麦角硫因（ET），是一种含硫氨基酸，具有独特的结构和功能，它具有抗氧化、抗衰老、抗炎、细胞保护等作用，主要存在于蘑菇（如香菇、杏鲍菇）、动物肝脏、肾脏以及某些豆类中，人体无法自行产生麦角硫因，因此必须通过食物摄入来满足生理需求。尽管多项研究表明麦角硫因具有抗衰老、促进健康的特性，但尚不清楚其潜在的作用机制。
2025年1月21日，德国莱布尼茨分析科学研究所Milos R. Filipovic团队在 Cell Metabolism（IF 27.7）上发表了题为"Ergothioneine improves healthspan of aged animals by enhancing cGPDH activity through CSE-dependent persulfidation" 的研究论文。揭示存在于某些大型真菌（例如平菇、香菇）中的天然化合物麦角硫因（ergothioneine）能够提高老年动物的寿命和健康寿命。 证实了麦角硫因可作为胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine γ-lyase，CSE）的替代底物。该酶在气体信号分子硫化氢（H₂S）的产生中发挥核心作用，而 H₂S 通过巯基化修饰（Persulfidation）保护细胞免受氧化应激。
摘要
麦角硫因 (ET) 是一种膳食硫酮/硫醇，因其对健康衰老和代谢恢复能力的潜在益处而受到越来越多的关注。我们的研究调查了 ET 对老年动物健康寿命的影响，揭示了秀丽隐杆线虫的寿命延长和活动能力增强，同时伴随着抗应激能力的提高和与年龄相关的生物标志物的减少。在老年大鼠中，给予 ET 可增强运动耐力、肌肉质量和血管化，同时肌肉中 NAD +水平更高。从机制上讲，ET 作为cystathionine gamma-lyase (CSE) 的替代底物，刺激 H2S 的产生，可增加 300 多个蛋白质靶标的蛋白质过硫化。其中，蛋白质过硫化驱动的胞浆甘油-3-磷酸脱氢酶 (cGPDH) 激活主要有助于 ET 诱导的 NAD +增加。ET 的作用在缺乏 CSE 或 cGPDH 的模型中被消除，突出了 H2S 信号传导和蛋白质过硫化的重要作用。这些发现阐明了 ET 的多方面作用，并深入了解其对抗与年龄相关的肌肉衰退和代谢紊乱的治疗潜力。
1.ET提高了线虫的寿命和健康状况
麦角硫因 (ET)（图 1 A）是一种天然存在的硫醇化合物，存在于真菌和放线菌等饮食来源中，已成为促进健康衰老和提高代谢弹性的有前途的候选者。我们首先测试了 ET 对线虫寿命的影响。从成年第 1 天（D1）开始用 5 mM ET 治疗导致中位寿命显著延长。即使将浓度降低至 450 μM，我们仍然可以观察到中位寿命和最大寿命都有小但显著的延长（图 1 B）。线虫表现出与年龄相关的殴打性能下降，450 μM ET 使这些比率保持在相当高的水平，即使在第 10 天的成年人 (D10) 中也是如此（图 1 C）。因此，我们重点关注衰老过程中 ET 对健康寿命参数的影响。ET 治疗提高了 D10 成虫对 H2O2、百草枯、亚砷酸盐和热应激的抵抗力（图 1 D），这表明即使在老年动物中，整体健康寿命也有好处。通过蓝色、绿色和红色波长自发荧光测量，肠道自发荧光（有时称为脂褐质或“老年色素”）与年龄相关的增加在 ET 治疗的动物显著降低（图 1 E）。线粒体结构退化是线虫衰老的一个重要标志。我们比较了在体壁线粒体中表达 GFP 的 SJ4103 [Pmyo-3::mitoGFP] 动物的线粒体网络，观察到与未经治疗的老年动物相比，ET 治疗会产生更少的碎片和更长的线粒体（图 1 F），这这可以解释 ET 对运动能力的强烈影响。
为了了解 ET 的寿命/健康维持机制，我们对 D4 和 D10 成虫进行了全局蛋白质组和转录组分析。已知衰老会诱导线虫中强烈的蛋白质组和转录组重塑, 因此，令人惊讶的是，发现极少数目标发生显著变化（蛋白质组的变化为±1.5倍，蛋白质组的变化为±2倍）转录组分析的变化）响应 ET 治疗，转录组-蛋白质组数据集之间没有重叠（图1G、1H）。总之，这些数据强烈表明 ET 的作用不是由转录和翻译调节引起的，而很可能是由蛋白质的翻译后修饰引起的。应用双甲酮开关方法进行过硫组学分析，并比较了未经处理和 ET 处理的 D10 蠕虫中的 PSSH 水平。与整体蛋白质组和转录组的情况不同，我们发现在 ET 处理的线虫中， 种内源性过硫化蛋白质中 >300 种的 PSSH 水平显著增加（图 1 I）。这些蛋白质在线粒体电子传递过程、细胞氧化还原稳态和胚胎发生以及脂肪酸和 3-磷酸甘油 (G3P) 代谢等翻译和代谢过程中发挥作用（图 1 J）。
图1 ET提高了线虫的寿命和健康状况
2 麦角硫因是CSE产生H2S的底物
使用热蛋白质组分析来识别 MEF 中 ET 的潜在结合靶点（图 2 A）。少数蛋白质对 ET 处理有显著的热变化响应。其中，CSE 是唯一可以解释 PSSH 效应的靶标（图 2 A）。事实上，等温剂量反应实验证实了 ET 与 CSE 的相互作用。CSE是三种主要的H2S产生酶之一。用 ET 处理 MEF 导致细胞内 H2S 水平增加（图 2 B）。正如预期的那样，CSE 敲除细胞显示 H2S 产生显著受损，并且 ET 的添加不会改变 H2S 水平（图 2 B），证实 ET 诱导的 H2S 产生受 CSE 控制。为了了解 CSE 结构中 ET 可以结合的位置，我们使用 SeamDock 对 CSE-ET 相互作用进行了计算机预测。我们发现 ET 结合在酶的活性位点口袋中，其结合亲和力类似于其最优选的底物胱硫醚（ET 为 5.8 kcal/mol，而胱硫醚为 5.5 kcal/mol；图 2 C）。通过将 CSE 与单独的 ET 或与半胱氨酸一起孵育，评估了人重组 CSE 消耗 ET 并产生 H2S 的能力（图 2D）。当 ET 存在时，H2S 的产生更快、更多，并且 ET 单独产生 H2S，这证实了 (1) ET 是 CSE 的替代底物，并且 (2) 它不会抑制半胱氨酸产生H2S。使用竞争性双底物方程来估计 CSE 催化 ET 形成 H2S 的动力学参数，我们可以估计反应的Vmax和 Km（图 2 E）。当V最大ET 和半胱氨酸之间没有差异，Km显著低于半胱氨酸观察到的值。
从机理上讲，该反应必须由磷酸吡哆醛 (PLP) 催化（图 2 F），它是 CSE 催化反应的主要辅助因子。反应混合物的 MS 分析表明，反应通过最初形成甲醇胺加合物（m/z 477.1244）进行，该加合物通过失水形成希夫碱（图 2 F）。接下来，我们通过1 H NMR 在200 μM ET 处理的 WT 和 CSE −/− MEF 细胞中监测该反应如何影响细胞中 ET 水平。我们观察到，在 WT 细胞中发现的 ET 较少，这符合我们的假设，即 CSE 在其代谢/消耗中发挥着核心作用（图 2 G）。此外，ET 处理不会影响同型半胱氨酸和胱硫醚的水平，但可以观察到细胞内半胱氨酸水平显著升高，与ET 的K m较低一致（图 2 H）。为了确认 ET 脱硫在秀丽隐杆线虫中也以 CSE 依赖性方式发生，我们采用了基质辅助激光解吸/电离成像 MS。我们可以清楚地看到，产物形成是 N2 蠕虫中观察到的一个特征，而不是cth-1突变体中观察到的特征（图 2 I）。总而言之，这些数据强烈表明 ET 的有益效果取决于 CSE 的消耗和 H2S的产生。
图2 麦角硫因是CSE产生H2S的底物
3. ET 治疗的寿命和健康益处取决于 CSE
根据这些观察结果，我们重新评估了 ET 对秀丽隐杆线虫的影响。考虑到海西宁也通过相同的转运蛋白转运到细胞中（尽管效率较低），我们测试了海西宁的作用。我们观察到线虫的寿命或健康寿命没有显著改善（图 3 A-3C）。这强化了 ET 带来图 1中所观察到的好处的主张。接下来，我们分析了 ET 对 CSE ( cth-1 ) 突变体的影响。显而易见，与 WT N2 菌株相比（图1B 和 1C），ET 处理并未影响线虫的寿命和运动能力（图 3D和 3E） 。此外，在对 WT 蠕虫进行的应激试验中观察到的 ET 保护作用在cth-1突变体中完全消失（图3F 和 3G）。这与我们之前的观察结果一致，即 PSSH 水平越高，对压力源的抵抗力越好。H 2 S 可以充当电子传输链 (ETC) 的电子供体，也可以充当复合物 IV 的强大抑制剂。因此，我们评估了用 ET 处理的 WT 和 CSE −/− MEF中的线粒体呼吸（图 3 H）。ET 处理导致最大呼吸（图 3 I）、线粒体呼吸（基础细胞呼吸减去非线粒体呼吸；图 3 J）和 WT 细胞的 ATP 产生增加（图 3 K）。储备呼吸能力（RRC；最大呼吸减去基础呼吸）也增加了两倍（图 3 L）。所有这些影响在 CSE −/−细胞中都被消除，其中 ET 要么没有影响，要么甚至降低了量化参数（图 3 H-3L）。有趣的是，ET 治疗后细胞外酸化率 (ECAR) 保持不变（图 3 M）。
当能源需求超过正常水平时，RRC 可以介入增加供应，防止“ATP 危机”。较高的 RRC 水平与提高细胞存活率有关，而较低的 RRC 水平与细胞死亡和疾病有关。接下来我们监测了 ET 处理对细胞生长的影响。无论培养基中的胱氨酸水平如何，为了为 CSE 提供底物，ET 以浓度依赖性方式增加细胞生长，并且这种效应在 CSE −/− MEF 中完全消除（图 3 N）。在人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 中也可以观察到类似的效果，其中 CSE 的沉默消除了 ET 对细胞生长的有益影响（图 3O）。ET 刺激 HUVEC 细胞生长的能力（图 3 O）也通过其更大的发芽潜力得到证实（图 3 P）。这与最近的研究一致，该研究还表明，H 2 S 以某种方式刺激内皮细胞中的 NAD +水平，类似于 NAD 前体烟酰胺单核苷酸 (NMN)，以防止血管老化。
图 3 ET 治疗的寿命和健康益处取决于 CSE
4 麦角硫因通过引起3-磷酸甘油脱氢酶过硫化来增加NAD+水平并改善肌肉健康
为了了解 ET 治疗是否影响 NAD +水平，我们首先观察衰老的秀丽隐杆线虫。正如之前报道的，虽然衰老导致 NAD +下降，但ET 治疗显著提高了这些水平（图 4 A）。同样，用 ET 处理 MEF 细胞会导致 NAD + /NADH 水平呈浓度依赖性增加（图 4 B）。我们设计了一项实验，其中 9 个月大的雄性大鼠（Rattusnorvegicus）在饮用水中加入 20 mg/kg ET 治疗 3 周（图 4c) 然后进行运动耐力测试。ET 治疗的大鼠跑到力竭的时间和距离大约是其两倍（图 4 C）。为期 3 周的 ET 治疗还导致肌肉质量（腓肠肌）显著增加（图4D ），并降低运动后血清和肌肉乳酸水平（图4E）。最重要的是，治疗导致肌肉组织中NAD + /NADH 水平显著增加（图 4 F）。我们观察到 ET 刺激 HUVEC 生长和发芽时（图 3O和 3P），我们比较了肌肉组织切片的血管化。观察到每根肌纤维的血管总数明显增加（图4G）。
骨骼肌的维护和修复依赖于休眠的肌肉干细胞（MuSC），它们在肌肉损伤后变得活跃，增殖并产生专门的肌肉细胞，促进受损肌纤维的再生。为了监测 ET 治疗对 MuSC 数量的影响，我们用配对盒蛋白 Pax-7 (PAX-7) 抗体（一种已知的 MuSC 标记物）对肌肉组织切片进行染色。我们的数据显示 ET 治疗后 MuSC 数量增加（图 4H)，并且它们还显示出更高的线粒体输入蛋白 Tom 20 表达水平（图 4 I）。在 ET 治疗大鼠的肌肉组织中观察到高电子密度线粒体（图 4 J），这是高活性线粒体的特征。胞浆 (cGPDH) 和线粒体 (mGPDH) 两种酶维持这种穿梭，其中 cGPDH 的反应产生 NAD +（图 4 K）。对 ET 处理的线虫进行过硫组分析确实发现该通路显着富集（图 1J)并且cGPDH同工型(GPDH2)的PSSH水平显着更高。
使用双甲酮开关方法进行过硫化物标记，我们还观察到 ET 处理诱导大鼠肌肉中 GPDH 的过硫化显著增加（图 4 L）。随后 G3P 水平增加，这表明 GPDH 的 PSSH 可能会增加酶的活性（图 4 M）。我们将 cGPDH 与不同浓度的 Na2S2一起孵育并测量酶活性（NADH 到 NAD +的转化）添加二羟基丙酮磷酸盐作为底物后）。我们观察到，二硫键与蛋白质的比例高达 1:1 会导致酶活性显着增加（未处理的k obs = 1.8 × 10⁻ 3 s -1 ，而过硫化的 k obs = 3.6 x 10 -3 s -1） ，而较高的比率（预计修饰多个半胱氨酸）并未显着影响活性（图 4 N）。为了确定哪个半胱氨酸正在发生过硫化，我们对样品进行了液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析。我们的数据表明，半胱氨酸 243 是蛋白质过硫化的主要目标（图 4O）。分析人 GPD 的晶体结构，很明显，位于 β 链开头的 C243 是表面暴露的（图 4 P），因此很容易用于反应。尽管远离活性位点 K204（图 4 P），但对远处区域的突变研究已表明可以改变催化环 292-297 的构象，从而导致 GPD 活性增加。事实上，当我们评估未经治疗和 ET 治疗的大鼠肌肉组织裂解物中 cGPDH 的活性时（实验需要完全抑制线粒体呼吸以防止穿梭机 mGPDH 部分的贡献），我们可以检测到酶活性增加约 2 倍（图 4 Q 和 4R）。
图 4麦角硫因通过引起 3-磷酸甘油脱氢酶过硫化来增加NAD+水平并改善肌肉健康
结论
描述的 ET 的CSE-H2S-cGPDH-SSH-NAD +途径可以解释在大鼠中观察到的所有有益作用，包括增加血管化、肌肉质量和干细胞数量，以及改善线粒体形态和更好的身体耐力。虽然其中一些影响（例如线虫线粒体形态的改善）和大鼠以及 MuSC 计数）表明 ET 具有恢复活力的作用，短期 ET 暴露（5 天）观察到的性能改善效果意味着该途径诱导的代谢重塑也可用于增强性能。
通过揭示 ET 作用的分子复杂性，我们的研究为进一步探索其临床应用和治疗意义奠定了基础。未来的研究可能会探索 ET 在减轻与年龄相关的疾病和代谢紊乱方面的治疗潜力，重点是旨在利用其恢复活力的特性促进人类健康的转化方法。最后，最近报道的可食用菌丝体经过生物工程改造，可提高营养价值和 ET 水平，有望成为未来增加每日 ET 摄入量的潜在来源。
