肌少症以骨骼肌质量和功能随年龄增长逐渐下降为特征，显著影响患者的生活质量和死亡率。自噬在维持肌肉健康中起着至关重要的作用。人们越来越关注利用自噬来减轻肌肉衰老效应。天然自噬激活剂对骨骼肌衰老的影响仍不清楚。本研究旨在鉴定天然的自噬激活剂并评估其对骨骼肌衰老的影响。
2025年1月28日，韩国食品研究所老化与代谢研究组Chang Hwa Jung在J Cachexia Sarcopenia Muscle（IF 9.4）在线发表题为“A Natural Autophagy Activator Castanea crenata Flower Alleviates Skeletal Muscle Ageing”的文章。揭示栗子花提取物CCFE通过防止线粒体功能障碍和恢复自噬流，有效抑制老年小鼠骨骼肌衰老。
为了寻找新的自噬激活剂，我们筛选了493种天然产物，并确定了板栗花提取物（CCFE）是一个有前景的候选自噬激活剂。研究CCFE对依托泊苷诱导的C2C12细胞衰老的影响。在动物实验中，老龄小鼠（18月龄）分别饲喂添加0.1%和0.2% CCFE的饲料3个月。我们评估了运动能力，线粒体功能和自噬通量，以确定CCFE对骨骼肌衰老的影响。使用LC-MS/MS分析了CCFE中的成分，并检测了它们的功能性质。CCFE增强了自噬流（LC3II增加80%，p < 0.05），降低了衰老相关的β-半乳糖苷酶活性（降低了32.78%,p < 0.001）。在老年小鼠中，3个月的CCFE补充改善了肌肉重量（增加18%，p < 0.05）和功能(跑步机性能增加60%，p < 0.5；握力增加25%，p < 0.05)。它减轻了线粒体功能障碍（基础氧消耗率增加了59%，p < 0.05）并恢复了自噬。CCFE通过激活AMPK（增加80%，p < 0.01）和抑制Atg5蛋白乙酰化（减少65%，p < 0.001）来增强自噬，其作用来自鞣花酸和多胺。CCFE补充恢复了老年小鼠肠道菌群从鞣花酸产生的代谢产物多胺水平（血清亚精胺从0.98±0.08增加到2.22±0.05 μg/mL, p < 0.001）和尿石素水平（血清尿石素A从0增加到18.79±0.062 ng/mL, p < 0.001）。CCFE通过防止线粒体功能障碍和恢复自噬流，有效抑制老年小鼠骨骼肌衰老。它是通过调节AMPK和EP300乙酰转移酶的活性来实现这一目标的，其成分鞣花酸和多胺的贡献。这些发现强调了CCFE作为一种延长健康寿命和缓解肌肉减少症的治疗药物的潜力，为未来的临床试验提供了基础。
1在体外,循环生物体激活自食通量
在小鼠成肌细胞C2C12细胞中评估CCFE的细胞毒性，结果显示低于200 μg/mL的浓度不影响细胞活力。CCFE （50 ~ 100 μg/mL）联合RM（阳性对照）处理C2C12细胞，观察CCFE对自噬流的影响。同时加入自噬小体-溶酶体融合抑制剂巴佛洛霉素A1 （Baf）处理2 h。CCFE处理增加了LC3II蛋白的表达，并且在CCFE处理的细胞中，baf诱导的自噬体积累高于对照细胞（图1A，B）。虽然总p62蛋白表达无显著差异，但丝氨酸403位点的磷酸化p62 （p-p62）在ccfe处理的细胞中显著增加，无论是否加入Baf。P62是一种选择性自噬受体蛋白，可识别泛素化蛋白并将其转运至自噬体进行降解。丝氨酸403位点的磷酸化增强了p62活性，而p-p62周转的增加表明p62介导的自噬流增强。增强的自噬流通常会降低总p62蛋白水平。为了验证ccfe处理的细胞中p62蛋白水平的升高是否归因于自噬流的抑制，我们检测了p62的mRNA水平。结果表明，p62 mRNA水平显著增加，提示p62蛋白的增加是由于mRNA水平增强而非自噬流受阻（图1C）。
利用mcherry - egfp - lc3b转染HeLa细胞，评估CCFE是否能在不阻断自噬体-溶酶体融合的情况下增强自噬流。mCherry红色荧光蛋白在酸性条件下的稳定性保证了自噬溶酶体中只有红色荧光持续存在。共聚焦成像显示，与Torin 1（阳性对照）一样，CCFE增加了自噬溶酶体的数量（红点），而Baf诱导了自噬体的积累（黄点）（图1D）。LC3点的定量证实了CCFE导致的自噬流显著增加（图1E）。进一步，我们探索了CCFE对两个关键的自噬调节通路AMPK和MTOR的影响。CCFE降低了MTOR通路下游蛋白S6K1的磷酸化，增加了AMPK的磷酸化。CCFE还通过AMPK增强ULK1在Ser317的磷酸化，提示CCFE通过激活AMPK促进自噬流（图1F）。总之，这些发现表明CCFE主要通过激活AMPK来促进自噬流。
图1 CCFE是一种新型的天然自噬激活剂
2.CCFE抑制骨骼肌细胞的细胞衰老
我们研究了CCFE对细胞衰老的潜在抑制作用。为了诱导细胞衰老，我们使用了足叶乙甙（一种已知可引起DNA损伤的拓扑异构酶II抑制剂），并使用SA β-gal染色评估了CCFE对足叶乙甙诱导的C2C12细胞衰老的影响。依托泊苷有效地诱导细胞衰老，而与CCFE共处理降低了SA β-gal活性（图2A）。此外，CCFE降低了p53和p16的细胞衰老相关蛋白水平（图2B），并降低了Mcp1、Il1a和Il6的mRNA表达，这是衰老相关分泌表型（SASP）的组成部分，表明CCFE在减轻DNA损伤诱导的衰老中的作用（图2C）。我们还评估了CCFE是否可以增强这些依托泊苷诱导的衰老细胞的自噬流。作为自噬流分析的一部分，我们对Baf处理和未处理的lc3 -ⅱ表达水平进行了分析，结果表明，依托泊苷处理的细胞中自噬流受损，但CCFE处理可恢复自噬流（图2D）。为了研究CCFE对细胞衰老的抑制是否通过自噬介导，我们在自噬受损的siAtg5细胞中研究了CCFE的作用。在这些细胞中，CCFE对抗依托泊苷诱导的细胞衰老的能力降低（图2E）。综上所述，这些发现表明CCFE抑制细胞衰老并恢复骨骼肌细胞受损的自噬流。
图2 CCFE可抑制依托泊苷诱导的细胞衰老
3.CCFE改善了骨骼肌性能
用含0.1%或0.2% CCFE的饲料喂养18月龄小鼠3个月，以研究其对各种衰老表型和年龄相关骨骼肌损失的影响。在此期间对生存率进行监测。结果表明，ccfe喂养组在3个月期间表现出提高的生存率（图3A）。虽然最终体重没有显著变化，但在0.2% CCFE饮食喂养组中，观察到白色脂肪组织和肝脏的重量减少（图3B）。值得注意的是，CCFE还增加了腓肠肌质量，表明随着年龄的增长，身体成分有所改善。平板运动试验和握力试验评估骨骼肌质量和功能。CCFE喂养的小鼠表现出更强的跑步距离、时间和握力，特别是在0.2% CCFE饮食喂养的组（图3C）。0.2% CCFE饮食还降低了老年小鼠的MCP1和TNFα的血清水平（图3D）。进一步分析显示，在0.2% CCFE饮食喂养组中，CCFE降低了骨骼肌中Mcp1和Tnfα的mRNA表达（图3E）。CCFE还抑制了衰老相关蛋白如p53， p21和p16的表达（图3F），表明体内骨骼肌衰老的改善。
图3 CCFE改善老年小鼠骨骼肌功能，抑制细胞衰老
4.CCFE可减轻骨骼肌萎缩
为了研究CCFE对骨骼肌萎缩的影响，我们使用免疫荧光染色评估腓肠肌的横截面积。与21 M对照组相比，在0.2% CCFE饮食喂养组中观察到横截面积显著增加（图4A-C）。同时，CCFE降低了E3泛素连接酶MuRf1（调节泛素介导的蛋白降解）的蛋白表达，增加了肌生成相关标志物MyoD和Myf5的蛋白表达（图4D）。这些结果表明，CCFE通过降低E3泛素连接酶的活性来抑制蛋白质的过度降解。
图4 CCFE改善骨骼肌萎缩
5.CCFE可改善老年小鼠骨骼肌线粒体功能障碍
线粒体功能障碍是衰老的标志，由于ATP生成减少，导致氧化应激增加和运动能力降低。因此，我们测定了离体EDL肌纤维的OCR，以研究CCFE对线粒体功能下降的预防作用。在以0.2% CCFE饮食喂养的老年小鼠中，基础和最大呼吸能力均显著增加（图5A，B）。此外，我们对从腓肠肌分离的线粒体进行了电子流分析，以阐明CCFE对线粒体功能的影响。将线粒体依次暴露于鱼藤酮、琥珀酸盐、抗霉素A和抗坏血酸（与TMPD），以及丙酮酸盐、苹果酸盐和FCCP，测定OCR。在琥珀酸盐和抗坏血酸存在的情况下，CCFE增加了基础OCR和OCR，分别表明复合物II和IV呼吸增强（图5C，D）。此外，在0.2% CCFE饮食喂养的小鼠中，线粒体复合基因的mRNA水平增加（图5E）。老年人骨骼肌切片的透射电镜分析显示存在异常线粒体。然而，补充CCFE改善了线粒体异常（图5F）。这些结果表明，CCFE通过改善线粒体呼吸和减少受损线粒体的积累来增强骨骼肌功能。
图5 CCFE可改善老年骨骼肌线粒体功能
6.CCFE恢复了老年小鼠骨骼肌的自噬流6
为了验证CCFE是否调节老年肌肉的自噬流，我们评估了LC3和p62的蛋白表达。LC3和p62蛋白水平在老年骨骼肌中增加，而年轻组和ccfe喂养组的蛋白水平相对低于老年对照组（图6A）。此外，TEM图像显示，老年小鼠中自噬小体的丰度高于年轻小鼠和0.2% CCFE饮食喂养组（图6B）。因为这些蛋白质的积累通常表明自噬流被阻断，因此我们研究了蛋白质水平的增加是由于自噬激活还是自噬流被抑制。在年轻和老年小鼠中，我们使用自噬小体-溶酶体融合抑制剂白细胞肽素（leupeptin）测定了自噬流。为了确定CCFE对老年骨骼肌自噬流的恢复作用，我们通过比较LC3-II在没有和有leupeptin的情况下检测了CCFE喂养组的自噬流。用白细胞肽处理后，CCFE显著增加了lc3 -ⅱ水平，提示CCFE恢复了自噬流（图6C）。我们还检测了AMPK活性，结果表明CCFE显著增强了老年骨骼肌中AMPK和ULK1 （Ser317）的磷酸化，与体外结果一致（图6D）。
图6 CCFE恢复了老年骨骼肌的自噬流
7 CCFE通过抑制EP300乙酰转移酶活性恢复自噬流
C. crenata花有一种独特的香味，推测是由多胺的存在引起的。我们检测了CCFE中这些化合物和鞣花酸的含量，鞣花酸已经通过UPLC-MS/MS进行了鉴定。结果表明，CCFE含有大量鞣花酸和多胺，如亚精胺、精胺和尸胺（图7A）。先前的研究表明，亚精胺可以通过抑制EP300乙酰转移酶活性来激活自噬。因此，我们研究了CCFE是否通过抑制EP300的活性来增强自噬。CCFE显著降低了EP300的活性，类似于EP300抑制剂漆树酸（图7B）。CCFE还抑制了由EP300激活剂CTB诱导的H3在Lys 56的乙酰化（图7C）。EP300通过直接乙酰化自噬相关基因[24]抑制自噬。与此同时，我们利用免疫共沉淀的方法研究了CCFE对自噬相关基因乙酰化的抑制作用。CTB处理增加了自噬相关蛋白Atg5的乙酰化，而CCFE恢复了乙酰化Atg5的水平，提示CCFE抑制了ep300诱导的Atg5的乙酰化（图7D）。在衰老过程中，已知骨骼肌中的蛋白质乙酰化会增加。我们假设CCFE通过抑制自噬相关蛋白的乙酰化来恢复自噬。我们使用乙酰化赖氨酸抗体证实了乙酰化蛋白的存在，并注意到在ccfe喂养的小鼠中，通常随年龄增加而增加的蛋白质乙酰化显著减少（图7E）。此外，在老年骨骼肌中升高的Atg5乙酰化水平被CCFE显著降低（图7F）。这些结果表明，CCFE通过抑制自噬相关基因的乙酰化和调节AMPK活性来恢复自噬。
图7 CCFE通过抑制EP300活性恢复自噬活性
8.补充CCFE可增强体内多胺代谢并增加尿磷脂浓度
随着年龄的增长，骨骼肌中多胺尤其是亚精胺的含量逐渐减少，参与多胺代谢的酶mRNA表达发生改变。测定多胺的浓度和相关酶的表达水平。UPLC-MS/MS结果显示，补充CCFE提高了肝、肾和血清中的多胺浓度（图8A）。此外，CCFE增强了调节多胺代谢的Srm和Sat1的mRNA表达（图8B）。这些结果表明，CCFE提高了精胺和精胺水平，从而改善了多胺代谢。在ccfe喂养组中，血清、肝脏和肾脏的尿石素A和C水平显著升高（未检测到尿石素B）（图8C）。这些结果表明，CCFE改善了多胺代谢，鞣花酸及其代谢产物可能有助于CCFE的健康寿命延长效应。
图8 CCFE的补充改善了多胺代谢，增加了鞣花酸的代谢产物尿石蛋白
结论
综上所述，CCFE通过预防线粒体功能障碍和恢复自噬流来抑制老年小鼠骨骼肌衰老。CCFE通过调节AMPK和EP300乙酰转移酶的活性来增强自噬。这些结果提示CCFE具有作为延长健康寿命和缓解肌肉减少症的治疗药物的潜力，为未来的临床试验提供了基础。
Park SH, Choi PG, Kim HS, Lee E, Lee DH, Kim MJ, Kim D, Seo HD, Hahm JH, Jeon TI, Huh YH, Ahn J, Ha TY, Jung CH. A Natural Autophagy Activator Castanea crenata Flower Alleviates Skeletal Muscle Ageing. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2025 Feb;16(1):e13710. doi: 10.1002/jcsm.13710.
