脂肪肝和胰岛素抵抗等代谢性疾病在全球范围内迅速增加，成为公共卫生领域的一大挑战。固醇及其衍生物在调节脂质代谢中扮演重要角色，然而，它们如何影响代谢综合征的机制尚不明确。ES (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol)是一种结构与胆固醇或植物甾醇相似的甾醇，是食用菌中重要的生物活性化合物。广泛分布于双孢蘑菇、香菇、牛肝菌、平菇块茎属植物中。
2025年1月10日，中国药科大学多靶标天然药物全国重点实验室李萍/杨华/郑祖国团队联合兰州大学戴建业团队在Cell Reports发表了题为“Ergosterol alleviates hepatic steatosis and insulin resistance via promoting fatty acid β-oxidation by activating mitochondrial ACSL1”的研究论文。揭示了麦角甾醇通过激活线粒体ACSL1来促进脂肪酸β-氧化的具体机制，为脂肪肝和胰岛素抵抗的治疗提供了新的分子靶点。利用cMAP和ABPP靶标垂钓等方法发现固醇类天然产物麦角甾醇（Ergosterol，ES）的直接作用靶点为长链酰基辅酶A合成酶1 (ACSL1)。
摘要
固醇以固醇敏感结构域（SSD）蛋白为靶点来降低胆固醇、循环和肝脏甘油三酯水平，但其机制尚不清楚。在本研究中，我们发现长链酰基辅酶A合成酶家族成员1 （ACSL1）是麦角甾醇（ES）的直接作用靶点。ACSL1的c端结构域经历了由封闭到开放的构象变化，ES可能靶向ACSL1的乙酰辅酶a合成酶样结构域1 （ASLD1）中的药物结合口袋，以稳定其封闭构象并维持其活性。此外，ES主要富集于线粒体，并通过ACSL1变构激活促进脂肪酸β-氧化。构效关系分析揭示了不同结构甾醇与甾醇敏感结构域蛋白（sterol-sensing domain-containing protein， SCAP）和ACSL1的相互作用，解释了它们对脂代谢的调控作用。此外，我们的研究结果表明，SCAP抑制剂25-羟胆固醇（25-hydroxycholesterol, 25-HC）和ES联合应用比单独应用具有更强的降脂效果。
1.ES 治疗可减轻 PA/OA 诱导的肝细胞脂质积累和 HFD 诱导的小鼠肝脂肪变性
在棕榈酸（PA）和油酸（OA） （combination， PO）的存在下，ES处理人正常肝细胞HL-7702和HepG2肝癌细胞16 h。采用中性脂质染料油红O、尼罗红和Bodipy对脂滴进行染色。结果显示，ES显著减少了细胞内脂滴的积聚，包括大小和数量（图1A和1B）。ES的降脂作用也通过测量细胞TG和TC水平（图1C和1D）得到证实，且无显著细胞毒性。ES治疗可降低hfd喂养小鼠肝脏重量（LW）的增加；然而，LW:BW比值没有变化（图1E）。苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）和油红O染色显示，ES显著降低了hfd喂养小鼠的脂质蓄积（图1F），并通过肝脏和血清TG、TC以及血清高密度脂蛋白-胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C）和低密度脂蛋白-胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C）水平维持（图1G和1H）。此外，在经ES治疗的hfd喂养小鼠中，肝细胞气球样变也减少（图1F）。es治疗的肥胖小鼠的血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平显著低于对照- hfd小鼠（图1I）。在经es治疗的hfd喂养的小鼠中，空腹血液中升高的非酯化FAs （NEFAs）、葡萄糖和胰岛素水平显著降低（图1J）。综上所述，这些数据提示，ES保护hfd诱导的肥胖小鼠免受肝脂肪变性和胰岛素抵抗。
ES也不能下调肝细胞的新生脂肪生成（DNL）（图1K）。随后，我们研究了肝细胞摄取FFA和FA β-氧化的过程。结果表明，ES可以增加肝细胞中FA β-氧化，但不增加FFA摄取（图1L和1M）。细胞中的酮体含量测定和3H-PA氧化分析进一步表明，ES增强FA氧化（图1N和10）。这些结果表明ES可能具有不同于氧化甾醇的作用；它们可能通过增加肝细胞线粒体FA β氧化而发挥降脂作用。
图1 ES治疗减轻了PA/ oa诱导的肝细胞中的脂质积累和hfd诱导的小鼠肝脂肪变性
2.CMap和ABPP鉴定es靶向蛋白
通过RNA测序（RNA-seq）分析ES和乙醇（EtOH）处理的HL-7702细胞在po诱导的脂质沉积下的潜在机制。采用主成分分析和无监督层次聚类将样本分为两类。采用Fold change法筛选ES的差异表达基因，查询到135个基因(>2倍变化；上调68个，下调67个)，并提交到连接图（Connectivity Map, CMap）数据库进行分析（图2A）。我们利用cmap数据库计算了与较低p值和阳性富集评分相关的前20种药物。基于这些药物的已知作用靶点，ES可能通过靶向作用于长链酰基辅酶a合成酶家族成员（ACSL）来降低脂质蓄积。为了鉴定ES的直接靶点，我们使用了基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）技术，该技术结合了基于活性的探针和蛋白质组学技术来鉴定小分子蛋白质靶点；因此，设计并合成了基于ES活性的探针ES- p。为了消除假阳性靶点，设计了用于ABPP实验的控制探针（CP）。ES-P与从肝细胞提取的粗蛋白孵育，粗蛋白在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中通过叠氮-生物素树脂沉淀（图2B）。对照试验和竞争试验各设3个重复；609种蛋白质被鉴定和定量，包括135种ES-P:CP比值（ES-P:CP）大于2倍的蛋白质(图2C)。在这些蛋白质中，有134个被ES鉴定(图2C)。ACSL1，属于ACSL家族，将链8-22的饱和和不饱和FAs转化为脂肪酰基辅酶a酯。ES-P:CP值最高的蛋白质是ACSL1。此外，ES显著竞争ES- p与ACSL1的结合（图2C）。我们使用特异性抗体通过蛋白质印迹法验证了ACSL1的存在，而不是TRAP1或ACSL3的存在（图2D）。为了进一步确定ES和ACSL1之间的相互作用，我们将HL-7702细胞裂解物或重组人ACSL1与ES珠孵育，在不存在或存在过量ES的情况下进行竞争性结合。ACSL1通过ES- p沉淀，并通过ES以剂量依赖性方式完成沉淀（图2E）。ES还减少了ACSL1中的蛋白水解（通过药物亲和力响应性靶点稳定性测定评估），微尺度热泳动（MST）显示ES的解离常数（KD）为2±1 μM（图2F），这与表面等离子体共振（SPR）实验的结果几乎相似(KD = 6 μM；图2 g)。这些结果表明ES和ACSL1之间存在直接和特定的相互作用。
图2 CMap和ABPP对es靶向蛋白的鉴定
3.es激活ACSL1可加速FA氧化
定位于线粒体外膜（MOM）的ACSL1促进FAs向酰基coas转化，进一步导致酰基coas β-氧化，减少TG积累；定位于ER的ACSL1也参与脂质合成。为了进一步研究es诱导的FA β-氧化是否依赖于ACSL1，我们首先研究了ACSL1在es处理的肝细胞中的分布。研究底物PA-BODIPY493/513对重组ACSL1酶活性反应速率的影响。结果表明，当底物浓度达到30 nΜ时，反应体系达到最大酶速率（Vmax = 63,759）（图3A和图3B）。利用建立的酶活性系统，我们检测了ES对ACSL1的影响，发现ES可以以浓度依赖性方式激活ACSL1，半数有效浓度为4 μM（图3C）。此外，在es处理的HepG2和HL-7702细胞的裂解液中，ACSL1活性增加了约2倍（图3D和3E）。直接向裂解产物中添加ES导致ACSL1活性增加约2倍（图3F和3G）。此外，用10 μM ES处理分离的线粒体提取物对肝细胞中的ACSL1活性产生了类似的刺激（图3H和3I）。类似地，位于ER中的ACSL1活性被ES处理激活（图3H和3I）。这些结果表明ES对ACSL1在内质网和线粒体的相互作用和激活不是选择性的，但可能是选择性的ES在肝细胞内的分布。因此，我们通过LC-MS研究了ES的细胞内分布（图3J）。线粒体中的含量约为ER中的5倍（图3K）。随后，我们基于ES结构构建了ES-三苯基膦（ES- triphenylphosphine, ES- tpp）荧光探针，以探索其在活细胞中的分布（图3L）。ES荧光探针在ER中有一个小的位置，ES- tpp主要分布在线粒体中（图3M）。这些结果表明ES主要分布在线粒体而不是内质网，从而激活ACSL1促进肝细胞FA氧化。
图3 es激活ACSL1加速FA氧化
4.ACSL1的激活对ES的降脂活性至关重要
我们研究了ES降低脂质蓄积的作用是否依赖于ACSL1的激活。通过ACSL1特异性RNA（小干扰RNA [siRNA]）有效降低ACSL1的蛋白表达及其活性。敲低ACSL1增加了po处理的肝细胞中的脂质积累（图4A和4B）以及TG和TC水平（图4C）。在acsl1缺陷的肝细胞中，ES治疗不能降低po诱导的脂质积累（图4A和4B），降低的TG和TC水平几乎被逆转（图4C）。与siRNA结果相似，ES不再减少ACSL1−/−HepG2细胞中po处理的脂质积累（图4D和4E），其中TG和TC水平没有显著变化（图4F）。当用野生型（WT） ACSL1补充ACSL1−/−HepG2细胞时，ES再次降低了po诱导的脂质积累以及TG和TC水平（图4G-4J）。在ACSL1−/−HepG2细胞中补充ACSL1死亡突变体（K284A）不能恢复ES的降脂能力（图4G-4J）。ES或溶媒给药4周后，通过尾静脉注射腺相关病毒(AAV)-短发夹RNA (shRNA) ACSL1或AAV-shRNA LacZ，在肝脏中特异性敲低ACSL1（图4K）。在肝脏特异性ACSL1蛋白和活性缺陷小鼠中，es减少的LW和LW:BW被破坏（图4L、4M）。在肝脏特异性acsl1缺陷小鼠中，通过he和油红O染色评估，ES未减少脂质蓄积（图4N），这与肝脏血清TG、TC、血清LDL-C、HDL-C和NEFA水平一致（图40 - 4q）。因此，在肝脏特异性acsl1缺陷小鼠中，ES治疗并未显著降低ALT和AST（图4R）。在经es治疗的hfd喂养的小鼠中，升高的空腹血液NEFA、葡萄糖和胰岛素水平显著降低（图4Q）。综上所述，这些数据表明ACSL1激活对ES的降脂作用至关重要。
图4 ACSL1激活对ES的降脂活性至关重要
5.ES激活ACSL1的结构模型
根据结构-功能分析，我们对ACSL1主要序列进行了几个截短（图5A和5B）。乙酰辅酶a合成酶样结构域1 (ASLD1；83-380个氨基酸[aa])和amp结合酶结构域（116-562 aa）用ES-P沉淀（图5A）， MST数据也验证了这一点（图5B）。ES-P2被用于绘制ACSL1上的潜在结合位点，使用竞争性abpp -还原去甲基化实验（图5C）。基于探针标记对ES处理敏感的ACSL1肽（图5D），我们使用Schrödinger软件预测了ACSL1-ES复合物的结合位点。根据突变实验的结果，得到ES-ACSL1复合体模型（图5E）。在结合模型的引导下，它与L320、P321、H324和F344形成更多的氢和π-π键相互作用，ES的柔性侧链穿透疏水口袋，包括L320、F344和E327（图5E）。虽然ES-P仍然预测了ACSL1(1-698)，但ES-P几乎与P321A、E327A和Mut5突变体结合（图5F）。这些结果经过MST验证（图5G）。近距离确认显示了563-698 aa和370-380 aa或430-440 aa之间的相互作用，这是闭合构象和开放构象的主要区别（图5H）。在闭合活性构象中，CTD靠近ACSL1活性位点，有助于ACSL1锁定FAs并促进其乙酰化。在开放构象中，残基563 ~ 698 aa距离活性位点较远；因此，活性位点完全暴露于溶剂中，这有助于反应产物离开下一个FA进入ACSL1（图5H-5J）。根据均方根偏差结果，ACSL1-ES复合体显示出稳定的构象， ES主要与L320、P321、H324、E327和F344相互作用。这些相互作用稳定了残基560-698 aa的构象，从而保持ACSL1处于活跃的闭合状态构象（图5J）。这些结果表明ES可能作为ACSL1的选择性变构激动剂发挥作用。
图5 ES激活ACSL1的结构模型
6.ACSL1药物结合囊袋在小鼠ES降脂作用中的作用
为了研究ACSL1的变构囊袋对ES诱导的小鼠脂质降低是否至关重要，我们首先使用shRNA干扰敲低了hfd喂养小鼠的肝脏ACSL1，并在给予ES或溶剂4周后，通过aav介导的转染表达WT或Mut5突变型ACSL1，从而恢复了肝脏中的ACSL1水平（图6A和6B）。小鼠的摄食量和BW不受显著影响（图6C）。与我们在肝细胞中的观察结果一致，在ACSL1缺乏的hfd喂养小鼠中，使用野生型ACSL1（而非ACSL1不敏感的突变体Mut5）进行补救能够改善脂质积累（图6D-6H）。肝脏特异性ACSL1缺陷小鼠恢复了es诱导的LW和LW:BW，这些小鼠使用ACSL1的WT（而非Mut5）得到挽救（图6D）。在ACSL1 KD小鼠中，WT（而非Mut5）挽救了es诱导的肝脏内脂质累积减少（图6E），这与肝脏和血清TG和TC水平以及血清NEFA、HDL-C和LDL-C水平一致（图6F-6H）。因此，ES治疗也显著降低了肝脏特异性ACSL1缺陷小鼠的ALT和AST水平，而使用WT、而非Mut5、ACSL1可恢复上述水平（图6I）。此外，在使用WT ACSL1恢复的ACSL1 KD小鼠中，我们观察到ES对GTT和ITT的改善（图6J和6K）。我们证实，“挽救”效应不是由于野生型和突变型ACSL1的表达水平不同（图6B），而是与ES处理后ACSL1的总体酶活性相关（图6L）。综上所述，这些数据表明ES和肝脏ACSL1之间的直接相互作用介导了ES在体内的药理活性。ACSL1的变构袋在es诱导的小鼠脂质降低中至关重要。
图6 ACSL1药物结合囊袋在ES在小鼠中的降脂作用
7.结构活性关系分析及25-HC和ES协同减少脂质蓄积
众所周知的SREBP抑制剂包括氧合胆固醇衍生物，如25-HC。然而，这些固醇通过激活肝X受体-α来增加肝脏DNL FA的生物合成此外，SREBP-2通过ACSL1 c -启动子的SRE基序调控ACSL1的表达因此，25-HC也可能抑制肝脏FA的β-氧化。如图7A-7D所示，25-HC降低了成熟SREBP-2蛋白水平，下调了肝细胞内胆固醇水平。然而，25-HC增加了SREBP-1c的表达，下调了ACSL1的表达，增加了肝细胞内的TG水平（图7D-7F）。与25-HC或ES单独处理相比，ES和25-HC共同处理的肝细胞中ACSL1和SREBP-1c的蛋白水平没有显著改变（图7A）。有趣的是，这些肝细胞中的ACSL1活性显著增加，从而减少了25-HC诱导的肝细胞内脂质积累（图7D-7F）。为了进一步评估体内效应，hfd喂养的小鼠被灌胃ES （100 mg/kg）、25-HC （10 mg/kg）或两者共8周（图7G）；小鼠的摄食量和BW未受到显著影响（图7H）。ES、25-HC或两者联合治疗均能降低高脂饮食喂养小鼠增加的LW；然而，LW:BW比值没有变化（图7I）。此外，25-HC不影响ACSL1的酶活性（图7J）。25- hc处理小鼠中的血清TC、HDL-C、LDL-C和肝TC水平显著低于溶剂处理小鼠（图7L-7N）。此外，在25-HC处理的hfd喂养小鼠中，血清和肝脏TG水平显著升高（图7L和7M），表明肝脏脂肪蓄积（图7K）。有趣的是，在hfd喂养的小鼠中，ES和25-HC的联合治疗进一步降低了血清TC、HDL-C和LDL-C水平和肝脏TC水平（图7L-7N）。在这些小鼠中，血清和肝脏TG水平显著低于25-HC处理的hfd喂养的小鼠（图7L和7M）。此外，he和油红O染色显示，ES和25-HC共给药显著减少了hfd喂养的小鼠中的脂质积累（图7K）。因此，ES和25-HC治疗显著降低了ALT和AST水平（图7O）。此外，在ACSL1 KD小鼠中观察到ES对GTT和ITT的改善，这些改善在WT ACSL1小鼠中得到恢复（图7P-7S）。综上所述，这些数据表明ES和25-HC的联合应用可能在体外和体内发挥协同的降脂作用。
图7 25-HC和ES协同减少脂质蓄积的结构活性关系分析
结论
ES进入肝细胞后主要集中在线粒体，并与线粒体内的ACSL1特异性结合，激活其FA-β-氧化酶活性。因此，它可以特异性地增加肝脏FAs的β-氧化过程，从而发挥降脂作用。
Zheng ZG, Zhang YP, Zhang XY, Qin MY, Xu YY, Wu H, Liu RQ, Wu QY, Wang MS, Zhang C, Zheng YQ, Dai JY, Li P, Yang H. Ergosterol alleviates hepatic steatosis and insulin resistance via promoting fatty acid β-oxidation by activating mitochondrial ACSL1. Cell Rep. 2025 Jan 10;44(1):115203. doi: 10.1016/j.celrep.2024.115203.
