Schaftoside 是一种类黄酮 C-糖苷，存在于至少 184 种高等植物中，例如甘草根 ( G. uralensis ) 和黄芩根 ( S. baicalensis )。它具有广泛的药理活性，包括抗糖尿病、抗高血脂、抗炎和抗氧化作用。值得注意的是，schaftoside 在激活细胞自噬过程中发挥着至关重要的作用，从而抑制肥大细胞的炎症反应，抵消黑色素介导的氧化反应，并改善脑缺血再灌注损伤。
2024年11月28日，海南医科大学药学院刘艳、梁经纬团队在Redox Biol上发表了题为“Schaftoside improves HFpEF through regulation the autophagy-lysosome pathway by allosterically targeting CaMKII-δ”的文章，发现夏佛塔苷变构调节CaMKII-δ的构象以抑制其蛋白磷酸化，减轻HFpEF小鼠模型中的心肌细胞肥大和溶酶体功能障碍，促进自噬，并改善与HFpEF相关的左心室舒张功能障碍。
•溶酶体功能障碍抑制的自噬活性是HFpEF小鼠心脏重构的原因。
•夏佛塔苷通过直接结合CaMKII-δ促进HFpEF小鼠心脏溶酶体自噬。
•Schaftoside靶向atp结合位点附近的一个独特的活性口袋来抑制CaMKII-δ蛋白磷酸化。
•夏佛塔苷被确定为改善HFpEF的关键化合物。
摘要
射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）由于其复杂的表现给全球医疗保健系统带来了重大挑战。HFpEF 表现为左心室射血分数正常或接近正常、心脏舒张功能障碍以及以炎症和氧化应激受损为特征的代谢特征。迄今为止，关于 HFpEF 的有价值的药物靶点报道很少。在此，我们发现甘草中的活性成分 schaftoside 对持续输注血管紧张素 II (AngII) 诱导的心脏重塑具有显著的保护作用，从而导致 HFpEF 表型。从机制上讲，schaftoside 在体外和体内均已证明能够改善溶酶体功能障碍模型，从而激活自噬。基于蛋白质组和磷酸化蛋白质组的生物信息学分析表明，Ca 2+ /钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 是 schaftoside 的潜在靶标。已证实，schaftoside 通过靶向 ATP 结合位点附近的独特活性口袋来变构介导 CaMKII-δ 构象，从而抑制蛋白质磷酸化并调节溶酶体自噬途径。因此，schaftoside 代表了第一个通过变构抑制来抑制 CaMKII-δ 活性的小分子，为缓解 HFpEF 中的心脏代谢失衡提供了一种新的候选药物。
1 . Schaftoside 可预防体内AngII 诱导的心肌舒张功能障碍
由于 schaftoside 增强的自噬、抗炎和抗氧化特性，我们评估了 schaftoside 在 HFpEF 中的治疗效果，并对小鼠进行了详细的治疗方案，给予不同浓度的 schaftoside（[20 或 40 mg/（kg ∙ 天） ），如图1A所示。我们最初通过超声心动图和脉冲波评估了小鼠的左心室（LV）舒张功能，以研究HFpEF 中的 schaftoside（图 1 C 和 D）。长期接受 AngII 治疗的老年小鼠表现出与 HFpEF 临床表现相符的表型特征(图1E)，E峰(MV E峰)的二尖瓣流速增加(图1F )，以及较高的E/E'比(图1G )。模型动物还表现出等容舒张时间（IVRT）延长（图1H），表明左心室舒张功能恶化。左心室收缩功能通过 M 型超声心动图左心室胸骨旁短轴切面获得。AngII 治疗后收缩功能参数，例如射血分数 (EF)，基本保持不变（图 1i）。给予 schaftoside 可显著改善小鼠的左心室舒张功能。E/A比率稳定在1附近，没有任何明显变化。此外，IVRT、MV E 峰值和 E/E' 比值均降低，高剂量组效果更明显，但对心率没有影响（图 1 C-J）。值得注意的是，schaftoside 的改善效果与 Empa 治疗的阳性对照相似。舒张功能障碍与心室肥厚密切相关。尽管体重或胫骨长度正常，但模型组的左室后壁厚度 (LVPWd) 和左室质量等指示肥大的参数显著增加（图 1K-M）。然而，schaftoside 显著减轻了 AngII 诱导的小鼠心脏肥大和肺水肿（图 1 K-N）。
图1 . schaftoside 治疗对 AngII 诱导的舒张功能障碍的影响
2 .schaftoside治疗可减轻心脏肥大和炎症
我们的研究结果表明，持续输注AngII在小鼠中诱导了一种与HFpEF非常相似的病理表型，表现为心肌细胞横截面积增大、间质心肌纤维化和氧化应激水平升高。沙夫苷可减轻该效应，与Empa的治疗效果相当（图2A-G）。脑钠肽（Brain natriuretic peptide， BNP）和心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide， ANP）是欧洲心脏学会（ESC）急慢性心衰诊治指南中舒张功能不全的诊断指标。心肌组织分析显示，与angi治疗组相比，schaftoside治疗组小鼠的ANP和BNP表达显著降低（图2H）。重要的是，通过定量聚合酶链反应分析，促炎基因如IL（白细胞介素）-6、MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）和IL-1β的表达在angi诱导的小鼠心脏中显著升高，而schaftoside显著改善HFpEF的炎症状态（图2I）。
图2 schaftoside可预防心肌肥厚和间质纤维化
3.schaftoside可改善HFpEF患者溶酶体功能并促进自噬流
为明确自噬在HFpEF疾病模式中的调控作用，透射电子显微镜（TEM）检测细胞内心肌细胞自噬的变化。经angi处理的小鼠心脏在细胞核周围表现出减少的溶酶体和吞噬体（图3A）。自噬是一种溶酶体依赖的大量降解机制，对细胞内蛋白和细胞器的质量控制至关重要。免疫荧光结果显示，在模型小鼠心脏中，溶酶体相关膜蛋白1 (Lamp1)，溶酶体数量和完整性的标志，在预期的点状定位中降低（图3B），其蛋白水平持续降低（图3C）。相反，schaftoside治疗显著增加了心脏组织中的溶酶体，并升高了Lamp1表达（图3a ~ c）。考虑到沙戟苷对溶酶体功能的有益作用以及溶酶体在自噬完成中的关键作用，我们随后在HFpEF小鼠模型中评估了schaftoside对自噬的影响。schaftoside以剂量依赖性方式减轻了自噬标志物LC3II和p62在模型小鼠心肌中的累积（图3C）。鉴于schaftoside在改善溶酶体功能方面的作用，这些结果表明，预防LC3II和p62积累可能是由于有功能的溶酶体增强了自噬货物的清除，而不是减少了自噬体的形成。
体外实验，特别是对新生小鼠心肌细胞（NMCMs）的研究表明，schaftoside在激活自噬和对抗血管内皮细胞抑制剂诱导的自噬抑制中发挥作用。TEM观察到，与AngII处理组相比，schaftoside处理后的自噬体数量增加（图3D）。与体内结果一致的是，AngII损害了溶酶体功能，这通过心肌细胞中Lamp1的显著减少和ph敏感溶酶体染料LysoSensor yellow /Blue的黄色荧光减少得到了证实。沙草苷处理改善了模型心肌细胞中的溶酶体含量并促进了溶酶体酸化（图3E-H）。此外，共转染nmcm与RFP-GFP-LC3腺病毒检测显示，AngII阻碍自噬体-溶酶体融合，表现为黄色（自噬体）荧光升高和红色（自噬溶酶体）荧光信号减少。重要的是，schaftoside干预有效地纠正了这些最初被AngII抑制的自噬流的不良变化（图3I和J）。此外，我们将细胞暴露于自噬抑制剂巴佛洛霉素A1 (Bafilomycin A1, Baf-A1)，该药物以能够抑制自噬体与溶酶体的融合，从而导致LC3II在细胞内积累而众所周知。在由于Baf-A1处理而导致溶酶体功能受损的条件下，在受到angi诱导的应激的nmcm中，schaftoside对LC3II的水平没有任何显著影响（图3K）。这提示溶酶体自噬在心功能中发挥调节作用，schaftoside通过激活溶酶体自噬预防HFpEF。
图3 schaftoside增强溶酶体自噬
4. 预测靶点及富集分析结果
schaftoside在angi治疗小鼠中显示出潜在的治疗作用，蛋白质组和磷酸化蛋白质组研究用于探索schaftoside的直接作用靶点。我们使用LC-MS/MS从给予schaftoside的angi处理小鼠中分离出细胞样本，以深入表征整体表达的磷酸化蛋白。根据小鼠是否接受schaftoside治疗，将细胞样本分为两组。共鉴定出2069个蛋白和8544个磷酸化位点，对应于2994个磷酸化蛋白。在蛋白质组学数据中，经schaftoside处理后表达增加的蛋白数量多于表达减少的蛋白。相反，磷酸化蛋白质组学数据显示，磷酸化水平升高或降低的蛋白质数量没有显著差异。细胞生物学过程涉及多个信号转导通路的级联，蛋白质的磷酸化和表达可能存在于这些级联的不同阶段，是小分子干预细胞信号传导的关键途径。将蛋白质组数据和磷酸化蛋白质组数据合并，进行GO和KEGG富集分析（图4C）。利用cytoscape软件中的ClueGO模块对混合基因进行聚类分析。选择排名前5位的条目进行进一步研究。在每个条目中，从蛋白质组和磷酸化蛋白质组富集的基因数量基本相等。5个条目中同时重叠的基因有13个（AKT1、CAMK1、CAMK2D、EGFR、HRAS、MAP2K1、MAP2K2、MAPK3、MTOR、RAF1、RB1、SHC1、SOS1），提示它们是schaftoside的潜在靶点。基于小分子影响细胞通路的机制，它们通常抑制直接结合蛋白的功能。因此，我们认为，schaftoside的作用靶点应该属于蛋白质组中表达降低的磷酸化蛋白组。在这13个基因中，Akt1和CAMK2D表现出的特征表明它们可能是参与schaftoside治疗HFpEF的潜在靶点。有趣的是，CAMK2D已被报道为PI3K/AKT/mTOR信号通路的上游调节因子，在调节Akt1功能中发挥作用。我们进一步进行了schaftoside与蛋白Akt1和CaMKII-δ的分子对接研究。结果表明，对于所有可能的构像，schaftoside与CaMKII-δ的对接分数(S)均低于- 6 kcal/mol，最佳对接分数达到- 9.016 kcal/mol。schaftoside与CaMKII-δ的结合亲和力可能比与Akt1的结合亲和力高出近1000倍。与CAMK2D相关的磷酸化位点S333和T336属于表达降低的磷酸化蛋白组。CAMK2D基因对应的蛋白CaMKII-δ被认为是schaftoside的直接结合靶点。
图4 基于SS处理后HFpEF模型的心肌组织蛋白质组和磷酸化蛋白质组富集分析
5. CaMKII-δ是schaftoside的直接细胞靶点
小分子靶点的鉴定对阐明其作用机制起着至关重要的作用。钙调蛋白依赖性激酶II （CaMKII, Ca2+/calmodulin dependent kinase II）是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，在多种心脏疾病的发病机制中发挥核心作用，包括急性I/R损伤、慢性心脏重塑和心力衰竭。CaMKII由4个基因编码，即CaMKII-α、β、γ和δ。CaMKII-δ是CaMKII家族中的一个亚型。为了测试沙草苷（结构如图5B所示）对不同CaMKII亚型和剪接变体的选择性，我们使用了一个使用重组蛋白的CaMKII活性测定系统，并分析了schaftoside的抑制作用。schaftoside对CaMKII-α、-β、-γ和-δ的IC50值分别为86.09 μmol/L、156.8 μmol/L、189.5 μmol/L和0.21 μmol/L。与其他亚型相比，CaMKII-δ在心脏表达最多，在调节心功能方面具有独特的重要性。它是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，具有atp结合位点（图5E）。CaMKII-δ磷酸化自噬相关蛋白，影响自噬体与溶酶体的形成、成熟和融合，从而通过结合ATP[24]影响自噬的效率和程度。因此，我们假设schaftoside通过直接靶向CaMKII-δ诱导心肌细胞溶酶体自噬。表面等离子体共振（SPR）分析进一步证实了schaftoside和CaMKII-δ之间的相互作用，解离常数（KD）为0.14 mmol/L（图5C）。在酶亲和力实验中，我们观察到一个有趣的现象：随着孵育时间的延长，schaftoside和CaMKII-δ之间的亲和力增加（图5A）。这表明在结合过程中，CaMKII-δ可能由于与schaftoside的相互作用而发生变构变化。
为了进一步探索变构机制，我们进行了分子动力学（MD）模拟，分析了schaftoside与CaMKII-δ结合的三种构象。结果显示，在200 ns MD模拟过程中，第三个构象出现了显著的构象变化（图5G）。为了验证这一假设，我们采用分子力学/广义出生表面积（MM/GBSA）方法计算了这一过程中蛋白质-配体复合物的结合自由能。利用能量图分析方法分析了CaMKII-δ体系的可能状态和相应的能量，揭示了不同构象下的势能。在景观上，基于相似的RMSD值，将自由能盆地的构象划分为C1 ~ C4群。载脂蛋白CaMKII-δ系统的主要特征是两种构象C1和C2（图5H），而schaftoside的结合在C3和C4中创造了两个新的自由能盆地（图5I）。我们将结合自由能分解为配体周围每个氨基酸残基的贡献，以量化它们在稳定结合过程中的作用（图5J和K）。值得注意的是，Lys57参与了蛋白质-配体结合，但其能量贡献为负，表明它在变构过程中经历了不适，或作为变构变化的“驱动因素”。Lys57位于CaMKII-δ的铰链区，更靠近C-lobe中的α-螺旋（图5F）。由于schaftoside的存在，空间限制使Lys57无法形成Apo CaMKII-δ的能量盆地，导致附近氨基酸的新构像探索，从而形成能量盆地。其中，Phe25的位置发生了显著变化，位于靠近atp结合位点的n叶的β-片上（图5D）。推测β-层的位移阻碍了ATP的结合。C3、C4的差异定位和较高的RMSD提示，schaftoside引起CaMKII-δ的显著构象变化，可能主要影响底物结合位点和磷酸化。
图5 schaftoside变构调节CaMKII-δ构象
6. schaftoside可减轻CaMKII-δ诱导的心脏重构
与测序分析结果一致的是，在小剂量schaftoside处理组中，p-CaMKII-δ蛋白表达显著降低，表明schaftoside能够减弱CaMKII-δ的活化（图6A）。此外，CaMKII/AKT信号通路的激活抑制了自噬，而schaftoside同样显著降低了AKT的磷酸化水平（图6B）。已有研究表明，CaMKII-δ的过度表达导致严重的心脏重构和心力衰竭。因此，我们研究了schaftoside在心肌特异性过表达CaMKII-δ小鼠中的作用。类似地，schaftoside治疗可保护心脏免受CaMKII-δ诱导的心功能障碍、心肌肥厚和不良心肌重构（图6C-I）。此外，CaMKII-δ过表达导致心肌内ROS水平和炎症增加（图6J）。schaftoside也抑制CaMKII-δ的活性（图6K）。schaftoside可能通过抑制CaMKII-δ的活性来减轻心脏重构和HFpEF。
图6 schaftoside可抑制CaMKII-δ激活引起的心脏重构
7. schaftoside通过靶向CaMKII-δ改善溶酶体自噬
利用过表达CaMKII-δ腺病毒构建心肌细胞模型，研究CaMKII-δ在schaftoside介导的自噬调节中的作用。CaMKII-δ过表达引起溶酶体功能障碍，Lamp1蛋白表达减少，溶酶体活性和溶酶体数量分别通过LysoSensor染色和免疫荧光证实。然而，schaftoside预处理改善了溶酶体功能（图7A-C）。用GFP-RFP-LC3转染过表达CaMKII-δ的nmcm，用schaftoside处理nmcm，检测自噬水平。过表达CaMKII-δ的nmcm的红色荧光蛋白水平降低，表明自噬体含量减少。相比之下，schaftoside治疗导致自噬溶酶体形成增加（图7D-E）。这些结果表明，schaftoside抑制CaMKII-δ磷酸化，并逆转由CaMKII-δ过度激活引起的自噬水平下降。
图7 schaftoside通过靶向CaMKII-δ改善溶酶体自噬
结论
本研究证明了一种天然黄酮类化合物——schaftoside，在HFpEF小鼠模型中具有改善病理性心脏重构和有效恢复舒张功能障碍的潜力。schaftoside通过减轻纤维化和心肌肥厚发挥其作用。此外，它还通过抑制CaMKII-δ和激活自噬来改善HFpEF。
Schaftoside 通过变构调节 CaMKII-δ 构象抑制蛋白磷酸化，缓解 HFpEF 小鼠模型中心肌细胞肥大和溶酶体功能障碍，促进自噬，改善 HFpEF 相关的左心室舒张功能障碍。
Zhang H, Gao Y, Zhang M, Yuan Z, Chen Y, Wang A, Liu X, Ji S, Jin J, Liang J, Liu Y. Schaftoside improves HFpEF through regulation the autophagy-lysosome pathway by allosterically targeting CaMKII-δ. Redox Biol. 2024 Dec;78:103424. doi: 10.1016/j.redox.2024.103424.
