关注的是，mcd喂养的小鼠肝脏中线粒体氧（O2）通量（每CSA）显著增加，而wd喂养的小鼠与nc喂养的小鼠相比，肝脏线粒体O2通量没有变化（图6d）。我们还检测到WD和mcd喂养小鼠的肝线粒体中脂质过氧化程度显著增加（图6e）。这些结果共同表明，脂质过氧化诱导的线粒体功能障碍促进了NASH（伴或不伴肥胖）的发生和进展。
为了测试PRDX1是否通过减轻脂质过氧化来保护肝脏线粒体功能，我们对Prdx1OE/OE和WT小鼠喂食WD（20周）或MCD（5周）诱导NASH进行了O2k分析。与WT小鼠相比，Prdx1OE/OE小鼠在WD喂养后，线粒体功能得到改善，表现为RCR显著增加（图6f）， LCR显著降低（图6g）。肝脏CSA在Prdx1OE/OE小鼠中有显著降低的趋势（p = 0.053）（图6h），而在WT和Prdx1OE/OE小鼠之间没有观察到肝脏线粒体氧通量的差异（图6i）。此外，Prdx1OE/OE小鼠肝脏线粒体的脂质过氧化程度显著降低（图6j）。综上所述，这些结果支持PRDX1除了抑制STAT信号外，还通过清除H2O2和减轻肝脏线粒体的脂质过氧化来保护肝脏线粒体功能
图6:PRDX1保护肝脏线粒体功能
7.迷迭香酸作为PRDX1激动剂的鉴定
我们的结果表明，提高PRDX1的过氧化物酶活性是对抗NASH的一种潜在方法。通过基于蛋白质热位移分析（PTS）的化合物库筛选和基于过氧化物酶活性分析的验证，我们确定迷迭香酸（RA）是PRDX1的高效激动剂（图7a）。RA激活PRDX1过氧化物酶活性的半最大浓度为253.1±49.0 nM（图7b），而SPR显示RA与PRDX1的KD为375.7±2.5 nM（图7c）。为了更好地理解PRDX1被RA激活的机制，我们解决了PRDX1突变体PRDX1C52SC83S （aa1-175）的复杂结构，其中C52和C83残基都突变为丝氨酸，并且野生型PRDX1蛋白的c端（aa 176-199）被截短，考虑到只有PRDX1C52SC83S （aa1-175）突变体在与野生型和不同PRDX1突变体的结晶筛选后可以获得可重复和高分辨率的晶体。RA和PRDX1C52SC83S （aa 1-175）的FO-FC（图7d）和2FO-FC（图7e）图谱完整，表明RA在复杂结构中的结合模式是可靠的。
复杂的结构表明RA分子支架与PRDX1的A链和B链相互作用，RA结合在PRDX1的过氧化物活性位点（图7f）。静电势图显示RA结合位点（过氧化位点）的内部是电负性的，而外部是电正性的（图7g）。总体上，RA与PRDX1C52SC83S （aa 1-175）之间的12个氢键形成了一个氢键网络，从而稳定了结合位点上的残基（图7h）。综上所述，这些结果表明，RA是一种高效和特异的PRDX1激动剂，具有抗氧化和抗炎活性
图7：迷迭香酸作为PRDX1激动剂的鉴定
8.RA治疗可减轻NASH和肝纤维化
接下来，我们评估了wd诱导的NASH患者的RA活动。RA治疗有效地降低了肝脏H2O2和脂质过氧化水平（图8a、b），以及天狼星红和α-SMA染色所示的肝纤维化（图8c）。与这些表型一致，我们观察到，在ra治疗的小鼠中，许多促炎或纤维化基因（例如Mcp-1、Tnf-α、F4/80、Cd11b、Cd11c、Col1a1、Col3a1、Pdgfa、Pdgfra和Pdgfb）的表达显著降低（图8d），并且肝脏STAT1和STAT3磷酸化水平显著降低（图8e）。此外，如LCR显著降低所示，RA治疗改善了肝脏线粒体偶联和呼吸效率，但未改变CSA水平或线粒体O2通量（图8f、g）。
我们还评估了mcd诱导的NASH患者的RA活性。虽然RA治疗没有改变肝脏内的脂肪堆积，但它有效减少了肝纤维化（图8h）、肝脏STAT1和STAT3磷酸化（图8i）以及肝脏内几种炎症或纤维化基因（如Cd11c、Col1a1、Col3a1、Pdgfb和Pdgfra）的表达（图8j）。此外，RA治疗改善了肝脏线粒体功能，表现为肝线粒体LCR显著降低和O2通量增加（图8k， 1）。综上所述，RA通过特异性激活PRDX1的过氧化物酶活性，降低肝脏H2O2水平，抑制肝脏STAT1和STAT3信号通路活性，保护肝脏线粒体功能，最终缓解NASH和肝纤维化。
图8:RA治疗可减轻NASH和肝纤维化
结论
综上所述，本研究表明PA通过结合PRDX1并抑制其过氧化物酶活性来促进肝脏氧化应激和NASH，而PRDX1通过其过氧化物酶活性来保护NASH。因此，激活PRDX1的过氧化物酶活性是治疗NASH的一种有前景的方法。
Yin W, Xu H, Bai Z, Wu Y, Zhang Y, Liu R, Wang Z, Zhang B, Shen J, Zhang H, Chen X, Ma D, Shi X, Yan L, Zhang C, Jiang H, Chen K, Guo D, Niu W, Yin H, Zhang WJ, Luo C, Xie X. Inhibited peroxidase activity of peroxiredoxin 1 by palmitic acid exacerbates nonalcoholic steatohepatitis in male mice. Nat Commun. 2025 Jan 11;16(1):598. doi: 10.1038/s41467-025-55939-2.
