虽然人们对IBD的发病机制以及药物治疗的有效性和副作用有丰富的知识，但专注于补充和整合医学在帮助治疗或治愈IBD方面的效果的研究有限。生姜是世界上消费最多的调味品之一。它们有超过5000年的医学历史，用于治疗流感、恶心、关节炎、偏头痛和高血压等疾病。临床试验和体内研究还研究了生姜补充剂、生姜提取物和生姜来源的纳米颗粒对溃疡性结肠炎患者的治疗作用，这些治疗作用包括减轻腹泻和相关疼痛，以及减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）等物质引起的溃疡性结肠炎的严重程度。药物研究也关注于特定的姜成分，表明姜酚对结肠癌有抑制作用。尽管有这些发现，目前的证据表明，与潜在的生姜提取物相比，单独食用生姜提取物的效果相对较弱。我们对它的组成部分和机械作用缺乏完整的了解，限制了它的潜在用途。
2025年2月3日，加拿大多伦多大学唐纳利细胞和生物分子研究中心刘家宝/Henry M Krause团队在Nat Commun发表题为“An abundant ginger compound furanodienone alleviates gut inflammation via the xenobiotic nuclear receptor PXR in mice”的文章。生姜的主要成分呋喃二烯酮（FDN）是一种选择性孕烷X受体（PXR）配体，具有激活转录，FDN在PXR配体结合域（LBD）的子口袋内结合，随后LBD结构发生改变。
摘要
文献记载了天然产物中发现的类药物分子的价值。虽然许多饮食和草药疗法被发现对治疗肠道炎症有效，但对其有效成分的鉴定却滞后。在这项研究中，我们发现生姜的主要成分呋喃二烯酮（FDN）是一种选择性孕烷X受体（PXR）配体，具有激动转录结果。我们发现FDN在PXR配体结合域（LBD）的子口袋内结合，随后LBD结构发生改变。在雄性小鼠中，我们发现口服FDN具有结肠特异性的强效pxr依赖性抗炎结局。在有协同作用的激动剂存在的情况下，亲和力和靶基因激活的增加表明进一步增强FDN活性、疗效和安全性的机会。综上所述，这些结果支持FDN作为一种治疗和预防结肠疾病的药物的转化潜力。
1.亲和下拉确定FDN是一个潜在的hPXR或hCAR配体
为了检测NRs在人类结肠组织中的表达程度，我们分析了来自GTEx32的373个乙状结肠样本和406个横结肠样本的转录组数据。数据表明，除了神经元和视网膜组织（Nr1f2、Nr2e1和Nr2e3）以及激素产生组织（Nr0b1和Nr5a1）中典型表达的NRs外，大多数NRs在结肠的这些区域中表达（图1a，b）。虽然检测到的一些NRs表达水平较低，但它们在IBD的发病机制和治疗中的作用已得到充分证明，且意义重大。因此，为了鉴定所有潜在NR靶点的配体，我们使用了活性代谢组学方法，使用his标记的NR配体结合域（lbd），除NR0B1和NR0B2在大肠杆菌中表达时表现出较差的溶解度和稳定性外，其他所有NR。
在测试的46个NRs中，只有PXR （NR1I2）、CAR （NR1I3）、RXRβ (NR2B2)和RXRγ (NR2B3)从测试的生姜提取物中获得了明确且特异性富集的质量特征（图1c-f）。采用电喷雾离子正极（ESI+）模式LC-MS检测4个质谱特征(m/z = 231.1372和232.1406；412.2678和413.2712)均被PXR下调(p = 0.022；25,772倍富集，p = 0.013；4219倍富集，p = 0.002；5096倍富集，p = 0.0002；1358倍富集，分别图1c)和CAR (p = 0.009；25,267倍富集，p = 0.011；4432倍富集，p = 0.0004；97,755倍的富集，p = 0.0007；图1d)。前两个质量随后被指定为离子[C15H19O2]+的同位素峰（∆m =−5.6 ppm）。另外两个被指定为离子[C22H34O6 + NH4]+的同位素峰（∆m =−5.6 ppm）。两个质量特征（m/z = 345.2052和346.2086）被RXRβ拉低(p = 1.48e-07；18505倍的富集，p = 1.72821e-05；4750倍的富集，分别，图1e)和RXRγ (p = 0.02268；16,545倍的富集，p = 0.036739；分别富集3009倍，图1f)。这两个质量随后被指定为离子[C19H30O4Na]+的同位素峰（∆m = 3.0 ppm）。每个NR选择的富集特征汇总在图1g中。
为了阐明鉴定质量的结构，15公斤干姜粉末，用95%乙醇提取，用正相和反相液相色谱分离。通过NMR和x射线衍射，m/z为231.1372的化合物1被鉴定为(5E, 9E)-3,6,10-三甲基-8,11-二氢- 7h -环deca[b]furan-4-one （FDN，图1h）。在分离过程中，m/z为412.2678的化合物2脱羧（- 44道尔顿），副产物被鉴定为10-姜酚。经鉴定，化合物3为8-姜酚，m/z为345.2052。
图1：姜次生代谢物作为人核受体配体的鉴定
2.FDN对NR转录活性的选择性作用
为了进一步评估FDN的特异性，我们使用全面的析因NR检测系统检测了FDN与所有48个人类NRs的结合。当使用浓度为1µM时，PXR是唯一有反应的NR（图2a）。在较大剂量下，我们还观察到雌激素受体α和β （ERα和ERβ）以及PPARγ的激动作用（图2a）。尽管存在于hCAR下拉中，但未检测到hCAR的激动反应（图2a）。为了进一步评估FDN如何影响PXR和CAR的相对转录活性，我们使用了一个稳定的基于hela的细胞系（HG5LN），该细胞系表达与hPXR或hCAR lbd融合的GAL4 DBD，以及uas荧光素酶报告基因。hPXR的结果与我们的下拉试验一致，EC50值为2.8µM，大约80%的SR12813完全激动剂活性（图2b）。对于hCAR， FDN仅表现出较弱的激动活性，并且由于无法达到饱和（推测是由于较高浓度下的细胞毒性），因此无法确定EC50值（图2c）。综上所述，FDN与CAR的相互作用似乎较弱且无效。
为了在后续的动物实验中评估FDN对ERα， ERβ和PPARγ的潜在脱靶效应，我们使用HELN-hERα， HELN-hERβ和HG5LN-PPARγ荧光素酶报告细胞系来确定它们的有效性。与析因NR测定一致，FDN需要相对较高的浓度来激活这些受体，并且只有较弱的激活（与对照激动剂活性相比，ERα、ERβ和PPARγ的激活分别约为15%、30%和18%：图2d）。这可以解释之前的研究结果，FDN抑制17β-雌二醇（E2）刺激的ERα信号传导5，在高浓度时作为竞争性部分激动剂发挥作用。
3.配体-受体相互作用的进一步表征
作为确定FDN、hPXR和hCAR之间相互作用的生化性质的第一种方法，我们使用等温滴定测热法（ITC）。使用his标记的hPXR-LBD-SRC1融合蛋白对FDN溶液进行滴定，导致了放热结合事件（图2e，上图）。对总热量随PXR-LBD-SRC1蛋白浓度增加而变化的分析表明，结合的化学计量学约为1:1（配体：蛋白，mol/mol，图2e，底部图）。曲线拟合得到解离常数为4.5µM。吉布斯自由能（ΔG）值为正（−7.28±0.40 kcal/mol，图2f），表明配体结合是自发的。FDN结合也产生了有利的焓值（ΔH）（−2.40±2.45 kcal/mol：图2f），伴随显著的熵损失（ΔS）（16.38±8.60 cal/mol/deg：图2f），表明LBD构象自由度降低。
4.FDN-PXR相互作用的结构分析
为了进一步了解FDN的作用模式，我们在分辨率为1.95 Å的情况下解出了结合的PXR LBD（以下简称PXR）的晶体结构。该结构揭示了一个典型的PXR活性构象，它具有c端螺旋H12（也称为AF-2或激活螺旋-2），并将LBP与FDN按电子密度放置在LBP内（图2g）。注意，与周围的残基相比，FDN的电子密度是相当弥散的，表明了一种动态结合模式。FDN对PXR具有中等的亲和力（EC50 = 2.77µM）， FDN是一种相当小的化合物，与8个PXR LBP残基相互作用（4.2 Å距离截断值，图2h）。相比而言，强效的PXR激动剂和抗癌药物dabrafenib (DAB)占据了更大的体积，与LBP残基的接触更多（图2i），这与其对受体的较高亲和力（EC50 = 87 nM）一致。FDN的两个主要锚定点包括(1)它的十元环与所谓的PXR π陷阱（由氨基酸F288， W299和Y306组成）之间的多个接触，(2)FDN的羰基部分与Q285之间可能形成的氢键（图2h）。此外，FDN呋喃环与M243、M246、S247和F288有几个接触点（图2h）。
图2:FDN对人NR转录活性和PXR结构的影响
5.FDN减轻dss诱导的结肠炎
在DSS研究中，小鼠接受FDN或先前验证和测试过的mPXR激动剂孕烯醇酮16α-碳腈（PCN）治疗，两种药物的浓度均相对较低，为10 mg/kg。为了降低实验成本和复杂性，雄性小鼠被专门用于这些研究。两种化合物均具有相似的保护作用，包括疾病指数评分降低（图3a），体重减轻减轻（图3b），结肠缩短减少（图3c， d）。结肠切片苏木精-伊红染色（H&E）的组织学分析也显示，激动剂治疗小鼠的组织损伤减轻（图3e， f）。
图3:FDN减轻了dss诱导的结肠炎
6.pxr介导的结肠保护机制
为了验证FDN所观察到的肠道保护作用是依赖于PXR的，我们进行了额外的实验来阐明FDN的作用机制和PXR依赖。我们从三个已知的PXR靶基因开始。首先，我们注意到FDN和阳性对照PCN均上调了原型PXR靶基因Cyp3a11（促进外源物质的代谢和消除）和Mdr1a（输出毒性胆汁酸、代谢物和外源物质的PXR应答转运蛋白）的表达（图4a）。我们还观察到Cyp2b10具有强诱导作用（图4a）， Cyp2b10是由PXR和CAR41共同调节的解毒基因。我们还分析了对细胞解毒至关重要的谷胱甘肽s -转移酶（GST）基因的表达。与DSS单独治疗的小鼠相比，基因Gsta3、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm6和Gstm7的表达在fdn治疗组中均显示出大约2倍的增加（图4b）。综上所述，这些结果表明FDN通过促进结肠中解毒途径基因的表达来调节其大部分活性。
NF-κB信号通路的激活是PXR介导抗炎作用的另一种已确定的机制。为了验证这一点，我们观察了结肠中磷酸化NF-κB p65和IκBα的水平。在DSS处理的小鼠结肠中，单独DSS处理导致两种蛋白的显著磷酸化，而与FDN或PCN联合处理则将这些水平逆转回正常（图4c）。与我们观察到的NF-κB成分的结果一致，加入任一PXR激动剂后，溃疡性结肠炎的关键NF-κB调节标志物（包括IL-6、IL-1β和TNF-α）的水平也降低（图4d）。激活PXR或抑制NF-κB也已被证明可改善肠屏障功能。因此，我们发现，dss介导的occludin和ZO-1的下调被PCN和FDN逆转（图4e， f），而occludin和ZO-1是紧密连接的重要组成部分和黏膜修复的介质。
图4:fdn介导的结肠保护机制
为了进一步测试在dss治疗小鼠中观察到的效应是否归因于PXR的选择性激活，我们还在PXR敲除（Nr1i2 - / -）动物中评估了FDN对dss诱导的结肠炎小鼠的治疗（图5）。用FDN对Nr1i2 - / -小鼠进行治疗未能恢复野生型小鼠中上述任何保护措施（图5a-k）。综上所述，这些结果表明FDN通过PXR发挥其保护作用。
图5:FDN有益活动依赖于pxr
7.FDN tissue-specificity
虽然之前的研究表明，PXR激动剂可在结肠中发挥保护作用，但这些作用已被肝脏中的有害作用抵消。肝脏是PXR表达和活性的主要部位，在脂质代谢和外源生物失活中发挥作用。然而，PXR过表达和过度活跃可导致肝增大、肝毒性和药物失活。重要的是，治疗浓度的PCN或FDN治疗均未引起任何肝毒性（图6a、b）的迹象。在靶基因表达方面，FDN对肝脏PXR靶基因表达几乎没有影响（图6b）。虽然与DSS单独治疗相比，PCN和FDN均轻度上调Cyp2b10（图6b）。当与FDN或PCN共给药时，这些dss诱导的下降恢复到正常水平。有趣的是，虽然FDN将PXR靶基因Cyp3a11的表达恢复到基线水平，但PCN诱导了显著较高的Cyp3a11表达水平（图6c）。使用原代人肝细胞也观察到了类似的结果。FDN治疗对人PXR靶基因Cyp3a4、Cyp2b6和Ugt1a1产生弱效应或无效应（图6d）。FDN经口灌胃给药可在结肠中诱导强烈的pxr依赖性效应，而对肝脏或原代肝细胞中靶基因的表达没有影响，因此FDN在IBD的安全治疗方面具有良好的潜力。
图6:FDN的影响是肠道特异性的
8.PXR与FDN和类固醇的协同作用
作为异种传感器，人类PXR有一个由4个不同子口袋组成的大、灵活、疏水性LBP，小化合物可以根据大小、结构和化学成分以独特的组合和方向与LBP结合。我们的结构表明，FDN与硫丹等有机氯农药占据相同的结合位点和大致相同的体积（END，图7a）。这一观察结果与它们非常相似的EC50值一致（END的EC50 = 7.0µM， FDN的EC50 = 2.8µM）， FDN略高的效价很可能是由于与Q285的额外氢键（图2h）。在这种结合模式下，由H3、H11和H12螺旋描绘的LBP的很大一部分是空的，有可能容纳第二种物质，如天然激素E2，如图5a所示。我们之前的工作表明，END和E2可以协同地同时与PXR结合，协同地激活受体。这些与内源性代谢物或外源性代谢物的协同作用可能导致不同的生理结局。
为了进一步了解潜在的组合相互作用，我们首先利用计算机模拟分子对接研究了在E2或EE2存在或不存在的情况下，预测的FDN结合亲和力的差异。从已经包含EE2的PXR结构4X1G开始，FDN的对接产生了与PXR: FDN晶体结构中观察到的相似的结合几何形状（图7b），与FDN单独对接（XP分数=−8.723 kcal/mol）相比，具有更有利的对接分数（XP分数=−9.223 kcal/mol）。同样，在含有E2的PXR结构7AXK中对接FDN，也得到了与PXR: FDN晶体结构相似的结构（图7c），也获得了比单独对接FDN （XP =−8.895 kcal/mol）更优的对接分数（XP =−8.725 kcal/mol）。这些结果表明，在其他配体存在的情况下，FDN的亲和力会受到显著影响。这些配体的诱导配位效应保证了两种配体同时放置的足够空间，腔内疏水性的整体增加可能会显著增强LBD的稳定性和活性。值得注意的是，用EE2预测的协同效应比用E2更强，表现为前者结合能的提高更大。
为了进一步了解FDN与E2或EE2结合后PXR结构的构象扰动，我们使用了氢-氘交换(HDX) -质谱（HDX- ms）技术。HDX实验在有配体或无配体的情况下进行，平均序列覆盖率为75.6，平均肽冗余度为2.83。HDX-MS分析显示，在FDN、FDN/E2和FDN/EE2存在的情况下，PXR的结构发生了显著变化（图7d）。PXR-E2和PXR-EE2复合体的平均序列覆盖率为78.5%，肽冗余度为2.76，但HDX-MS分析显示，这些复合体与E2或EE2结合后，氘交换无统计学差异。值得注意的是，对于PXR-E2复合物，由于溶解度问题，在已知的EC50为10.0µM的情况下，所使用的配体浓度将导致75%的“分数结合”（所有其他复合物的占用率均为90%或更高）。然而，如果在E2存在的情况下发生结构变化，则氘的差异摄取仍然具有统计学意义（图7d）。
我们的结果还表明，在SR12813（完全激动剂）、FDN、FDN/E2或FDN/EE2存在的情况下，PXR在LBD内经历了结构压缩，包括螺旋H3（246-257）、H6/H7（319-325）和H9/H10（400-411）。此外，数据表明，c端螺旋H12（412-428）的螺旋完整性有实质性的构象增加，这是招募共激活子伙伴的关键角色（图7d）。在FDN/E2或FDN/EE2的联合存在下，螺旋H12的氘摄取分别从FDN单独存在时的15%进一步降低至FDN/EE2和FDN/E2时的18.9%和19.4%（图7e），这与活性AF-2构象的进一步稳定一致。
之前对其他NRs的研究也强调了螺旋H3在配体和共激活因子结合中的重要性50。有趣的是，H3区域的FDN、FDN/E2和FDN/EE2的氘摄取曲线均显示出比SR12813更高的H3稳定性，其中FDN/E2和FDN/EE2提供了比单独FDN更高的H3稳定性，氘交换保护分别从FDN的25.9%上升到FDN/EE2和FDN/E2的29.8%和30.2%（图7d， e）。因此，E2和EE2都增强了FDN对PXR的结构效应，提示了向完全激动剂活性的转变。
图7:FDN与类固醇的协同作用
9.FDN和类固醇对PXR的协同转录激活作用
为了阐明这一协同作用的转录效应，我们使用报告细胞系HG5LN GAL4-PXR-LBD探究FDN是否与第二分子协同激活PXR转录。当FDN与E2或EE2共同处理时，FDN对PXR激活的效力和效力都明显增强（图7f， g）。与对接实验一致，较差的FDN/E2混合物使EC50降低了2倍（图6f），而较好的FDN/EE2混合物使EC50降低到纳摩尔范围（图7g）。对于后者，Emax激动剂的活性也上升至与完整激动剂SR12813相同的水平（图7f， g）。接下来，我们比较了E2， EE2和FDN单独或联合提高人结肠腺癌细胞系LS174T中已知PXR靶基因表达的能力（图7h）。利福平（RIF）对hPXR (2.7 μM)的亲和力与FDN相当，因此选择RIF作为阳性对照。与我们的报告基因检测和对接结果一致，我们发现与EE2联合使用时，FDN激活PXR靶基因Mdr1和Cyp3a4的相对有效性略有提高，但显著提高（图7h）。正如预期的那样，RIF和FDN/EE2混合物都没有影响芳香烃受体（AhR）靶基因Cyp1a1的表达（图7h）。为了深入了解FDN和EE2对转录的潜在影响，我们比较了它们在人类回肠类器官中激活hPXR的活性，这些类器官分化为自然肠道组织结构。值得注意的是，FDN单独处理24小时可显著诱导Cyp3a4的表达，与RIF的效果相当，而与EE2共处理进一步诱导了Cyp3a4的表达（图7i）。对ugt1a1的作用略有不同，与RIF相比，FDN单独诱导的ugt1a1表达较弱，但与EE2共同处理后的效果再次超过了RIF（图7j）。在Mdr1中，单独使用FDN对表达没有影响，但当与EE2联合使用时，FDN再次比RIF更有效（图7k）。正如预期的那样，在回肠类器官中去除PXR （Nr1i2）后，对PXR配体处理没有反应（图7i-k）。综上所述，这些结果表明hPXR靶基因的诱导取决于特定的配体组合和靶细胞类型。由于缺乏反馈和次要靶基因应答，在较急症的治疗中也可能观察到差异。
结论
在本研究中，我们利用全nr亲和纯化非靶向质谱（APUMS）28,29以及质谱引导的天然产物发现，表明生姜化合物5E，9e -呋喃二烯酮（FDN）30是一种高选择性PXR激动剂。晶体学分析表明，FDN占据了PXR的配体结合口袋（LBP），但之前发现的一些更大的配体（由螺旋H3， H11和H12分隔）所使用的子口袋位置是空的。进一步的分析表明，FDN和相邻口袋中的类固醇结合，协同结合PXR，从而增强其疗效和效力。也就是说，FDN单独口服治疗能够显著减轻小鼠的系统性炎症和结肠炎，而对其他组织无不良影响，提示FDN在治疗IBD方面具有潜在的应用价值。
Wang X, Zhang G, Bian Z, Chow V, Grimaldi M, Carivenc C, Sirounian S, Li H, Sladekova L, Mott S, Luperi Y, Gong Y, Costello C, Li L, Jachimowicz M, Guo M, Hu S, Wilson D, Balaguer P, Bourguet W, Mani S, Bonati L, Peng H, March J, Wang H, Wang S, Krause HM, Liu J. An abundant ginger compound furanodienone alleviates gut inflammation via the xenobiotic nuclear receptor PXR in mice. Nat Commun. 2025 Feb 3;16(1):1280. doi: 10.1038/s41467-025-56624-0.
