糖尿病认知功能障碍（DCI）的患病率显著，有研究表明其与线粒体呼吸链稳态有关，但具体机制尚不明确。2-羟基异丁酸（2-hydroxyisobutyric acid, 2-HIBA）是一种新型短链脂肪酸，可调节线粒体疾病，在代谢性疾病的治疗中具有潜在应用价值。我们的目的是探索2-HIBA在线粒体呼吸链稳态中治疗DCI的一种新的作用机制。
2024年11月28日，哈尔滨医科大学药学院兰天/李水洁/王琦教授团队在Redox Biol在线发表题为“2-Hydroxyisobutyric acid targeted binding to MT-ND3 boosts mitochondrial respiratory chain homeostasis in hippocampus to rescue diabetic cognitive impairment”的文章。2-HIBA可透过血脑屏障，逆转海马NADH脱氢酶3 （MT-ND3）蛋白含量的下降，从而直接改善db/db小鼠的认知功能障碍。MT-ND3是改善糖尿病认知功能障碍的关键靶点，2-HIBA可直接结合MT-ND3蛋白，减轻小鼠线粒体呼吸链功能损伤，治疗DCI。
•2-羟基异丁酸保护（2-HIBA）神经元和线粒体免受高糖损伤。
•MT-ND3是2-HIBA改善糖尿病认知功能障碍的关键蛋白。
•2-HIBA进入糖尿病脑病小鼠的大脑并保护神经元。
•2-HIBA通过抑制ND3降解来治疗神经元线粒体氧化损伤。
•联合药用植物（葛根芩连汤，GQD）的2-HIBA激动剂可以改善认知障碍。
摘要
基于多组学分析，鉴定出患病小鼠血清中的代谢物质和差异活性代谢通路。采用nanoLC-Obitrap-MS技术检测小鼠海马和线粒体中差异代谢活性小分子含量，评估其通过血脑屏障（BBB）和线粒体外膜的通透性。结合行为学、蛋白质组学和分子生物学方法来探索特定的调控机制，并确定潜在的药理学靶点。此外，我们利用蛋白质热位移、药物亲和力反应靶点稳定性（drug affinity responsive target stability， DARTS）、水解酶稳定性和表面等离子体共振（surface plasmon resonance， SPR）等技术，证明了小分子代谢物与蛋白质靶点的直接结合作用。2-HIBA可透过血脑屏障，逆转海马NADH脱氢酶3 （MT-ND3）蛋白含量的下降，从而直接改善db/db小鼠的认知功能障碍。这一作用有助于维持NAD+/NADH的稳定，调节线粒体呼吸链平衡。2-HIBA联合植物药激动剂可增强MT-ND3的表达，从而改善小鼠的认知功能障碍。MT-ND3是改善糖尿病认知功能障碍的关键靶点，2-HIBA可直接结合MT-ND3蛋白，减轻小鼠线粒体呼吸链功能损伤，治疗DCI。
1. 发现一种对神经元细胞具有线粒体保护作用的小分子
我们通过分析db/db糖尿病认知障碍小鼠血浆中的代谢产物发现了2-HIBA（图1）。差异分析显示，正常对照与对照组小鼠相比，在糖尿病脑病db/db小鼠中筛选出89个差异代谢物，其中21个上调，68个下调（图1A）。如图所示，检测到的前9个代谢物的差异程度最高。除了葡萄糖水平有显著差异外，我们还发现一些5 -羟色胺代谢物和短链脂肪酸（SCFAs）水平有显著变化（图1B）。这些产品大多与神经退行性疾病的发生和预防有关，进一步验证了糖尿病与神经退行性疾病之间的关系。其中，2-HIBA是肠道微生物产生的一种常见的小分子脂肪酸代谢产物，在体内产生，与代谢和疾病相关，尤其是代谢紊乱、糖尿病和线粒体功能障碍。目前尚无关于2-HIBA神经保护作用的相关报道；然而，最近的研究表明其对线粒体呼吸链的影响。也调节内环境稳态和活性氧簇（ROS）的生成。首先，我们探索了2-HIBA对线粒体的保护作用。JC-1染色检测线粒体去极化。如图1C所示，高糖水平促进去极化线粒体细胞数量的增加（绿色），而2-HIBA处理逆转了这一趋势。同时，通过MitoTrack染色，在共聚焦显微镜下观察到，高糖水平导致线粒体数量和荧光强度显著下降，给予2-HIBA后，线粒体数量和荧光强度得到改善（图1D）。在体外高糖诱导的细胞损伤模型中，使用试剂盒检测线粒体NAD+/NADH比值和ATP生成，结果表明2-HIBA显著改善线粒体能量代谢稳态，由于NADH是一种强大的抗氧化剂[28]，它可以清除自由基，减缓氧化应激引起的神经细胞损伤。通过在荧光显微镜下观察ROS染色的荧光强度证实了这一点（图1E和F）。海马线粒体呼吸应激实验表明，2-HIBA逆转了高糖导致的基础和ATP产生的减少，显著增加了PC12细胞的最大呼吸（图1G和H）。这些结果表明，2-HIBA对高糖损伤的神经元细胞具有保护作用，并能维持其线粒体功能的稳态运行。
图1 2-羟基异丁酸（2-HIBA）具有线粒体保护作用
2. 2-HIBA可改善糖尿病及其认知功能障碍
采用巴恩斯迷宫检测小鼠认知记忆功能；高剂量和低剂量2-HIBA均能降低小鼠在迷宫中的潜伏期，增加其在目标象限的潜伏期比（图2B-D），表明2-HIBA以剂量依赖性方式极大地改善了糖尿病引起的认知功能障碍。筑巢测试（一种常用的行为学测试方法，观察和评估实验小鼠在个体喂养过程中的筑巢行为，以确定认知功能障碍的程度）获得了相同的实验结果。评分越低，小鼠的认知和行为功能越弱。此外，db/db小鼠的糖尿病症状改善，如给药6周后血糖的稳定下降所示，这些小鼠的体重没有变化（图2E）。并且在葡萄糖耐量和胰岛素抵抗实验中展示较高的血糖恢复能力和胰岛素敏感性（图2F）。2-HIBA成功降低了大脑海马组织中Tau蛋白的磷酸化水平（图2G）。值得注意的是，db/db小鼠神经元细胞中线粒体肿胀、损伤，数量减少。给予2-HIBA后恢复（图2H和I）。qRT-PCR结果显示db/db小鼠大脑中BDNF、NGF、SOD1水平降低，CAT水平升高（图2J）。同时检测脑组织中神经营养因子BDNF和NGF的含量。我们发现db/db小鼠大脑中的BDNF和NGF均显著减少，给药后均显著恢复（图2J-L）。此外，我们发现db/db小鼠大脑中的GSH含量明显降低（图2M），给药后这种现象得到逆转，这表明小鼠的大脑发生了过氧化和氧化损伤。
图2 2-HIBA可改善糖尿病db/db小鼠的认知功能障碍
为了验证这一假设，我们给有认知功能障碍的9周龄db/db小鼠注射2-HIBA。采用NanoLC-Obitrap-MS技术检测各组小鼠肝、肾、血清及海马组织中2-HIBA含量。结果显示，给药后，2-HIBA在小鼠各组织器官中的含量分布明显改善，其中2-HIBA在脑组织中的分布最为显著（图3A-E）。结果表明，2-HIBA可直接进入糖尿病脑病小鼠脑内发挥神经保护作用，其富集和发挥作用的主要部位是脑内海马组织。
图3 采用nanoLC-Obitrap-MS测定小鼠各器官组织中2-HIBA含量
3. MT-ND3是糖尿病认知功能障碍的关键蛋白
为了进一步研究2-HIBA改善糖尿病认知功能障碍的具体分子机制，我们对各组小鼠脑组织蛋白进行了蛋白质组学分析。共检测到107271个有效图谱（肽谱匹配（PSM））和6580个鉴定出的蛋白质组（图4A）。鉴定出差异表达蛋白后，进行GO/KEGG富集分析，对其功能进行描述(图4B)。在阿尔茨海默病（AD）、帕金森综合征和霍奇金综合征等神经退行性疾病相关的蛋白质中观察到显著差异。这些神经退行性疾病相关蛋白也在增加线粒体氧化磷酸化中发挥作用。其中，线粒体跨膜蛋白MT-ND3在各组与治疗组之间差异均有统计学意义；ND3的水平变化最显著（图4C）。此外，我们分析了Allen Brain Cell Atlas数据库中的单细胞测序，发现MT-ND3蛋白在海马齿状回细胞、小胶质细胞和血管细胞等细胞簇中高表达，提示MT-ND3可能是治疗糖尿病脑病的关键靶点（图4D）。蛋白质印迹法证实，糖尿病脑病小鼠给予2-HIBA后，蛋白质水平增加，并且这种变化具有剂量依赖性（图4E）。
我们观察到，当ND3表达降低时，PC12细胞中的线粒体功能稳态受到显著影响，表现为线粒体数量减少，能量供应减弱（图4F和G），以及ROS生成增加，类似于谷胱甘肽（GLU）引起的神经元损伤。NAD+/NADH和ATP含量测定表明，当ND3被敲低时，2-HIBA并没有恢复被高糖水平损伤的神经元的能量稳态，这一点通过海马中线粒体呼吸压力的测定得到了证实（图4H）。更重要的是，western blot结果显示，2-HIBA成功恢复了高糖诱导的ND3蛋白表达水平的下降，但当ND3被敲低时，2-HIBA未能恢复ND3蛋白的表达水平（图4I）。这些结果表明，抑制ND3的表达会破坏线粒体稳态，同时削弱2-HIBA对线粒体抗氧化损伤修复的保护作用，突显了其在维持线粒体稳定和修复氧化损伤中的关键作用。
图4 2-HIBA通过MT-ND3保护PC12细胞线粒体功能稳态
4. MT-ND3是2-HIBA改善糖尿病认知功能障碍的关键蛋白
为了进一步研究ND3作为2-HIBA蛋白靶点的意义，我们利用AAV-php病毒载体敲低了MT-ND3在认知障碍的db/db小鼠海马神经元中的表达。2-HIBA灌胃2周后，敲除组注射携带siRNA的病毒载体，NC组注射空病毒载体作为阴性对照（图5A）。在注射后21天，注射小鼠大脑冰冻切片的共聚焦显微镜显示，与对照组相比，病毒在小鼠的海马组织中携带荧光标记物（图5B）。证实AAV载体成功进入小鼠海马并抑制神经元细胞线粒体ND3蛋白的表达。Western blotting和qRT-PCR验证了敲低效率。治疗2周后，治疗组小鼠的血糖水平较模型组小鼠有一定程度的下降。然而，当注射AAV载体时，敲除组的血糖水平从第4周开始出现明显波动，而药物组和阴性对照组的血糖水平则没有明显波动（图5C）。在病毒注射后3周，各组小鼠与模型小鼠相比也表现出糖耐量受损和胰岛素敏感性下降（图5D）。这些结果表明，ND3敲低阻断了2-HIBA对高血糖和胰岛素抵抗的影响。
评估实验小鼠认知记忆行为的Barnes迷宫实验结果显示，2-HIBA成功改善了糖尿病脑病小鼠的认知功能障碍；然而，当敲低ND3蛋白时，2-HIBA的治疗效果减弱（图5E和F）。透射电镜结果显示，敲低组的脑神经元损伤程度与非给药模型组一致：神经元数量减少，神经元肿胀，突触减少（图5G）。检测海马组织线粒体供能功能；敲低ND3后，2-HIBA不能恢复NAD+/NADH和组织ATP水平。这些结果与体外细胞模型一致（图5H-J），表明ND3的敲低阻断了2-HIBA对模具诱导的线粒体能量供应功能稳定性的维持。与体外细胞模型一致，Western blot结果显示，2-HIBA成功恢复了高糖诱导的ND3蛋白表达水平的下降，但未能恢复ND3敲低时的表达水平。提示2-HIBA可能通过ND3蛋白的表达发挥代谢调节和神经保护作用。
图5 MT-ND3是糖尿病认知功能障碍的关键蛋白
5. 2-HIBA与MT-ND3直接相互作用，增加其蛋白稳定性
为了探究2-HIBA是否直接结合ND3发挥其药用作用，我们首先使用nanoLC-Obitrap-MS技术检测了从细胞和海马组织提取的线粒体中2-HIBA的含量。结果显示，给药后，在体内和体外模型中，线粒体中2-HIBA含量均显著增加（图6A），说明2-HIBA容易穿透线粒体外膜进入线粒体内部。鉴定小分子的细胞靶点在阐明其作用机制中起着关键作用。根据前期实验结果，我们推测2-HIBA可以与MT-ND3直接结合并发挥药效学作用。通过计算机预测，我们推测了一个结合位点的存在（图6B）。SPR实验进一步验证，固定在COOH芯片上的MT-ND3可以与2-HIBA结合，亲和力常数为4.35 mM（图6C）。此外，细胞热位移实验（CETSA）表明，2-HIBA显著保护MT-ND3免受温度依赖性变性，表明2-HIBA直接与ND3相互作用（图6D）。然后，我们探索了2-HIBA维持线粒体中ND3表达水平的原因。通过比较正常细胞加入2-HIBA前后ND3的蛋白表达水平，我们发现2-HIBA并未显著增加ND3的表达。推测2-HIBA通过影响ND3蛋白的降解而发挥其生物学功能。我们使用20 mmol/L的蛋白合成抑制剂放线菌酮抑制新合成的蛋白，发现GLUs显著加速了ND3的降解，而给予2-HIBA后，降解率显著降低，且呈时间依赖性（图6E）。DART实验结果表明，2-HIBA以浓度依赖性方式抑制pronase诱导的MT-ND3降解（图6F）。因此，我们推测2-HIBA通过影响ND3的降解来发挥其生物学功能。这些结果表明，2-HIBA与MT-ND3直接结合并提高其蛋白稳定性。
图6 MT-ND3是2-HIBA的直接靶点
6. 一种可以增加血清中2-HIBA含量的天然药用植物组合，对糖尿病脑病起到治疗作用
天然药用植物在治疗糖尿病及其并发症方面具有独特的优势。文献表明，葛根、黄芩、黄连、黄芪、人参等中药。治疗糖尿病脑病有明显疗效。根据网络药理学分析，可以得到以下结果。葛根、黄连能作用于线粒体呼吸电子传递链和线粒体膜电位，黄芩、川芎、甘草。可以改变线粒体膜的通透性并调节细胞凋亡。可联合加入葛根芩连汤，且研究表明GQD可显著改善糖尿病及其并发症疾病，因此我们选择GQD作为研究对象，探讨其与线粒体的关系。在本研究中，我们在口服GQD 6周后的小鼠中进行了行为学测试（图7B），发现GQD显著改善了9周龄db/db小鼠的认知功能障碍（图7C-E）和葡萄糖代谢障碍（图7F）。13C代谢组学研究通过三组之间的比较，共筛选出199个差异代谢物，且类型丰富，其中与神经保护相关的5-羟色胺、不饱和脂肪酸、短链脂肪酸在给药后显著增加（图7G）。在模型组和治疗组的比较中，共检测到45个差异代谢物，其中32个上调，13个下调(图P值最高的9种差异代谢物中有许多与血糖代谢性疾病和神经退行性疾病的改善相关（图7H）。乙酰乙酸可通过促进脑源性神经营养因子和抑制炎症[56]改善AD小鼠记忆。口服GQD显著逆转了db/db小鼠血清中2-HIBA含量的降低（图7H）。KEGG通路分析显示，GQD可以调节脂肪酸代谢等通路（图7I）。综上，我们推测GQD可能通过影响肠道微生物代谢物2-HIBA的产生水平，靶向糖尿病认知功能障碍小鼠海马中MT-ND3蛋白，延缓其降解，改善脑功能。线粒体能量代谢稳态最终有助于治疗糖尿病认知功能障碍。
图7 一种可治疗糖尿病认知功能障碍的药用植物组合
结论
MT-ND3是改善糖尿病认知功能障碍的关键靶点，2-HIBA可直接结合MT-ND3蛋白，减轻小鼠线粒体呼吸链功能损伤，治疗DCI。
Xie M, Gu S, Liu Y, Yang H, Wang Y, Yin W, Hong Y, Lu W, He C, Li L, Zhao L, Zhang J, Liu H, Lan T, Li S, Wang Q. 2-Hydroxyisobutyric acid targeted binding to MT-ND3 boosts mitochondrial respiratory chain homeostasis in hippocampus to rescue diabetic cognitive impairment. Redox Biol. 2024 Nov 28;79:103446. doi: 10.1016/j.redox.2024.103446.
