衰老过程的标志是各种组织和器官的功能下降，这显著增加了多种慢性疾病的风险。在衰老过程中，肠道微生物群（Gut microbiota）对宿主健康发挥着至关重要的作用。然而，肠道微生物群引发细胞衰老的机制及其对人类衰老的影响，目前仍不清楚。
2025年1月10日，复旦大学上海医学院赵超、孙宁团队在 Nature Aging 上发表了题为“Gut microbial-derived phenylacetylglutamine accelerates host cellular senescence ”的研究论文。揭示肠道微生物群产生的代谢物苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）会加速宿主细胞衰老，PAGln通过肾上腺素受体(ADR)-AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号传导诱导线粒体功能障碍和DNA损伤。为抗衰老疗法提供了新靶点和新方向。
摘要
肠道菌群在衰老过程中对宿主健康起着至关重要的作用。然而，肠道菌群引发细胞衰老的机制及其对人类衰老的影响仍不清楚。本研究表明，与肠道微生物相关的代谢物苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）可驱动宿主细胞衰老。我们的研究结果表明，随着年龄的增长，老年人肠道菌群发生了改变，导致苯乙酸（PAA）及其下游代谢物PAGln的产生增加。pagln诱导的衰老表型在细胞模型和小鼠模型中均得到验证。进一步的实验表明，PAGln通过肾上腺素受体(ADR)-腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路诱导线粒体功能障碍和DNA损伤。在体内，阻断ADR和senolytics 药物治疗均可阻止pagln诱导的细胞衰老，提示潜在的抗衰老治疗。这些综合证据表明，PAGln是人类肠道微生物群的天然代谢产物，可在机制上加速宿主细胞衰老。
1.肠道菌群-宿主共代谢产物PAGln与年龄相关
为了确定衰老过程的代谢特征，我们对健康队列的血浆样本进行了靶向代谢组检测，健康队列包括132名年龄在22 ~ 104岁的个体（图1a）。对这些与年龄相关的代谢物的富集分析表明，苯乙酸代谢是富集最多的代谢通路(图1b)。肠道微生物群和宿主共代谢产物PAGln与年龄呈现最强的正相关，呈j形趋势（图1c，d）。此外，PAGln的前体代谢物PAA在老年人中增加（图1c）。我们进一步招募了一个包含80名健康个体的复制队列(验证队列；代谢物分析证实，PAGln和PAA均随实际年龄增加而增加（图1d，e）。PAGln在不同年龄组之间存在显著差异，并且在一般人群中随着年龄的增长而增加。为了进一步描述与年龄相关的代谢特征，我们对与年龄相关的血浆代谢物进行了聚类分析，发现发现队列聚类为三个聚类（图1f）。这些集群的主要年龄构成显示了两个年龄界值：60岁和80岁（图1g）。最近一项基于血浆蛋白质组谱的研究确定了衰老过程中的三个转折点34,60和78。随机森林模型显示，在发现队列和验证队列中，代谢特征准确地预测了年龄组，PAGln在区分这些年龄组中发挥了至关重要的作用（图1h）。PAGln作为微生物和宿主的共同代谢产物，全身性升高的PAGln水平受到肠道菌群和宿主的共同影响。虽然PAA升高被认为导致了高pagln，但全身PAGln水平在多大程度上受到宿主因素的影响（尤其是在衰老过程中）仍不明确。在消除PAA的影响后，PAGln仍然表现出与年龄的强正相关（图1i），表明在衰老过程中，宿主因素可能对PAGln水平有贡献。
总之，这些结果表明，在我们的健康队列中，血液代谢组表现出年龄阶段特异性的特征，PAGln随着年龄的增长而增加。老年人PAGln水平的升高不仅与前体代谢物PAA的升高有关；在生理衰老过程中，宿主因素也在一定程度上影响PAGln水平。
图1 |肠道微生物-宿主共代谢产物PAGln与年龄相关
2.早期的肠道微生物特征与血浆PAA和PAGln相关
在灵长类动物中，肠道微生物群将饮食中的l -苯丙氨酸（L-Phe）转化为PAA，然后PAA被吸收进入循环，并与肝或肾中的谷氨酰胺结合，形成PAGln。我们发现PAGln及其前体代谢物PAA的血浆水平与生理年龄之间存在强正相关（图1d，e）。越来越多的证据表明，在衰老过程中，肠道微生物群的结构和功能发生变化。然而，目前还没有研究探讨衰老过程中肠道菌群功能改变与PAA和PAGln增加之间的联系。因此，我们对健康的发现队列进行了宏基因组分析。我们在老年组中观察到显著的肠道微生物特征变化（图2a，b）。有趣的是，微生物特征和血浆PAA和PAGln在老年组表现出类似的变化。线性判别分析效应量（LEfSe）算法共识别出26个物种，27条通路在年轻组、年老组和年老组之间存在差异富集（图2c，d）。老年组和老年组中富集的物种和通路与PAA和PAGln具有不同的相关性；相比之下，在年轻组中富集的物种和通路与PAA或PAGln不相关，除了肌醇降解通路（图2c，d）。在所有三个年龄组中富集的物种中，哺乳期钌酸杆菌（在老年组富集）和副流感嗜血杆菌（在老年组富集）分别与PAA和PAGln表现出最强的正相关和负相关（图2c）。在这些富集的途径中，丙酮酸发酵为乙酸盐和乳酸Il途径（类似于苯丙酮酸转化为PAA的催化过程）与PAA和PAGln的关联最强（图2d）。老年组L-Phe生物合成的超途径也与血浆PAA和PAGln呈正相关（图2d）。
为了探索年龄特异性物种，通路，PAGln和PAA之间的内在联系，我们使用Cytoscape和分子复合物检测（MCODE）插件进行了共丰度网络分析。在较老的阶段特异性网络中，我们观察到pwey -6285（脂肪酸生物合成的超通路）和pwey - 5189（来自甘氨酸的四吡烷生物合成II）是核心节点（图2e）。这两条通路均与PAA呈正相关，但与PAGln无直接联系。pwey -5100（丙酮酸发酵至乙酸盐和乳酸II）与网络中的所有通路节点呈负连接，但与PAA和PAGln呈正连接（图2e）。梭菌scindens被确定为该网络中的枢纽物种节点，并且与PAA和PAGln呈正相关（图2e）。接下来，我们结合所有的阶段特定元素，进行了全面的网络分析。使用MCODE插件可以将泛连接网络划分为三个子网。在PAGln相关的子网络（Network I）中，值得注意的是，与PAGln呈正相关的通路pwey -5100与complete - aro - pwey（芳烃氨基酸生物合成超通路）和pwey -6737(淀粉降解V；图2f，网络I)。PAA聚类到子网络II，其中pwey -7237 （myo-， chiro-和scyllo-inositol degradation）作为枢纽节点，与PAA呈负相关(图2f，网络II)。只有最小的子网络显示与PAGln或PAA没有联系（图2f，网络III）
总之，这些发现揭示了在衰老过程中血浆PAA和PAGln与肠道微生物特征之间的协同变化，并提示老年人的高血浆PAA和PAGln浓度与特定的微生物特征有关。
图2 |与血浆PAA和PAGln早期联系的肠道微生物特征
3.老年人肠道菌群具有更强的产paa能力
膳食苯丙氨酸通过肠道微生物群中的几种酶脱氢产生苯丙酮酸（PPY）。这些酶包括苯丙氨酸脱氢酶（酶分类（EC） ID: 1.4.1.20）（（KEGG）同源ID: K00270）和芳香族氨基酸转氨酶（EC: 2.6.1.57） （KEGG同源ID: K00832和K00838）（图3a）。然后通过氧化和非氧化策略将PPY转化为PAA。α-酮异戊酸铁氧化还原酶（VOR） （EC: 1.2.7.7） （KEGG orthology ID: K00186, K00187， K00188和K00189）和吲哚丙酮酸铁氧化还原酶（IOR） （EC:1.2.7.8） （KEGG orthology ID: K00179， K00180和K04090）是参与PAA产生的氧化途径的两个推定酶（图3a）。此外，苯丙酮酸脱羧酶(PPDC)推测通过非氧化过程将PPY转化为PAA（图3a）。此外，我们对健康发现队列中的肠道宏基因组数据进行从头组装分析和基因丰度注释，并使用KEGG数据库对微生物基因进行分类。未发现编码芳香酸转氨酶的基因簇之间存在相关性(EC: 2.6.1.57；K00832和K00838)参与将L-Phe转化为PPY和血浆PAGln、PAA或生理年龄（图3b）。在从PPY到PAA的催化转化过程中，构建VOR的基因与年龄、血浆PAA和血浆PAGln呈显著正相关（图3b）。在这些基因中，porA （K00186）最为显著，它与血浆PAGln和PAA均呈正相关，Spearman秩相关系数分别为0.28和0.29（图3b）。然而，与IOR或PPDC相关的基因簇均未显示出与年龄、PAGln或PAA的相关性（图3b）。这些发现得到了最近一份报告的支持，该报告认为K00186和K00187在两个不同民族中与年龄呈正相关(图3 c)。
为了验证这些注释的数据，我们使用定量聚合酶链反应（qPCR）来检测代表基因BT0429， BT0430， proA和ppdC12,24在健康发现队列的第一个四分位数（Q1）和第四分位数（Q4）的粪便DNA样本中的丰度，基于血浆PAGln浓度(Q4的个体比Q1的个体年龄大；扩展数据图3a)。与Q1相比，Q4个体的肠道菌群porA丰度更高（图3d和扩展数据图3b）。我们还注意到，尽管IOR中涉及的基因簇（K00179， K00180和K04090）在宏基因组数据中与年龄不相关（图3b），但Q4中个体的肠道微生物组有较高的BT0429和BT0430丰度（图3e，f）。在粪便DNA样本中未检测到ppdC。
为了进一步评估肠道菌群产生PAA能力在年轻人和老年人之间的年龄相关差异，我们招募了两个新的健康组（每组n = 14人），并进行了厌氧粪便培养试验（图3g）。老年组（78.79±5.549岁）的粪便样本比年轻组（23.86±2.413岁）的粪便样本表现出更强的L-Phe转化为PAA的能力（图3h）。根据这些发现，我们挖掘了UniProt中的公共数据集，并观察到在老年组中富集的5个候选基因（Methanobrevibacter smithii, lacttonifactor longviformis, Clostridium methylpentosum， Gordonibacter pamelaeae和Clostridium scindens）被预测含有PAA转换基因（图3i，j），表明它们具有产生PAA的能力。其中，我们成功分离出G. pamelaeae和C. scindens，并发现这两种物种在厌氧条件下都可以将L-Phe转化为PAA（图3k）。同样，通过Spearman等级相关分析，我们发现非灵长类动物中PAA的主要次级代谢物苯乙酰甘氨酸（PAGly）在小鼠（8周龄，8月龄，14月龄和24月龄小鼠，雄性，每组n = 6）中表现出年龄依赖性的增加（图3l）。小鼠（8周龄、8月龄和14月龄雄性小鼠，每组n = 6）血浆PAGly的这种年龄依赖性增加可通过口服吸收不良的广谱抗生素混合物（ABX）1周来抵消（图3m）。
综上所述，这些研究结果表明老年人肠道菌群中涉及PAA产生的基因丰度更高，并表现出较强的产生PAA的能力。
图3 老年人的微生物群产生paa的能力更强
4.PAGln在体内外均可引起细胞衰老
为了研究健康人群中PAGln的年龄依赖性增加引发细胞衰老的潜力，我们使用了在我们的人群中检测到的三种生理浓度的PAGln，用于细胞模型：5 μM， 15 μM和30 μM。我们首先进行了PAGln给药后的长期细胞增殖实验。在两个非永生化原代细胞系中观察到显著的剂量依赖性生长抑制：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和原代胎肺成纤维细胞（IMR-90）（图4a）。从生长曲线、第4代5-乙炔基-2 ' -脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色百分比和Ki67焦点百分比的下降（图4a，b）可以看出，PAGln撤出后，两种细胞系的细胞周期停滞状态都没有恢复。此外，在两种细胞系中，停用PAGln后，衰老相关β-半乳糖苷酶阳性（SA-β-gal+）细胞呈剂量依赖性增加（图4c），表明长期PAGln刺激可诱导细胞衰老。
检测细胞衰老相关蛋白在两种细胞系中的表达。暴露于PAGln增加了DNA损伤标志物γ-H2AX和细胞周期蛋白抑制剂p53， p16INK4A（以下简称p16）和p21waf1/cip1（以下简称p21）的表达，但降低了核层蛋白B1和磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（以下简称p-Rb）的表达（图4d），证实了PAGln刺激p53 - p21和p16 - rb信号通路，这两者都是细胞衰老过程中的事件。此外，在两种细胞中均检测到衰老相关分泌表型（SASP）基因表达的浓度依赖性进行性增加（图4e）。8周龄C57BL/6N小鼠每天腹腔注射1剂PAGln，连续4周（n = 6 /组），检测PAGln是否在体内诱导细胞衰老。与生理盐水处理的小鼠相比，免疫印迹结果显示肾和肺内γ-H2AX、p53、p16和p21的表达显著升高，而Lamin B1和p-Rb的表达降低（图4f）。细胞周期蛋白抑制剂Cdkn2a， Cdkn1a和Trp53的表达增加，以及SASP基因的表达增加，也通过qPCR得到证实（图4g）。为了确定体内发生衰老的细胞类型，我们对生理盐水处理和pagln处理的小鼠的肾脏和肺进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。我们鉴定出Cdkn1a+和SASP+细胞比例较高的细胞类型作为PAGln诱导的衰老细胞类型。在肾脏中，scRNA-seq和免疫荧光结果表明，内皮细胞和巨噬细胞，表现出更高比例的细胞表达p21和SASP（图4h）。所有这些证据证实，PAGln在体外和体内均可触发细胞衰老。
图4 | PAGln在体内和体外均可触发细胞衰老
5.PAGln可诱导线粒体功能障碍和碎片化
为了探索PAGln诱导细胞衰老的机制，我们对15 μM PAGln处理24 h的HUVECs进行了RNA-seq检测。pagln处理组和对照组之间的差异表达基因的功能注释表明，线粒体相关通路受到影响，前10条通路中有5条富集（图5a）。用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）测定的线粒体膜电位（MMP）呈剂量依赖性降低，在两种细胞系中均检测到PAGln处理24 h（图5b）。一致地，我们还观察到，在PAGln处理后，细胞活性氧（ROS）和线粒体超氧化物（mt-SOX）（分别用2 ',7 ' -二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和mtSOX Deep Red测定）也呈剂量依赖性增加（图5c，d），表明PAGln损害线粒体功能。此外，我们检测到，在两种细胞系中，PAGln处理24 h显著增加了细胞中短线粒体的百分比，增加了含有碎裂线粒体的细胞百分比（图5e，f）。动力相关蛋白1 （Dynamin-related protein 1, DRP1）在维持线粒体形态和功能中起着关键作用。DRP1在第616位丝氨酸的过度磷酸化（DRP1-s616p）会触发线粒体碎片化，从而损害线粒体功能。PAGln刺激24 h导致HUVECs中pDRP1积累，伴有线粒体分裂因子（MFF）表达增加，线粒体融合相关蛋白线粒体融合蛋白1 （MFN1）、线粒体融合蛋白2 （MFN2）和视神经萎缩蛋白1 （OPA1）表达减少（图5g）。DNA损伤标志物γ-H2AX的表达在处理24 h后呈剂量依赖性增加。
综上所述，这些结果表明，在细胞衰老过程中，PAGln可以触发线粒体功能障碍和碎片化，导致细胞DNA损伤。
图5 | PAGln诱导线粒体功能障碍和碎片化
6.PAGln通过ADR-AMPK通路诱导线粒体功能障碍
先前的研究报道了PAGln和儿茶酚胺之间的结构相似性，并证实PAGln通过ADRs12上调细胞cAMP。我们发现，在两种细胞系中，PAGln刺激1小时后，AMPK在Thr172位点的剂量依赖性磷酸化（g蛋白偶联受体之间的连接和线粒体的功能调节30,31）以及DRP1在s616位点的磷酸化均上调（图6a）。鉴于AMPK Thr172位点的磷酸化可以启动线粒体分裂过程，我们研究了AMPK活化是否对pagln介导的线粒体碎片化和DNA损伤至关重要。我们使用atp竞争性AMPK抑制剂化合物C (dorsomorphin)，发现1小时时pagn诱导的AMPK- thr172p和DRP1-s616p磷酸化受到抑制（图6b）。当AMPK被Compound C抑制时，24 h PAGln刺激诱导的线粒体碎片化和DNA损伤被抑制，表现为MFF， DRP1-s616p和γ-H2AX的表达显著降低，而线粒体融合相关蛋白MFN1， MFN2和OPA1的表达增加（图6c）。此外，我们检测了在pagln处理的小鼠（n = 6 /组，8周龄，雄性）的肾脏和肺中ampk -线粒体信号。PAGln组大鼠肾、肺组织中AMPK-Thr172p、DRP1-s616p和MFF表达增加，MFN1和MFN2表达减少。PAGln给药后，超氧化物歧化酶1 （SOD1）和超氧化物歧化酶2 （SOD2）的表达降低，这意味着体内氧化还原平衡被破坏（图6d）。这些结果支持AMPK参与了pagln诱导的线粒体碎片和DNA损伤。
为了探讨阻断ADR是否可以阻碍pagln对细胞的作用，我们使用了两种药物ADR抑制剂：非选择性α受体阻滞剂甲磺酸酚妥拉明和非选择性β受体阻滞剂盐酸普萘洛尔。给予这些ADR抑制剂显著降低了pagln诱导的AMPK和DRP1磷酸化在1小时（图6e）。值得注意的是，普萘洛尔介导的非选择性β受体阻滞剂表现出更强的抑制作用（图6e），这意味着β受体可能参与了这一过程。此外，在ADR阻滞剂存在的情况下，pagln诱导的线粒体碎片标志物显著降低（图6f）。值得注意的是，在两种细胞系中，由PAGln诱导的DNA损伤也被ADR阻断缓解（图6f）。这些结果表明，PAGln通过ADR-AMPK信号通路诱导DNA损伤和线粒体功能障碍。
图6 | PAGln通过ADR-AMPK通路诱导线粒体功能障碍
7.ADR阻滞剂和senolytics药可减弱细胞衰老
由于卡维地洛阻碍了pagln诱导的DNA损伤（细胞衰老的诱导物），因此我们接下来测试了卡维地洛对抗pagln诱导的衰老的能力。为了研究卡维地洛是否可以在体内对抗pagln诱导的细胞衰老，我们将卡维地洛口服给小鼠（饲料，1 g kg - 1, n = 6, 8周龄，雄性）或预先给正常饲料（n = 6, 8周龄，雄性）1周。与之前一样，每日将一剂PAGln腹腔内注射到小鼠中，持续4周（图7a）。我们发现，卡维地洛给药显著降低了小鼠肾脏和肺部的衰老标志物至对照水平（图7b）。qPCR验证了卡维地洛对pagln诱导的衰老标记物p16、p21和p53的抑制作用。卡维地洛在体内外均能有效抑制pagln诱导的细胞衰老。
鉴于senolytics剂是一种有前景的技术，可以选择性地消除衰老细胞，因此我们想知道是否可以在体内使用senolytics剂来缓解pagln诱导的细胞衰老。ABT263 （Bcl-2抑制剂）经口灌胃给药，给予或不给予4周PAGln腹腔注射（图7c）。免疫印迹和qPCR结果显示，ABT263显著降低了肾和肺中pagln诱导的衰老标志物和SASP（图7d）。
结论
综上所述，本研究系统地揭示了肠道菌群的改变在体外和体内加速细胞衰老的机制，并对微生物群和宿主共代谢产物PAGln如何随年龄增长和影响宿主提供了更深入的理解。在体内，阻断adr和抗衰老药物治疗均可阻止pagln诱导的细胞衰老，提示潜在的抗衰老治疗。
Yang H, Wang T, Qian C, Wang H, Yu D, Shi M, Fu M, Liu X, Pan M, Rong X, Xiao Z, Chen X, Yeerken A, Wu Y, Zheng Y, Yang H, Zhang M, Liu T, Qiao P, Qu Y, Lin Y, Huang Y, Jin J, Liu N, Wen Y, Sun N, Zhao C. Gut microbial-derived phenylacetylglutamine accelerates host cellular senescence. Nat Aging. 2025 Jan 10. doi: 10.1038/s43587-024-00795-w.
