2024年12月30日，陆军军医大学附属第一医院（西南医院）运动医学中心唐康来/郭林课题组、原纽约大学医学院（现耶鲁大学）刘传聚研究团队、陆军军医大学高原医学系缪洪明课题组与重庆医科大学第一附属医院国家卫健委功能性脑疾病实验室陈玉佳男课题组在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=40.8）合作发表了题为“Malate initiates a proton-sensing pathway essential for pH regulation of inflammation”的研究型论著。该研究首次揭示了L-苹果酸独立于其自身酸度的抗炎作用，利用20K人类蛋白组芯片发现了L-苹果酸靶点蛋白BiP的直接互作蛋白IRF2BP2，随后证实了BiP-IRF2BP2信号是苹果酸的抗炎靶通路，同时首次定义了在生物大分子相互作用中扮演“氢离子传感器”角色的多羧酸小分子群。
摘要
代谢物可作为启动生理适应的信号模式发挥双重作用。代谢是一种编码生物信息的化学语言，已被公认为指导炎症反应的有力原理。胞质pH是巨噬细胞炎症反应的调节因子。在本研究中，我们发现l -苹果酸通过BiP-IRF2BP2信号通路发挥抗炎作用，BiP-IRF2BP2信号通路是巨噬细胞胞质pH的感受器。首先，通过初步筛选，l -苹果酸，一种在促炎巨噬细胞中上调的三羧酸中间体，被鉴定为一种有效的抗炎代谢产物。随后用DARTS和MS进行筛选，分离出l -苹果酸- bip结合物。蛋白质-蛋白质相互作用芯片进一步筛选发现，l -苹果酸抑制BiP与已知的抗炎蛋白IRF2BP2的偶联。有趣的是，pH降低可以促进l-苹果酸的羧基质子化，促进l-苹果酸和羧基酸类似物如琥珀酸结合BiP，并以羧基依赖的方式破坏BiP- irf2bp2的相互作用。l -苹果酸和酸化均可抑制BiP-IRF2BP2的相互作用，并保护IRF2BP2免受bip驱动的降解。此外，在体外和体内，BiP-IRF2BP2信号是l -苹果酸和pH对炎症反应的影响所必需的。这些发现揭示了一个之前未被识别的质子/羧酸盐双重感知通路，其中pH和l -苹果酸调节炎症反应，表明某些羧酸盐代谢物通过大分子之间的相互作用在质子生物感知中扮演着适配器的角色。
1.L-苹果酸补充剂发挥抗炎作用
最初，我们的目标是利用内源性化合物（包括 TCA 循环中的中间体和衍生代谢物）扩大抗炎治疗策略的工具箱。用脂多糖（LPS）刺激的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）筛选出38种具有易溶性的能量代谢中间体，然后通过qPCR测量Il1b、Tnfa和Il6的表达水平。L-苹果酸是一种 TCA 中间体，作为一种有效的抗炎候选物脱颖而出（图1a）。接下来我们验证了L-苹果酸对IL-6（图1b）和TNF-α（图1c）的抗炎作用。通过 ELISA 检测，并使用蛋白质印迹检测 IL-1β 前体（pro-IL-1β）（图1d）。总而言之，这些数据表明补充 L-苹果酸可以抑制活化巨噬细胞的促炎反应。
此外，我们根据上述 RNA-seq 分析收集的线索，测试了 L-苹果酸是否在几种炎症性疾病动物模型中抑制炎症。接受致死剂量LPS的小鼠在24小时内死于LPS休克，而同时给予LPS和单剂量200或400mg/kg体重的L-苹果酸的小鼠显示出更高的存活率（图1h）。接下来，我们在胶原抗体诱导的关节炎 (CAIA) 模型中检查了 L-苹果酸对炎症性关节炎的影响。L-苹果酸的施用减轻了疾病的严重程度，包括爪肿胀（图1i，k）、关节破坏（图1j）、临床评分（图1l））。总之，L-苹果酸补充剂在各种炎症动物模型中表现出抗炎作用。
图1 L-苹果酸作为一种抗炎代谢物
2.L-苹果酸直接结合 BiP
我们试图揭示 L-苹果酸抗炎作用背后潜在的、未知的分子基础。我们利用了一种公正的生化方法——药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）。采用Raw264.7巨噬细胞作为DARTS的蛋白源，通过考马斯蓝染色检测蛋白酶消化过程中受L-苹果酸处理保护的条带（图2a ）。质谱法鉴定出结合免疫球蛋白（BiP，也称为 ER 伴侣 Grp78、78-kDa 葡萄糖调节蛋白和 HspA5、热休克蛋白 A5）是一种有效保护的蛋白质，存在于 L-苹果酸处理的蛋白质样品中（图 2a-d）。表面等离子共振（SPR）检测到L-苹果酸与重组BiP蛋白（图2e，f）。已知与 BiP 结合的三磷酸腺苷 (ATP)在我们的 SPR 测定中用作阳性对照（图2e 、f）。总之，这些结果证明L-苹果酸直接结合BiP，并促使我们测试BiP在L-苹果酸抗炎活性中的作用。
在活化的巨噬细胞中，BiP缺陷在LPS刺激的后期（24小时）显著下调pro-IL-1β（图2h ），并阻断添加L-苹果酸诱导的Il1b水平的抑制（图2i）和在 pH e控制条件下（介质 pH 6.9），L-苹果酸被 L-苹果酸降解（图2j-l），其中 L-苹果酸进入细胞 但没有降低 pH i (图2m）。为了评估 BiP 在体内 L-苹果酸给药炎症反应治疗效果中的作用，我们评估了骨髓 BiP 缺乏对接受致死剂量 LPS 的 L-苹果酸治疗小鼠的影响，发现Hspa5 f/f中 L-苹果酸给药诱导的存活率被阻断；Lyz2 -Cre小鼠（图2n）。这些数据表明 BiP 是 L-苹果酸调节炎症的主要下游介质。
图2 BiP 与 L-苹果酸结合，是其抗炎作用所必需的
3.BiP 直接结合 IRF2BP2，而 L-苹果酸抑制 BiP-IRF2BP2 相互作用
根据我们的 SPR 数据和上述一般模式，我们推测 L-苹果酸结合可以诱导 BiP 构象变化，从而调节炎症反应。因此，我们研究了 L-苹果酸是否影响 BiP 的蛋白质-蛋白质相互作用。考虑到 BiP 相互作用组的复杂性和广泛性，我们进行了另一种无偏见的检测，即人类蛋白质微阵列，其中包含约 20,000 个在酵母中表达的全长、纯化的人类蛋白质。测试了每种候选物在三种不同处理、载体和含有或不含 L-苹果酸的重组 BiP 蛋白的“结合信号”（图3a、b）。显示最强“BiP结合信号”的候选蛋白是干扰素调节因子2结合蛋白2（IRF2BP2），同时IRF2BP2的“BiP结合信号”对L-苹果酸最敏感（图3b，c） 。重要的是，IRF2BP2 是巨噬细胞中的一种抗炎蛋白，可抑制Il1b表达。此外，基于cellua测定，我们进行了补充分析，通过RNA-seq数据的独创性路径分析（IPA）来评估L-苹果酸如何影响LPS刺激的BMDM中的分子调节，这表明“地塞米松”是其中之一。前5个预测转录改变的上游调节因子（图3d），并且典型途径分析表明，RNA-seq中鉴定的差异表达基因（DEG）参与“PD-1/PD-L1癌症免疫治疗途径”和“糖皮质激素受体信号传导”（图3e）。值得注意的是，IRF2BP2 被认为是糖皮质激素受体 (GR) 和 NF-κB的共调节因子，据报道可调节肿瘤中的 PD-L1 表达.
然后，我们通过多种方法验证了 BiP 和 IRF2BP2 之间的 L-苹果酸敏感相互作用。在SPR中，我们检测到BiP和IRF2BP2之间的直接结合以及L-苹果酸诱导的BiP-IRF2BP2结合的破坏（图3f），而没有检测到L-苹果酸与IRF2BP2的结合（图3g）。在LPS引发的巨噬细胞中，我们还通过近端连接测定检测到L-苹果酸处理对BiP-IRF2BP2相互作用的抑制作用（图3h），并通过免疫荧光检测对BiP-IRF2BP2共定位的抑制作用（图3i）。值得注意的是，虽然 BiP 主要位于内质网腔，但 BiP 通过 Nt-精氨酸化从 ER 逆向转位。通过在LPS刺激和未刺激的巨噬细胞中进行免疫共沉淀（Co-IP），我们发现L-苹果酸减少了BiP-IRF2BP2相互作用（图3j，k），但不减少pH e（控制介质pH 6.7）或pH i（图3l）。与 LPS 刺激期间细胞内 L-苹果酸的积累一致，LPS 抑制 BiP 与 IRF2BP2 的细胞内相互作用（图3j, k）。总而言之，这些数据表明 BiP 直接结合 IRF2BP2，并且 L-苹果酸抑制 BiP-IRF2BP2 相互作用。
图3 BiP 和 IRF2BP2 显示出直接结合亲和力，但 L-苹果酸会削弱这种亲和力
4.L-苹果酸-BiP 轴靶向 IRF2BP2 蛋白水解来调节炎症反应
然后我们决定检查 IRF2BP2 是否介导 L-苹果酸-BiP 轴对炎症反应的影响。我们首先测试了l -苹果酸和BiP对IRF2BP2的潜在翻译后调控。据报道，IRF2BP2可被强磷酸化，其核定位依赖于磷酸化。然而，在被发现BiP-IRF2BP2共定位被l -苹果酸添加降低的lps刺激的巨噬细胞中，大多数IRF2BP2似乎与核标志物共定位，并且在l -苹果酸处理后未观察到IRF2BP2定位的明显差异（图3i）。随后，我们检测了l -苹果酸对LPS刺激下IRF2BP2蛋白丰度的影响。我们发现，在lps诱导的巨噬细胞中，l -苹果酸以bip依赖的方式增加了IRF2BP2的蛋白水平（图4a， b），而IRF2BP2的mRNA水平不受l -苹果酸处理的影响（图4c）。接下来，我们使用Tunicamycin和Thapsigargin作为巨噬细胞中的BiP诱导剂68，与它们作为内质网应激源时相比，使用的剂量更低，发现这些处理增加了整个细胞（图4d， e）和细胞核（图4f， g）中的BiP蛋白水平，但对细胞死亡没有显著影响（图4h）。Thapsigargin和Tunicamycin均以bip依赖的方式显著降低lps刺激的巨噬细胞中IRF2BP2的蛋白丰度（图4i），而未降低IRF2BP2的mRNA水平（图4j）。值得注意的是，虽然据报道毒胡萝卜素导致细胞内酸化69，但未检测到衣霉素影响pHi（图4k）。
此外，为了研究BiP和IRF2BP2之间的表型关系，我们测试了炎症巨噬细胞中BiP诱导因子对IL-1β的调节，发现在活化的巨噬细胞中，衣霉素促进Il1b表达（图4l），而IRF2BP2缺陷消除了衣霉素对Il1b表达（图4m）和pro-IL-1β产生（图4n， o）的促进作用。因此，我们提出BiP以IRF2BP2依赖的方式调节Il1b表达。接下来，我们研究了IRF2BP2在l -苹果酸的抗炎调节中的作用。在lps诱导的巨噬细胞中，IRF2BP2缺陷阻断了添加l -苹果酸的抗炎作用（图4p， q）和ph控制条件下的l -苹果酸的抗炎作用（图4r-t），其中l -苹果酸进入细胞，但没有降低pHi（图2m）。进一步，我们确定了IRF2BP2是否在l -苹果酸治疗的体内炎症反应中发挥保护作用，并发现l -苹果酸诱导的生存率增加在Irf2bp2f/f中被消除；Lyz2-Cre小鼠（图4）。综上所述，这些结果表明，l -苹果酸- bip轴通过bip结合的抗炎蛋白IRF2BP2调节炎症反应。
图4 l -苹果酸- bip轴通过IRF2BP2调控炎症反应
随后，我们旨在分析l -苹果酸- bip轴对IRF2BP2蛋白水平的调控机制。BiP和l -苹果酸对IRF2BP2蛋白丰度的影响而不是对IRF2BP2 mRNA水平的影响，提示我们要验证l -苹果酸-BiP轴是否调节IRF2BP2蛋白的稳定性。我们使用蛋白质合成抑制剂放线己酰亚胺（CHX），发现BiP诱导剂降低了CHX处理的BMDMs中IRF2BP2蛋白的稳定性（图5a， b）。此外，BiP依赖的方式，IRF2BP2蛋白被BiP诱导剂破坏（图5c， d），并被l -苹果酸（l - apple）稳定（图5e， f），而l -苹果酸不降低pHe（控制的培养基pH 6.7）或pHi（图5g）。接下来，我们探究了l -苹果酸- bip轴如何调节IRF2BP2蛋白的稳定性。BiP被认为是位于细胞质和细胞核中的分子平台，有助于其结合靶点的降解，从而控制特定的信号通路。据报道，IRF2BP2的稳定性受泛素和蛋白酶体依赖性降解的调节，而这一过程受IRF2BP2的结合蛋白调节73虽然在8h36的LPS处理中IRF2BP2蛋白水平有所下降（图4a， b，图5h， i），但在LPS刺激的8小时到24小时，IRF2BP2蛋白水平恢复（图5h， i），这可以解释为LPS诱导巨噬细胞中BiP-IRF2BP2相互作用的抑制，而在LPS处理的早期阶段IRF2BP2的下调可能归因于LPS- tlr4信号介导的蛋白酶体的激活。因此，我们测试了泛素-蛋白酶体系统通过l -苹果酸- bip轴对IRF2BP2和IL-1β的调节作用。我们使用未被检测到的蛋白酶体抑制剂MG132改变BMDMs的pHi（图5j），发现MG132消除了添加l -苹果酸对lps诱导Il1b表达的影响（图5k），而自噬体-溶酶体融合抑制剂巴佛洛霉素a不影响添加l -苹果酸的抗炎调节（图5l）。此外，在mg132处理的促炎巨噬细胞中，l -苹果酸不能上调IRF2BP2蛋白的丰度（图5m， n）。通过在mg132预处理的细胞中进行Co-IP检测，我们发现在l -苹果酸处理的巨噬细胞（图5o， p）和Hspa5+/−Raw 264.7细胞（图5q， r）中，IRF2BP2的泛素化水平降低（图5q， r）。
图5 l -苹果酸盐保护IRF2BP2免受bip驱动的蛋白质降解
6.BiP-IRF2BP2信号通路感知胞质质子
我们确定了pH波动是否独立于外源性l -苹果酸影响细胞中的BiP-IRF2BP2信号传导。我们首先根据商业试剂盒在校准缓冲液中使用尼日菌素和缬氨酸霉素校准pHi。值得注意的是，细胞内酸化以ph依赖的方式抑制了巨噬细胞中BiP-IRF2BP2的相互作用（图6a， b）。随后的Co-IP检测表明，酸化培养基（AcM）略微抑制了BiP-IRF2BP2的相互作用，但在lps诱导的巨噬细胞中，使用莫能菌素处理AcM增强了BiP-IRF2BP2的相互作用（图6c， d），这可以解释为依赖于Na+/K+ atp酶维持的内向Na+梯度，由莫能菌素驱动的H+二次主动转运。此外，酸化培养基减轻了IRF2BP2的降解，莫能菌素消除了酸化培养基的这一作用（图6e、f）。此外，另一种pHi碱化剂NH4Cl在巨噬细胞中促进了BiP-IRF2BP2的相互作用（图6g， h）。pHi调节剂的这些数据证实了BiP-IRF2BP2相互作用/信号传导感知胞质质子。随后，我们使用TMEM175的激活剂（包括花生四烯酸盐（ArA）和DCPIB (DB)）来上调胞质质子，确定了BiP-IRF2BP2相互作用/信号传导所感知的质子相对于溶酶体的亚细胞定位78ArA减少了细胞中BiP-IRF2BP2的相互作用（图6i， j）。ArA和DB都以bip依赖的方式保护IRF2BP2免受降解（图6k）。此外，ArA和AcM都增加了lps处理的BMDMs中IRF2BP2的蛋白丰度，而这一效应在BiP敲除的巨噬细胞中没有观察到（图6l， m）。总的来说，这些数据表明，独立于溶酶体酸化，细胞内的质子抑制了细胞中BiP-IRF2BP2的相互作用，并通过BiP诱导IRF2BP2的聚集。
图6 BiP-IRF2BP2信号不依赖于溶酶体pH来感知细胞内质子
7.降低pH有利于l-苹果酸与BiP结合，并以羧基依赖方式抑制BiP- irf2bp2的相互作用
为了验证我们的假设，我们检测了pH对l -苹果酸诱导的BiP-IRF2BP2结合中断以及l -苹果酸- bip相互作用的影响。在SPR中，l -苹果酸的存在允许pH降低对BiP-IRF2BP2的结合产生抑制作用，而酸性pH有利于l -苹果酸抑制BiP-IRF2BP2的相互作用（图7a）。此外，酸化增强了SPR中的l -苹果酸- bip结合（图7e）。总之，这些数据支持我们的假设，即质子和l -苹果酸协同调节BiP-IRF2BP2相互作用。我们还使用l -苹果酸的羧酸类似物测试了l -苹果酸的羧基在结构-活性关系中对BiP- irf2bp2相互作用的影响以及l -苹果酸对BiP结合的影响。(1) d -苹果酸，l -苹果酸的对映体，以及缺乏羟基的琥珀酸，被检测到以ph敏感的方式破坏BiP- irf2bp2的相互作用（图7b， c）和结合BiP（图7f， g）。(2)丙二酸，最小的C3二羧酸（不同于苹果酸，它的碳链较短且缺乏羟基）显示出对BiP- irf2bp2相互作用的ph敏感性破坏（图7d）和与BiP的酸性增强的亲和力（图7h）。(3)溶剂对照，2-羟基丁酸和3-羟基丁酸相比l -苹果酸只有一个羧基被甲基取代，没有显示出ph敏感的BiP- irf2bp2相互作用中断（图7i-k）或对BiP的亲和力（图7m-o）。(4) l -2-羟基戊二酸（L-2HG）是一种与苹果酸不同的二羧酸盐，它的碳链较长（l -苹果酸C4， L-2HG C5），没有检测到它能破坏BiP- irf2bp2的相互作用（图7l）或与BiP结合（图7p）。此外，我们还研究了l -苹果酸的三羧酸类似物是否可以结合BiP并干扰BiP- irf2bp2。我们测试了顺乌头酸，一种具有高单质子化相关pKa（约6.2，三羧酸的pKa3）的三羧酸盐，在我们的代谢产物筛选试验中，顺乌头酸的补充也有效地抑制了lps刺激的巨噬细胞中促炎基因的表达（图1a），我们检测到顺乌头酸诱导的BiP-IRF2BP2结合中断（图7q），以及顺乌头酸- bip相互作用，该相互作用被pH降低增强（图7r）。综上所述，这些数据表明，除了l -苹果酸外，它的某些羧酸类似物也可以结合BiP并以ph敏感的方式破坏BiP- irf2bp2的相互作用，而BiP结合羧酸中由适当长度的碳链（短于或等于4）连接的两个羧酸是羧酸-BiP结合和酸度促进的BiP结合羧酸抑制BiP- irf2bp2结合的关键结构，也就是说，基于羧酸的结构-活性关系由羧酸- bip结合和ph -羧酸- bip - irf2bp2轴共享。因此，我们提出，由BiP结合的羧酸盐诱导的酸促进的BiP- irf2bp2相互作用的中断，以及BiP与BiP结合的羧酸代谢物（如l -苹果酸，琥珀酸和顺乌头酸）的ph敏感结合可以至少部分解释细胞中BiP- irf2bp2相互作用的质子感知，而l -苹果酸的高pKa，细胞质水平，对BiP的亲和力，以及其潜在的缺乏触发促炎信号（如琥珀酸）的能力，可以综合解释其在细胞中的抗炎调节中在这些bip结合羧酸盐中的相对优势。
总体而言，我们模拟了一个对pH敏感的苹果酸-BiP相互作用的键式结合模型（图7s），该模型以及显示苹果酸的结构-活性关系的数据（图7a-r）支持了我们的机制推测，即BiP和羧酸盐对pH的共同感知需要羧基-羧基对的形成，这是一种“增加pka”的化学基础，在pH约7.0的情况下获得足够的质子敏感性。
图7 降低pH有利于l -苹果酸及其类似物与BiP结合并抑制BiP- irf2bp2相互作用
8.在体外，pH波动通过BiP-IRF2BP2轴调节IL-1β的产生
然后我们验证BiP-IRF2BP2信号是否介导了pH波动对炎症反应的影响。重要的是，在lps刺激的巨噬细胞中，BiP（图8a， c, e）和IRF2BP2（图8b， d, f）的缺乏阻断了AcM诱导的IL-1β水平的下调（图8a - c）和莫能菌素诱导的IL-1β产生的上调（图8d-f）。此外，我们还测试了另一种pHi碱化剂NH4Cl，我们发现它在lps刺激的巨噬细胞中对IL-1β水平有中度但显著的上调，而在BiP缺乏（图8g-i）或IRF2BP2缺乏（图8j-l）的巨噬细胞中没有上调。综上所述，这些数据表明BiP-IRF2BP2信号通路介导了pH波动对促炎巨噬细胞产生IL-1β的影响。
有趣的是，直肠注射0.3% NaOH溶液引起了肠道炎症（图8m），结肠缩短（图8n），以及炎症细胞因子IL-1β（图8o）和IL-6（图8p）的上调。重要的是，BiP的髓系缺乏消除了naoh诱导的上述结肠炎表型（图8 - m-p）。在IHC（图8q）和western blot（图8r）中，NaOH处理的小鼠中IRF2BP2的蛋白丰度降低，而IRF2BP2的下调也在Hspa5f/f中被检测到；lyz2-Cre小鼠（图8r），这可能归因于非髓系细胞对NaOH的反应。值得注意的是，在对照组结肠黏膜的免疫组织化学染色中，IRF2BP2的蛋白水平在结肠上皮附近较低，环境较碱性（图8q）， IRF2BP2的这种生理分布符合IRF2BP2蛋白稳定性的ph感知特征。综上所述，这些结果表明了质子依赖的肠道免疫稳态维持，BiP-IRF2BP2信号通路在其中发挥了关键作用。
图8 BiP-IRF2BP2信号通路将pH波动与炎症联系起来
结论
本研究主要通过添加l -苹果酸来检测l -苹果酸的抗炎作用及其下游分子通路。此外，通过l -苹果酸的内源性积累模型验证了bip结合羧酸干预导致的pHi调节剂功能的丧失。缺乏l -苹果酸及其内源性羧酸类似物的动物/细胞模型导致难以确定BiP-IRF2BP2信号传导和炎症对pH的反应在多大程度上需要细胞中bip结合的羧酸盐。虽然通过RoseTTAFold和分子对接的预测为我们的研究提供了一个概念框架，但未来的工作应该在实验上解决BiP与IRF2BP2或BiP结合羧酸盐的复合物的结构。此外，基于这些潜在的实验结构数据，我们需要建立严格的突变计划，并将引起大结构变化的可能性降至最低，以检验BiP与l -苹果酸和羧酸类似物的特异性结合在苹果酸和pH波动影响中的重要性。
Chen YJ, Shi RC, Xiang YC, Fan L, Tang H, He G, Zhou M, Feng XZ, Tan JD, Huang P, Ye X, Zhao K, Fu WY, Li LL, Bian XT, Chen H, Wang F, Wang T, Zhang CK, Zhou BH, Chen W, Liang TT, Lv JT, Kang X, Shi YX, Kim E, Qin YH, Hettinghouse A, Wang KD, Zhao XL, Yang MY, Tang YZ, Piao HL, Guo L, Liu CJ, Miao HM, Tang KL. Malate initiates a proton-sensing pathway essential for pH regulation of inflammation. Signal Transduct Target Ther. 2024 Dec 30;9(1):367. doi: 10.1038/s41392-024-02076-9.
