三阴性乳腺癌（TNBC）仍然是最具侵袭性的乳腺癌亚型，需要有效的治疗策略。雌激素相关受体α (ERRα)被认为是治疗TNBC的一个有前景的靶点。天然产物及其类似物在肿瘤的药物治疗中至关重要。我们从自然界中筛选了生物碱类、类喹啉类和类黄酮类化合物，以识别ERRα的抑制剂。通过蛋白免疫印迹和荧光素酶报告分析，我们发现类喹啉类（马钱子碱D、鸦苦苷醇和臭香酮）显著抑制ERRα。臭椿酮因其显著的细胞毒性和溶解度而被公认，因此被选作进一步的研究。臭椿酮（AIL）是一种来源于传统中药材臭椿（Ailanthus altissima, Mill）的类藜素，具有显著的抗肿瘤特性而受到关注。尽管AIL具有显著的抗肿瘤作用，但其作用的直接靶点仍不清楚。
2025年1月25日，中国中医科学院中药研究所王继刚、暨南大学药学院麻楠/叶文才、湖北中医药大学李娟团队在J Adv Res发表了题为“Ailanthone induces triple-negative breast cancer cells death involving the inhibition of OTUB1-mediated ERRα deubiquitylation”的文章，臭椿酮抑制去泛素化酶OTUB1介导的ERRα去泛素化，诱导三阴性乳腺癌细胞死亡。
•小分子AIL通过促进ERRα的泛素化诱导TNBC细胞死亡。
•OTUB1已被认为是AIL调节ERRα蛋白水平的关键靶点。
•OTUB1被确定为ERRα的一种新型去泛素化酶。
•AIL抑制OTUB1-ERRα轴促进TNBC细胞死亡，这是治疗TNBC的一个新的调控框架。
摘要
采用TNBC细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453和BT-549）进行体外研究，建立皮下MDA-MB-231肿瘤模型进行体内研究。免疫荧光评估蛋白分布，而基于竞争活性的蛋白谱分析确定潜在的靶蛋白。免疫共沉淀检测蛋白相互作用和修饰，荧光素酶报告实验评估ERRα转录活性。天然产物臭椿酮（AIL）通过降低ERRα蛋白水平有效诱导TNBC细胞死亡。其作用机制涉及AIL通过泛素-蛋白酶体系统促进ERRα的降解，从而降低其转录活性。竞争性abpp方法绘制了AIL的靶蛋白谱，其中含OTU结构域的泛素醛结合蛋白1 （OTUB1）被确定为AIL调控ERRα蛋白水平的关键靶点。OTUB1被证实是ERRα的一种新型去泛素化酶，其C91残基在这一去泛素化过程中至关重要。AIL通过与C91残基相互作用来抑制OTUB1的酶活性，并破坏OTUB1与ERRα的相互作用，最终导致ERRα的抑制。AIL是ERRα的潜在下调因子，其下调机制已被阐明。此外，我们发现了ERRα与OTUB1之间新的调控关系。本文的研究有望为ERRα调节剂提供潜在的先导化合物，并促进旨在调节ERRα活性以治疗三阴性乳腺癌的新型治疗策略的开发。
1.AIL在体内外均可抑制TNBC细胞的增殖
用不同浓度的AIL处理MDA-MB-231、MDA-MB-453和BT549细胞48 h后，用CCK-8法检测AIL对三阴性乳腺癌细胞的增殖抑制作用。AIL呈剂量依赖性地降低MDA-MB-231、MDA-MB-453和BT549细胞的活力。如图1A所示，AIL对所选TNBC细胞的IC50值范围为0.1 μM至0.9 μM。在细胞集落形成实验中，AIL以剂量依赖性方式有效抑制集落形成，如图1B所示。接下来，为了测试AIL在体内的潜在应用，我们首先在皮下植入MDA-MB-231肿瘤细胞的小鼠中评估了AIL的疗效。根据现有文献中记录的剂量，我们初步进行了初步实验，以评估这些剂量的有效性和安全性。根据初步研究的结果，我们随后建立了两个剂量组：分别为1.7 mg/kg和5 mg/kg。与对照组相比，移植瘤的生长明显受到抑制（图1C-F）。综上所述，我们的实验结果证实了AIL在体内外均可抑制TNBC细胞的增殖。
图1 AIL在体内外均对TNBC细胞有抑制作用
2.AIL诱导的细胞死亡涉及ERRα活性的抑制
为了研究AIL对ERRα的影响，我们采用双荧光素酶报告实验评估ERRα的转录活性。因此，AIL以剂量依赖性方式抑制ERRα的转录活性（图2A）。ERRα及其转录共激活因子，被称为过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)共激活因子-1 s (PGC-1 s)，参与多种致癌过程。在我们的研究中，我们选择在AIL治疗后测试PGC1α/ERRα信号轴。如图2B-D所示，AIL处理后细胞和肿瘤组织中ERRα和PGC1α的蛋白水平均降低。此外，AIL显著增加MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中活性氧（ROS）的生成（图2E-F）。ROS的过度产生加剧了细胞损伤，可能与ROS感受器的ERRα表达下调有关。总之，这些结果揭示了AIL诱导的细胞死亡涉及ERRα活性的抑制。
图2 ail诱导的细胞死亡涉及ERRα活性的抑制
3.ERRα的翻译后下调参与了AIL的抗tnbc作用
ERRα在各种类型的人类癌症中具有致癌功能。然而，调节ERRα的具体机制仍然是未知的。因此，研究AIL下调ERRα的机制是必要的。首先，在不同时间点和浓度的AIL处理后，我们测定了TNBC细胞系中ERRα的蛋白水平。如图3A所示，在MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中，AIL以剂量和时间依赖性方式显著降低ERRα蛋白水平。此外，为了探究AIL降低ERRα表达的原因，我们确定了AIL对ERRα mRNA水平的影响。我们使用放线菌酮（CHX）检测了AIL对ERRα蛋白稳定性的影响，结果显示AIL处理后ERRα表达显著降低（图3B）。基于以上证据，我们推测ERRα的下调可能通过蛋白酶体途径发生。为了验证这一假设，我们将细胞暴露于蛋白酶体抑制剂MG-132，这导致了ail诱导的ERRα耗竭的显著恢复（图3C）。这些数据表明，AIL可能通过促进ERRα的泛素化来诱导细胞死亡。接下来，我们将Flag-ubiquitin转染到HEK-293 T细胞中，以评估AIL对ERRα泛素化水平的影响。因此，AIL显著促进ERRα的泛素化（图3D）。这些数据表明，AIL显著影响泛素-蛋白酶体系统（UPS），为识别AIL的靶蛋白提供了明确的指导。
图3 AIL通过泛素-蛋白酶体系统降低ERRα蛋白水平来诱导细胞死亡
4.化学蛋白质组学发现OTUB1是AIL调控ERRα的关键靶点
化学蛋白质组学策略，如热位移分析、药物亲和力反应靶点稳定性分析和基于活性的蛋白质谱分析（ABPP），为探索生物活性化合物的靶点提供了有价值的工具。ABPP是一种常用的方法。这种化合物需要经过化学修饰，通过点击反应固定在珠子上，这可能会导致活性的变化。由于蛋白质也可以被反应性化合物占据，化学探针可以与这些化合物竞争来识别化合物结合蛋白。为了避免靶点选择的偏倚，我们选择了一种反应性氨基酸残基占据化学探针碘乙酰胺炔烃（IAA-Alk）与AIL竞争识别化合物结合蛋白。碘乙酰胺（IAA）通常作为烷化剂靶向蛋白质中的半胱氨酸残基，但它也可以与其他亲核氨基酸残基相互作用，如赖氨酸和酪氨酸。AIL包含一个α， β-不饱和酮结构，这是一个亲电子的实体，能够与蛋白质中发现的亲核氨基酸残基相互作用。因此，考虑到它的结构特征，IAA-Alk是研究与AIL具有结合亲和力的蛋白的一个有价值的工具。
对ail靶向蛋白进行化学蛋白质组学研究。综上所述，化合物IAA-Alk被用于在AIL缺失和存在的情况下靶向蛋白。随后，将与探针结合的蛋白标记为罗丹明部分，以评估AIL处理后荧光信号的减少。在图4A所示的实验中，来自MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的细胞裂解物暴露于磷酸盐缓冲盐水中不同浓度的IAA-Alk 0.5 - 1 h。观察到多个荧光条带，标记强度呈浓度依赖性增强。AIL处理导致IAA-Alk标记组的荧光显著下降，表明AIL与反应性半胱氨酸成功竞争结合。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定ail的靶蛋白。结果显示，超过1000个蛋白对AIL具有相对较高的亲和力（图4B），这表明这些蛋白可能成为AIL的靶点。
利用Reactome通路分析目标组的功能特征和通路，将泛素组分为前5组（图4C）。这项研究强调了AIL对UPS的显著影响，使UPS组件得到了更大的关注。目标组包括E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶、去泛素化酶和其他与UPS相关的蛋白（图4D）。鉴于对去泛素化酶（DUBs）的关注，我们选择了一组对AIL有很强亲和力的DUBs来探索它们调节ERRα蛋白水平的能力。值得注意的是，在这些蛋白中，含OTU结构域的泛素醛结合蛋白1 （OTUB1）被鉴定为与ERRα的蛋白和泛素化水平显著相关（图4E）。
为了证实OTUB1是AIL的直接靶点，我们对过量的AIL进行了竞争性结合实验。pull-down Western blot分析的结果表明，当MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞裂解物与AIL预孵育时，IAA-Alk和OTUB1之间的相互作用受到阻碍（图4F）。为了进一步探索AIL和OTUB1之间的相互作用，我们进行了分子对接和动态分析。对接分析表明，AIL可以访问OTU域内Cys91附近的主动口袋（图4G）。本研究获得了野生型（WT） OTUB1和定点突变型C91A-OTUB1的重组蛋白。采用IAA-Alk荧光标记实验间接检测WT-OTUB1和C91A-OTUB1与AIL的相互作用。首先，通过标记和竞争实验观察IAA-Alk与WT-OTUB1之间的相互作用。结果显示，IAA-Alk的荧光强度随着IAA-Alk的升高而增加，AIL处理后的荧光呈剂量依赖性降低（图4H）。随后，我们对突变的OTUB1进行了类似的检测。C91A-OTUB1对IAA-Alk的标记效率较低，且在AIL处理后未表现出明显的荧光下降（图4H）。综上所述，这些结果表明C91半胱氨酸残基可能在与AIL的相互作用中起关键作用。
图4 定量化学蛋白质组学鉴定OTUB1是AIL的关键靶点之一
5.OTUB1与ERRα相互作用并增强ERRα蛋白稳定性
我们假设OTUB1和ERRα之间可能存在直接的相互作用。为了验证这一假设，我们进行了免疫沉淀（IP）实验。结果表明，外源性过表达flag标记的OTUB1与内源性ERRα以及外源性过表达ha标记的ERRα相互作用（图5A-C）。正如预期的那样，OTUB1与ERRα在MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中共定位（图5D）。随后，我们根据OTUB1和ERRα的相互作用确定了它们之间的结合区域。OTUB1的c端OTU结构域和ERRα的c端结构域（301-433）对于它们的相互作用是必不可少的（图5E， F）。总之，我们的结果表明了OTUB1和ERRα之间的直接相互作用。
接下来的实验旨在验证OTUB1对ERRα蛋白稳定性的影响。如图5G所示，过表达OTUB1会增加ERRα的蛋白水平。此外，OTUB1数量的增加有助于ERRα蛋白的稳定（图5H）。证实了OTUB1敲低的效率，检测到ERRα的低表达（图5I）。为了研究OTUB1对ERRα蛋白半衰期的影响，我们用氯胺酮处理细胞。因此，过表达OTUB1可以增加ERRα蛋白的半衰期，而敲低OTUB1可以降低ERRα蛋白的半衰期（图5J， K）。将Flag-OTUB1转染到敲低OTUB1的乳腺癌细胞中，导致MDA-MB-231细胞中ERRα表达的恢复，如图5L所示。综上所述，我们的数据表明OTUB1促进了ERRα的蛋白稳定性和转录活性。
图5 OTUB1与ERRα相互作用并增强ERRα蛋白稳定性
6.ERRα n端101-200氨基酸区的赖氨酸残基是OTUB1去泛素化ERRα的关键残基
我们之前的研究表明，OTUB1通过泛素-蛋白酶体途径维持ERRα蛋白的稳定性。随后，我们探索了OTUB1对ERRα泛素化状态的影响。如图6A-B所示，过表达OTUB1降低了ERRα的泛素化水平，而敲低OTUB1则起到了相反的作用。OTUB1通过两种不同的机制调节去泛素化：规范和非规范方式。在经典途径中，泛素通过底物蛋白的去泛素化酶活性直接从底物蛋白中去除。抑制泛素化的非标准方式涉及OTUB1与E2泛素结合酶的直接相互作用来清除泛素。OTUB1进一步抑制泛素从E2转移到底物蛋白，不依赖其去泛素酶活性。此外，蛋白OTUB1经过翻译修饰，在中发挥重要作用。为了确定OTUB1的去泛素化方式对其影响ERRα至关重要，我们构建了OTUB1的突变质粒C91A（经典去泛素酶活性缺陷）和D88A（与E2酶结合缺陷）。结果表明，过表达OTUB1-C91A降低了ERRα的蛋白水平（图6C），表明C91A不能稳定ERRα。对这两种ERRα突变体的泛素化进行的后续研究表明，C91突变导致ERRα泛素化水平升高（图6D）。此外，我们的实验表明，Asp88突变增强了ERRα的泛素化水平并降低了其蛋白稳定性。这一结果可能归因于两个潜在因素。其中一个原因可能是Asp88的突变可能影响催化结构域的结构，因为Asp88与Cys91很接近。这种结构改变可能会阻碍OTUB1的直接去泛素化催化功能。另外，OTUB1可能不仅以规范的方式也以非规范的方式去泛素化ERRα，这需要进一步的研究。值得注意的是，这些发现表明Cys91残基的突变对ERRα的稳定性和泛素化状态有最显著的影响。因此，我们的结果表明，Cys91在OTUB1去泛素化ERRα的过程中起着关键作用。
为了鉴定被OTUB1去泛素化的ERRα蛋白上的特异性赖氨酸残基，我们产生了ERRα蛋白的各种突变体。值得注意的是，ERRα突变体（Δ101-200 aa和201-433 aa）的稳定性不受OTUB1的影响（图6E）。为了确定与ERRα结合的赖氨酸(K)连接的聚泛素链被OTUB1去泛素化，我们过表达了几种泛素突变体。一般来说，降解信号是在一个泛素的c末端残基和先前连接的泛素部分的K48之间产生的。图6F所示的结果清楚地表明，k48连接的多聚泛素链是OTUB1去泛素化的靶点。此外，我们的研究表明ERRα表现出与K29， K33和k63连接的多聚泛素链的结合偏好。然而，需要进一步的研究来阐明这种特定类型的修饰与ERRα相关的机制。
图6 OTUB1直接去泛素化ERRα
7.AIL抑制OTUB1的去泛素化活性，阻碍OTUB1与ERRα的结合，增加ERRα的泛素化水平
在我们的研究中，我们阐明了OTUB1直接去泛素化ERRα，以及AIL通过靶向OTUB1下调ERRα的表达。AIL通过OTUB1蛋白抑制ERRα的确切机制以前是未知的。为了解决这个问题，我们研究了AIL对OTUB1蛋白的影响，考虑到它与AIL的直接相互作用。基于AIL可以访问OTU结构域内的活性位点并干扰C91残基的功能，我们假设AIL对OTUB1的催化活性有抑制作用。如图7A所示，我们的结果显示，在AIL存在的情况下，ERRα的泛素化水平增加。此外，我们的研究表明，OTUB1的过表达抵消了AIL导致的ERRα的减少（图7B）。进一步的AIL与两种蛋白复合物的对接分析表明，AIL位于两种蛋白之间，这使得我们推测AIL可能抑制它们的结合（图7C）。为了更有效地阐明蛋白质与AIL之间的相互作用能，我们分析了在AIL存在和不存在的情况下蛋白质之间的相互作用能。如图7D所示，AIL存在时，这两种蛋白的平均结合能为- 755.67 kJ/mol，而AIL不存在时，这两种蛋白的平均结合能为- 1075.67 kJ/mol，表明这种小分子的存在降低了蛋白质之间的总相互作用能，并抑制了它们的相互作用。如图7E所示，co-IP检测证实了这些计算结果。综上所述，我们的数据表明，AIL直接抑制OTUB1的催化活性，并阻断了OTUB1和ERRα之间的相互作用。这种抑制有效地阻碍了去泛素化过程，并通过泛素-蛋白酶体系统途径促进ERRα的降解。
图7 AIL抑制OTUB1的去泛素化酶活性，并破坏OTUB1与ERRα的相互作用
结论
我们的研究结果表明，AIL是ERRα的一个有前景的下调因子，并且这种下调的机制已经被阐明。此外，我们发现了ERRα与OTUB1之间新的调控关系。本文所介绍的研究有望为ERRα调节剂产生潜在的先导化合物，并刺激旨在调节ERRα活性以治疗三阴性乳腺癌的新型治疗策略的发展。
含OTU结构域的泛素醛结合蛋白1 （OTUB1）通过稳定ERRα的蛋白稳定性发挥癌基因的作用。臭香酮（AIL）通过与C91残基相互作用抑制OTUB1的酶活性，破坏OTUB1与ERRα的相互作用，最终导致ERRα的抑制。最终，TNBC细胞的增殖被抑制，细胞死亡被诱导。
Zhang Z, Huang W, Wang L, Li G, Xu F, Wu P, Luo C, Huang Q, Kuang W, Liu Z, Jiang Y, Zhao X, Zhang Y, Ye W, Li J, Ma N, Wang J. Ailanthone induces triple-negative breast cancer cells death involving the inhibition of OTUB1-mediated ERRα deubiquitylation. J Adv Res. 2025 Jan 24:S2090-1232(25)00054-2. doi: 10.1016/j.jare.2025.01.035.
