细胞焦亡是一种程序性坏死性细胞死亡（PCD）方式，由gasdermin家族成员（GSDMs）如GSDME介导。这是一种很有前景的抗癌方法。值得注意的是，GSDME是细胞凋亡和焦亡之间转换的关键调节剂。然而，GSDME在包括肺腺癌在内的多种恶性肿瘤中表达下调。
2025年1月18日，中国科学院昆明植物研究所植物化学与天然药物重点实验室赵逾涵团队联合云南大学化学科学与工程学院严胜骄团队在J Adv Res在线发布题为“A novel small molecule NJH-13 induces pyroptosis via the Ca2+ driven AKT-FOXO1-GSDME signaling pathway in NSCLC by targeting TRPV5”的文章。通过DARTS-MS鉴定出TRPV5是NJH-13的直接靶点，NJH-13通过蛋白激酶B (AKT)/叉头框转录因子O1 （FOXO1）信号通路增强GSDME的转录。
•细胞焦亡诱导剂（NJH-13）通过靶向TRPV5触发gsdme介导的细胞焦亡。
•TRPV5的激活导致钙超载和氧化应激，导致细胞焦亡。
•FOXO1是gsdme介导的细胞焦亡的正向调节因子。
•三次注射NJH-13大大降低体内肿瘤生长。
摘要
本研究筛选出一个含n杂环NJH-13，并鉴定其具有激活GSDME的能力，从而触发NSCLC细胞的焦亡。通过DARTS策略，瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员5 （TRPV5）被确定为NJH-13的潜在靶点。NJH-13增加细胞内钙离子水平和触发氧化应激，这两者都是导致GSDME介导的细胞焦亡的关键事件。机制上，NJH-13通过蛋白激酶B (AKT)/叉头框转录因子O1 （FOXO1）信号通路增强GSDME的转录。ChIP显示FOXO1直接结合GSDME的启动子区域，从而触发GSDME介导的细胞焦亡。药理和遗传激活AKT或抑制FOXO1可部分挽救njh -13诱导的焦亡细胞。此外，NJH-13治疗抑制体内肿瘤生长。综上所述，我们的研究结果揭示了TRPV5是调控细胞焦亡的一个独特靶点，并提供了NJH-13作为一种潜在的抗癌药物能够触发NSCLC细胞的焦亡的证据。
1.NJH-13诱导肺癌细胞焦亡
为了从含有 1043 种化合物的药用植物源性和天然杂环化合物库中鉴定潜在的细胞焦亡诱导剂，进行了 MTT 测定和活细胞成像。NJH-13（图1A）被鉴定为具有与焦亡细胞死亡相关的典型形态变化。NJH-13 抑制 H1975 (IC 50 = 3.72 ± 0.06 µM) 和 H1299 (IC 50 = 6.23 ± 0.19 µM) 细胞的细胞活力，而其在正常人支气管上皮细胞系 BEAS-2B 中的IC 50值 (IC 50 = 20.95 ± 0.61 µM）要大得多（图 1B）。NJH-13优先靶向肺癌细胞。在用NJH-13处理的癌细胞中观察到的形态变化包括细胞质肿胀并出现大气泡、膜破裂和溶解性细胞死亡（图1C），表明NJH-13诱导坏死性细胞死亡。为了进一步证实 NJH-13 介导的细胞死亡类型，用 Hoechst 33342/PI 或膜联蛋白 V/PI 对 H1975 和 H1299 细胞进行染色。PI荧光强度的增强表明NJH-13诱导的细胞死亡伴随着膜完整性的丧失（图1D、E）。此外，LDH检测分析表明NJH-13促进LDH释放（图1F、G）。然而，没有焦亡形态（图1C)或在用相同剂量的NJH-13处理的BEAS-2B细胞中检测到LDH释放(图1H )。此外，ELISA结果表明，NJH-13触发了IL-18和IL-1β的释放（图1I、J），这是通常在细胞焦亡中检测到的两种促炎细胞因子。焦亡是由 GSDM 家族成员通过相应的 caspase（如 caspase-1、-4、-5 和 -11）裂解成活性 N 末端 GSDM 后执行的。如图1K所示， NJH-13增加了裂解的caspase-3和N-GSDME的蛋白质水平，这可以被泛caspase抑制剂z-VAD-FMK（z-VAD，图1K）。NJH-13 诱导的细胞死亡可被 z-VAD 部分挽救，但不能被坏死性凋亡抑制剂 necrostatin-1 (necro-1) 挽救（图 1 L-N）。GSDMD 和 GSDME 是经过充分研究的焦亡刽子手。NJH-13 以剂量和时间依赖性方式诱导 caspase 3 和 GSDME 裂解（图 1 O-R）。H1975 和 H1299 细胞中 GSDME 的敲低挽救了 NJH-13 诱导的焦亡细胞（图 1S-U），表明 GSDME 是 NJH-13 引发的细胞焦亡的执行者。这些数据表明 NJH-13 诱导的细胞焦亡是由 caspase-3 和 GSDME 介导的。
图1 . NJH-13 通过 caspase-3/GSDME 途径诱导 NSCLC 细胞焦亡
2.鉴定 TRPV5 作为 NJH-13 的假定细胞靶标
为了揭示 NJH-13 诱导 NSCLC 细胞系焦亡的细胞靶点，进行了 DARTS。银染结果和蛋白质印迹结果表明，瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员5（TRPV5）在NJH-13孵育后表现出较高的稳定性（图2A -C），表明TRPV5是NJH-13潜在的靶蛋白 。此外，细胞热位移测定（CETSA）的结果证实了TRPV5在NJH-13处理的细胞中具有更高的热稳定性。如图2D、NJH-13 提高了 TRPV5 在 37-53 °C 温度范围内的热稳定性。通过分子对接分析进一步探索了 NJH-13 与 TRPV5 的结合口袋。我们的计算机结果表明，NJH-13 在 TRPV5 中占据了与 PI(4,5)P2 类似的结合袋，对 NJH-13 的结合亲和力为 –7.8 kcal/mol，对 NJH-13 的结合亲和力为 –6.7 kcal/mol。PI(4,5)P2 的摩尔数 (图 2E 和 F）。TRPV5通过氢键参与稳定NJH-13的结合，类似于内源配体PI(4,5)P2的方式。为了研究 TRPV5 是否介导 NJH-13 诱导的焦亡，使用小干扰 RNA (siRNA) 敲低 TRPV5。TRPV5 的敲低导致细胞活力降低，表明 TRPV5 有助于 NJH-13 诱导的焦亡细胞死亡（图 2G-I）。此外，TRPV5 与肺癌患者较差的预后相关（https://www.kmplot.com）。在TRPV5高表达队列中，患者的中位生存期为56.5个月，而TRPV5低表达队列中患者的中位生存期为80.0个月（图2J）。这些数据表明，NJH-13 诱导的焦亡可能有益于 TRPV5 高表达水平的患者。
图2 . NJH-13 通过靶向 TRPV5 诱导细胞焦亡
3.NJH-13 通过 Ca 2+超载诱导的 ROS 积累诱导细胞焦亡
TRPV5 是钙选择性 TRP 通道，介导 Ca 2+流入细胞。用NJH-13处理细胞后，细胞内Ca 2+水平显著增加（图3A）。Ca 2+螯合剂 EGTA 有效抑制 Ca 2+的增加并挽救 NJH-13 诱导的细胞焦亡（图 3 B-G）。同样，细胞内 Ca 2+螯合剂 BAPTA-AM 减弱了 NJH-13 诱导的焦亡细胞死亡（图 3 E-G）。因此，Ca 2+过载是 NJH-13 诱导的细胞焦亡的关键触发事件。钙信号传导和 ROS 信号传导之间存在相互作用。ROS 的作用得到了进一步研究。ROS 与 NAC 的螯合显著减少了 NJH-13 诱导的细胞死亡（图 3 H-K）。当细胞用 NJH-13 和 NAC 处理时，裂解的 caspase-3 和 N-GSDME 的蛋白水平也降低（图 1 K）。此外，细胞内ROS水平被EGTA显著抑制（图3L、M），表明当用NJH-13处理细胞时，钙的增加先于ROS积累。为了研究Ca 2+超载是否导致NJH-13诱导的细胞焦亡中mtROS积累，用MitoSOX检测mtROS水平。NJH-13 促进 mtROS 积累，通过与 EGTA 和 NAC 一起孵育可有效防止 mtROS 积累（图 3N）。这些结果表明NJH-13通过激活TRPV5增加Ca 2+水平，导致Ca 2+增加刺激mtROS产生，导致线粒体功能障碍。
图3 . NJH-13 通过 Ca 2+和 ROS 过载触发细胞焦亡
4.NJH-13 通过 AKT/FOXO1 信号通路诱导细胞焦亡
为了进一步研究 NJH-13 调节焦亡的分子机制，进行了 RNA-seq 分析。NJH-13和DMSO处理的细胞之间总共有4511个mRNA上调，3981个mRNA下调（图4A）。值得注意的是，胰岛素抵抗和磷脂酰肌醇信号系统在 NJH-13 诱导的焦亡中发挥作用（图 4B）。蛋白激酶B（PKB或AKT）在细胞存活、生长和死亡中发挥着至关重要的作用，包括铁死亡和焦亡。NJH-13 处理减弱了 AKT 的磷酸化（图 4C）。为了探讨NJH-13是否通过AKT信号通路调节焦亡，在H1975中将AKT激活剂SC79与NJH-13一起使用。SC79 挽救了 NJH-13 诱导的焦亡细胞死亡，如 GSDME 裂解减少、膜破裂减少和 IL-18 释放减少所证明（图 4 D-I ）。一致地，用组成型活性 AKT DD (AKT T308D、S473D ) 转染的细胞也减少了 NJH-13 处理后的细胞死亡 (图 4 J-N)。这些数据表明 AKT 在 NJH-13 诱导的细胞焦亡中发挥关键作用。
图4 . NJH-13 通过 AKT 抑制诱导细胞焦亡
叉头盒 O1 (FOXO1) 是一种重要的 PI3K-AKT 下游效应子，是介导许多细胞过程的转录因子，包括氧化应激、细胞凋亡和 DNA 修复，似乎是肺癌的治疗靶点。AKT 对 FOXO1 进行磷酸化，将 FOXO1 保留在细胞质中并抑制 FOXO1 的功能。FOXO1 的下游基因 MAFF 在 NJH-13 处理后上调（图 4 A）。此外，FOXO1 据报道可以反式激活 GSDMD 。为了进一步研究 FOXO1 轴在 NJH-13 触发的细胞焦亡中的作用，检查了FOXO1、MAFF、GSDMD和GSDME的 mRNA 表达水平。如图所示图5A，NJH-13在转录水平MAFF和GSDMD有趣的是，GSDME 的 mRNA 水平也上调。NJH-13 减弱了 FOXO1 的磷酸化（图 5 B 和 C）。H1975 细胞中 FOXO1 的磷酸化状态和 N-GSMDE 水平的增加被 z-VAD、SC79、EGTA 和 NAC 逆转（图 5 C）。GSDME的 mRNA 水平，并部分挽救了 NJH-13 介导的细胞焦亡（图 5 D-I ）。为了研究 FOXO1 是否可以直接反式激活 GSDME，进行了 ChIP 测定。使用 JASPAR 数据库 ( https://jaspar.genereg.net），预测了GSDME启动子区域中潜在的FOXO1结合元件（图5 J）。ChIP 分析显示内源性 FOXO1 占据了GSDME基因的 +543 ∼ +703 bp 启动子区域（图 5 K-M）。双荧光素酶测定证实了 NJH-13 激活的 FOXO1 对 GSDME 的反式激活（图 5 N）。这些数据表明 NJH-13 触发的细胞焦亡是通过 FOXO1 反式激活 GSDME 介导的。
图5 NJH-13 通过 FOXO1/GSDME 信号通路诱导细胞焦亡
5.NJH-13 延缓体内肿瘤生长
在 H1975 异种移植肿瘤中评估了 NJH-13 的体内抗肿瘤作用。与对照组相比，仅三个剂量的 NJH-13 (10 mg/kg) 就肿瘤重量和肿瘤体积而言有效抑制了肿瘤生长（图 6 A-E ）。NJH-13治疗的肿瘤中Ki-67的水平也降低（图6F）。在 NJH-13 处理的肿瘤中观察到裂解的 caspase-3 和 N-GSDME 水平上调，以及 p-AKT 和 p-FOXO1 水平下调（图 6G、H 和 S6G）。NJH-13对主要器官没有表现出明显的毒性，并且没有改变小鼠的体重（图6I、J )。这些结果表明，只有三个剂量的 NJH-13 可能通过 caspase 3/GSDME 介导的细胞焦亡有效抑制 H1975 异种移植肿瘤的生长。
图6 . NJH-13在体内延缓肿瘤生长
结论
总的来说，我们认为 NJH-13 是诱导焦亡作为 NSCLC 治疗策略的有前途的候选者。NJH-13 通过靶向 TRPV5 触发 GSDME 介导的细胞焦亡。从机制上讲，NJH-13 扰乱钙稳态，通过 AKT/FOXO1/caspase-3/GSDME 信号通路导致 ROS 介导的细胞焦亡。FOXO1直接占据GSDME的启动子区域并上调GSDME以促进细胞焦亡。我们的研究结果强调 TRPV5 作为诱导细胞焦亡的潜在治疗候选者，而 FOXO1 作为 GSDME 表达的关键调节机制，这为肺癌治疗提供了线索。
