过量乳酸蓄积造成的酸性微环境可抑制免疫淋巴细胞的抗肿瘤活性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。黄芩苷（Baicalin）是从黄芩中分离得到的一种具有抗氧化和抗炎作用的黄酮类化合物。黄芩苷具有抗肿瘤、免疫调节和抗菌特性，因此受到高度重视。多项研究表明，黄芩苷具有治疗人类肿瘤的潜力，这归因于其强大的免疫增强活性。
2025年1月13日，天津医科大学口腔医学院胡欣主任医师团队在J Adv Res上发表题为“Baicalin attenuates the immune escape of oral squamous cell carcinoma by reducing lactate accumulation in tumor microenvironment”的文章。黄芩苷通过m6a - igf2bp3依赖的方式靶向LDHA，从而减少共培养微环境中乳酸的积累和PD-L1的表达。
•黄芩苷增强了共培养体系中活化的PBMCs对OSCC的抗肿瘤免疫活性。
•黄芩苷抑制口腔鳞状细胞癌细胞的乳酸积累，酸化和m6A修饰。
•黄芩苷通过m6a - igf2bp3依赖的方式靶向LDHA来减少乳酸的积累。
•黄芩苷可减轻乳酸诱导的酸化，减少OSCC肿瘤微环境中的免疫逃逸。
摘要
黄芩苷（0 ~ 50 μmol/L）剂量依赖性地作用于OSCC细胞。将OSCC细胞与活化的PBMCs构建共培养体系。通过CCK-8、克隆形成实验、EdU、transwell实验检测OSCC细胞的增殖和迁移能力。ELISA试剂盒检测细胞因子水平。机制探索通过RNA免疫沉淀（RIP），荧光原位杂交（FISH）和RNA稳定性分析进行验证。黄芩苷呈剂量依赖性地抑制OSCC细胞的增殖和迁移，增强活化的PBMCs对OSCC细胞的抗肿瘤免疫活性。此外，黄芩苷还抑制了OSCC细胞的乳酸蓄积、酸化和m6A修饰水平。分子对接和MeRIP-Seq显示黄芩苷通过m6a - igf2bp3依赖的方式靶向LDHA，从而减少共培养微环境中乳酸的积累和PD-L1的表达。本研究揭示了黄芩苷通过减少口腔鳞状细胞癌微环境中乳酸的蓄积和减轻肿瘤微环境中的免疫逃逸而发挥抗肿瘤活性，这为提高我们对中医药治疗肿瘤的认识提供了新的思路。
1.黄芩苷抑制口腔鳞癌细胞的增殖和迁移
黄芩苷（Baicalin）是从黄芩根中提取的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌和抗氧化等特性。黄芩苷具有一个与葡萄糖醛酸部分相连的C21H18O11类黄酮结构（图1A）。为了研究黄芩苷对OSCC细胞表型的影响，我们通过以下一系列实验逐步验证其作用。如图1B所示，在0 ~ 200 μmol/L浓度范围内，黄芩苷显著抑制OSCC （SCC25, CAL27）细胞的活力，而对正常（HNOK）细胞无明显抑制作用（图1B）。在不同浓度（12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μ mol/L）黄芩苷对OSCC细胞活力的抑制作用也清晰可见（图1C， 1D）。对于OSCC的迁移，transwell分析显示黄芩苷抑制了OSCC的迁移能力（图1E）。集落形成实验和EdU实验均显示黄芩苷呈浓度依赖性抑制OSCC细胞的增殖能力（图1F、1G）。总之，这些数据表明黄芩苷抑制OSCC细胞的增殖和迁移。
图1 黄芩苷可抑制OSCC细胞的增殖和迁移
2.黄芩苷可增强共培养体系中活化的PBMCs对OSCC的抗肿瘤免疫活性
为了研究黄芩苷对抗肿瘤免疫活性和免疫逃逸的作用，将活化的PBMCs与OSCC细胞构建共培养体系（图2A）。乳酸脱氢酶（LDH）法检测活化PBMCs对OSCC细胞（SCC25、CAL27）的杀伤作用；共培养结束后收集共培养上清液用于LDH分析。基于LDH释放的细胞毒性实验证实黄芩苷增强了活化的PBMCs对OSCC细胞的细胞毒性（图2B）。在共培养体系中检测活化PBMCs分泌的细胞因子，包括IFN-γ、TNF-α、颗粒酶b和穿孔素。结果表明，黄芩苷促进了与OSCC细胞共培养的活化PBMCs分泌IFN-γ（图2C）、TNF-α（图2D）、granzym - b（图2E）和穿孔素（图2F）的数量。PD-L1通过与t细胞表面的PD-1结合，抑制t细胞的活性和功能，从而促进肿瘤免疫逃逸，是肿瘤治疗的重要靶点。在这里，结果表明黄芩苷降低了OSCC表面的PD-L1水平（图2G）。综上所述，这些发现表明黄芩苷增强了共培养体系中活化的PBMCs对OSCC的抗肿瘤免疫活性。
图2 黄芩苷可增强共培养体系中活化的PBMCs对OSCC的抗肿瘤免疫活性
3.黄芩苷抑制口腔鳞状细胞癌细胞的乳酸积累和酸化
除了黄芩苷对肿瘤免疫的影响外，我们的数据还发现黄芩苷对OSCC的乳酸蓄积和酸化也有显著的抑制作用。糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要途径，产生大量乳酸。这些乳酸蓄积导致微环境酸化，促进肿瘤侵袭和免疫抑制。在本研究中，结果表明黄芩苷抑制OSCC细胞的乳酸生成（图3A）。此外，细胞外酸度显示，黄芩苷给药上调了细胞外pH值（图3B， 3C）。此外，细胞外酸化率显示，黄芩苷可以降低OSCC的细胞外酸化（图3D， 3E）。综上所述，上述数据表明黄芩苷抑制了OSCC的乳酸积累和酸化。
图3 黄芩苷抑制口腔鳞状细胞癌细胞的乳酸积累和酸化
4.在OSCC中，黄芩苷通过m6a依赖通路靶向LDHA
分子对接分析黄芩苷与LDHA的亲和力。结果表明，黄芩苷通过可见的氢键和强静电相互作用与LDHA结合，结合能低（- 8.872 kcal/mol），表明结合高度稳定（图4A）。通过微尺度热泳动（MST）实验进一步验证了黄芩苷-LDHA的相互作用，其中黄芩苷和LDHA的平衡解离常数（Kd）值估计为2.58 μM（图4B）。这些结果表明黄芩苷和LDHA之间有中等强的结合亲和力。随后，我们的MeRIP-Seq显示在LDHA基因上有潜在的m6A修饰位点（图4C），表明黄芩苷和m6A修饰之间可能存在相互作用。LDHA基因的m6A基序为GGAC。对于m6A修饰分析，黄芩苷可以抑制m6A的富集（图4D）。采用RIP-PCR实验验证抗m6a抗体与LDHA mRNA的相互作用，结果显示黄芩苷以浓度依赖性方式抑制沉淀的LDHA mRNA水平（图4E， 4F）。在线免疫分析显示LDHA与CD8+ T细胞浸润相关（图4G）。预后分析显示，LDHA高表达的患者生存率较低（图4H）。综上所述，在OSCC中，黄芩苷通过m6a依赖途径靶向LDHA。
图4 在OSCC中黄芩苷通过m6 a依赖的通路靶向LDHA
5.黄芩苷通过igf2bp3依赖的方式抑制LDHA mRNA的表达
已有研究证实黄芩苷可调控口腔癌细胞中m6A水平，且在LDHA基因上存在潜在的m6A修饰位点。鉴于m6A关键调控酶常参与RNA甲基化的改变，我们接下来的研究探究是否有m6A关键调控酶参与黄芩苷和LDHA的调控。我们测试了几个m6A的关键读片，结果表明m6A读片IGF2BP3在黄芩苷给药后显著下调（图5A）。在临床队列中，IGF2BP3的表达与LDHA的表达呈正相关（图5B）。此外，IGF2BP3在肿瘤样本中表达较高（图5C）。荧光原位杂交实验显示，黄芩苷显著降低了OSCC细胞中LDHA和IGF2BP3的表达（图5D）。黄芩苷也能抑制LDHA和IGF2BP3的蛋白水平（图5E）。RIP-PCR分析显示黄芩苷损害了抗igf2bp3抗体和LDHA mRNA之间的分子相互作用（图5F）。RNA衰减分析显示，黄芩苷抑制LDHA mRNA的稳定性，而IGF2BP3过表达增强了稳定性（图5G）。黄芩苷可以抑制IGF2BP3过表达对LDHA mRNA稳定性的作用（图5H）。因此，数据表明黄芩苷通过igf2bp3依赖的方式抑制LDHA mRNA的活性。
图5 黄芩苷通过igf2bp3依赖的方式抑制LDHA mRNA的表达
6.黄芩苷靶向IGF2BP3/LDHA降低乳酸蓄积和PD-L1表达
鉴于LDHA mRNA的稳定性受黄芩苷和IGF2BP3的调控，通过以下实验验证黄芩苷和IGF2BP3/LDHA对OSCC恶性表型的作用，包括乳酸蓄积和PD-L1表达。首先，LDHA过表达（LDHA）促进了OSCC的乳酸富集（图6A）、酸度（图6B）和细胞外酸化速率（图6C）。然后，黄芩苷给药和IGF2BP3沉默（sh-IGF2BP3）抑制了口腔鳞状细胞癌的乳酸积累和酸化。此外，IGF2BP3过表达（IGF2BP3）共转染促进了乳酸的积累和酸化。在人类肿瘤的免疫逃逸中，PD-L1与t细胞表面的PD-1结合，抑制t细胞增殖和活性，诱导t细胞凋亡，从而促进肿瘤的免疫逃逸。流式细胞术检测OSCC细胞表面PD-L1的表达，验证黄芩苷对OSCC免疫逃逸的作用。结果表明，LDHA过表达（LDHA）促进了PD-L1表面表达（图6D），黄芩苷给药和IGF2BP3沉默（sh-IGF2BP3）降低了PD-L1表面表达。然后，IGF2BP3过表达（IGF2BP3）共转染加速了PD-L1的表面表达。综上所述，黄芩苷靶向IGF2BP3/LDHA降低乳酸蓄积和PD-L1表达。
图6 黄芩苷靶向IGF2BP3/LDHA降低乳酸蓄积和PD-L1表达
7.黄芩苷在体内可抑制SOCC的肿瘤生长，促进细胞毒性T细胞的浸润
为了测试黄芩苷对OSCC抗肿瘤免疫的作用，我们使用黄芩苷口服灌胃进行了体内荷瘤小鼠实验（图7A）。黄芩苷给药后，肿瘤体积和重量均受到抑制（图7B）。体内生物发光成像分析表明黄芩苷抑制了肿瘤转移（图7C）。此外，给予黄芩苷后，乳酸水平降低（图7D）。免疫组织化学（IHC）染色显示，黄芩苷给药抑制了肿瘤细胞中PD-L1和LDHA的表达，促进了肿瘤组织中CD8阳性淋巴细胞（图7E）。此外，mIHC分析显示黄芩苷抑制了LDHA的表达，促进了组织中CD8阳性淋巴细胞的水平（图7F）。总之，这些数据表明黄芩苷抑制SOCC的肿瘤生长，并促进细胞毒性T细胞在体内的浸润。
图7 黄芩苷在体内可抑制SOCC的肿瘤生长，促进细胞毒性T细胞的浸润
结论
综上所述，本研究揭示了黄芩苷通过改善酸性肿瘤微环境和激活pbmcs介导的抗肿瘤免疫来发挥抗OSCC的作用。黄芩苷通过IGF2BP3/m6A/LDHA轴减轻免疫逃逸，减少乳酸蓄积。这些结果可能会提供一个新的见解，以提高我们对中医药治疗人类肿瘤的理解。
