颗粒物 2.5 (PM 2.5 ) 是一种 A 类致癌物，与肺癌风险增加相关。尽管大量流行病学研究证实 PM 2.5暴露是肺癌的危险因素，但 PM 2.5诱发肺癌的分子机制仍然很大程度上未知。
2025年1月17日，首都医科大学吴申申/陈瑞教授团队在Adv Sci 在线发表题为“CircDNA2-Educated YTHDF2 Phase Separation Promotes PM2.5-Induced Malignant Transformation Through the Blunting of GADD45A Expression”的文章。PM2.5暴露后，异常上调的circDNA2通过YTHDF2介导的m6A依赖方式抑制抑癌基因GADD45A mRNA的表达。circDNA2可以特异性结合YTHDF2 LC结构域，促进YTHDF2蛋白的液-液相分离（LLPS），为LLPS与颗粒物污染物诱导的肿瘤发生提供了充分的证据。
摘要
大量流行病学证据表明，PM2.5与肺癌显著相关。然而，这种关联的机制有待进一步阐明。环状rna （Circular RNAs, circRNAs）已成为表观遗传学领域的重要课题，并与多种癌症相关。本研究旨在从表观遗传学角度探讨pm2.5诱发肺癌的分子基础，并识别潜在的生物标志物。初步构建PM2.5慢性暴露模型证实PM2.5暴露促进人支气管上皮（HBE）细胞恶性转化。PM2.5暴露后，异常上调的circDNA2通过YTH n6 -甲基腺苷RNA结合蛋白F2 （YTHDF2）介导的n6 -甲基腺苷（m6A）依赖方式抑制抑癌基因生长停滞和DNA损伤45 α (GADD45A) mRNA的表达。进一步的分析表明，circDNA2可以特异性结合YTHDF2 LC结构域，促进YTHDF2蛋白的液-液相分离（LLPS），为LLPS与颗粒物污染物诱导的肿瘤发生提供了充分的证据。综上所述，本研究为circDNA2在pm2.5诱导的肺癌中的作用提供了新的见解，并证实了其作为潜在的肺癌预后生物标志物的临床价值。
1.长期PM 2.5暴露的HBE细胞中circDNA2的表达和特征
为了进一步探索 PM 2.5诱导肺肿瘤发生的潜在机制，我们在对照 HBE 和长期暴露于 PM 2.5的细胞中进行了环状 RNA 测序 (circRNA-seq) 测定（图 1A）。如图 1B所示，在PM 2.5暴露后，使用截止倍数变化(FC)>1.5和p值<0.05，检测到114个上调的circRNA和123个下调的circRNA 。然后我们选择了 PM 2.5中上调的前 5 个 circRNA-处理的细胞用于定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析。与对照组相比， 位于 chr10:70202673–70206170 上的 CircDNA2 表现出最高的 FC，并且在暴露于 PM 2.5的 HBE 细胞中以浓度依赖性方式上调（图1C），我们因此选择circDNA2进行进一步分析。
图1 长期 PM 2.5暴露的 HBE 细胞中 circDNA2 的表达和特征
CircDNA2 是一种 476 nt 的 circRNA，源自位于 10 号染色体上DNA2基因的外显子 8-10。PCR 产物的 Sanger 测序证实了 circDNA2 的环状结构（图 1D）。此外，circDNA2只能使用来自cDNA的不同引物进行扩增，而不能从HBE细胞中的基因组DNA进行扩增（图 1E），并且对RNase R表现出很强的抗性（图 1F）。为了阐明 circDNA2 的功能，我们检查了其亚细胞表达模式。对 HBE 细胞的胞质和核部分进行 QRT-PCR 分析以及 RNA-FISH 分析表明，circDNA2 在细胞质和细胞核中均富集（图 1G，H）。确认 circDNA2 是否对 PM 2.5有贡献-引发恶性转化，我们检查了circDNA2消融对PM 2.5转化的HBE细胞的影响。通过用 circDNA2 短发夹 RNA (shRNA) 慢病毒 GV112 载体感染 PM 2.5转化的 HBE 细胞，我们建立了 circDNA2 稳定敲低 (KD) 的细胞系。我们发现circDNA2 KD降低了PM 2.5转化的HBE细胞的生长（图 2A）及其迁移和侵袭能力（图 2B，C）。一致地，circDNA2 KD 还降低了 PM 2.5转化的 HBE 细胞 的肿瘤生长和肝或肺转移能力（图2D-F）。总而言之，这些结果证实了 circDNA2作为一种促癌因素参与了 PM 2.5诱导的恶性转化。
图2 长期暴露于 PM 2.5的 HBE 细胞中 circDNA2 的功能
2.CircDNA2通过抑制GADD45A表达促进PM 2.5诱导的恶性转化
接下来，为了阐明circDNA2调节PM 2.5引发的恶性转化的分子机制，通过对车辆对照（NC）和circDNA2 KD组中的HBE细胞进行RNA测序（RNA-seq）分析来筛选circDNA2靶基因（图 3A） 。KEGG富集分析显示，差异表达基因富集在小细胞肺癌和非小细胞肺癌途径中（图 3B），其中包括两个共享基因，即生长停滞和DNA损伤45 α (GADD45A) 和 β (GADD45B)。随后的qRT-PCR结果也证实这两个基因都是circDNA2的潜在靶标（图 3C，D）。然而，当 HBE 细胞暴露于 PM如图2.5所示，仅GADD45A的表达以剂量依赖性方式下调，而没有观察到GADD45B表达的相应变化（图 3E-G）。因此选择GADD45A作为后续实验的靶标。使用新建立的细胞系进行后续实验。正如预期的那样，当circDNA2过表达时，PM 2.5诱导的恶性转化HBE细胞的增殖、迁移和侵袭能力在体外显着增强，在体内肿瘤生长和转移能力也显着增强。然而，当 GADD45A 过表达时，由 circDNA2 OEX 引起的这些影响就会减弱（图 3H-M），暗示 GADD45A 作用于 circDNA2 下游。因此，我们确定circDNA2通过调节下游分子GADD45A参与PM 2.5诱导的HBE细胞的恶性转化。
图3 CircDNA2通过抑制 GADD45A 表达促进 PM 2.5诱导的恶性转化
3.CircDNA2 通过与 m 6 A Reader 蛋白 YTHDF2的 LC 结构域相互作用抑制 GADD45A 表达
鉴于 GADD45A mRNA 受到 circDNA2 的负向调节（图 3C），我们推测 circDNA2 通过与蛋白质结合而不是通过传统的竞争性内源 RNA (ceRNA) 机制来抑制 GADD45A mRNA 表达。为此，我们使用 MS2 标记的 Pull-down 测定筛选了可以与 circDNA2 结合的蛋白质。简而言之，将circDNA2-MS2和flag-MS2载体共转染至HBE细胞中。使用FLAG抗体包被的磁珠、银染色和质谱（MS）分析检测潜在的circDNA2结合蛋白（图 4A）。在被发现可能与 circDNA2 结合的蛋白质中，我们鉴定出了 N6-甲基腺苷 (m 6A) 阅读器蛋白 YTH N6-甲基腺苷 RNA 结合蛋白 F2 (YTHDF2)，它以 m 6 A 依赖性方式调节 mRNA 稳定性（图 4B、C）。因此，选择YTHDF2作为潜在的circDNA2靶标进行进一步分析。MS2标记的下拉测定和YTHDF2 RNA结合蛋白免疫沉淀定量实时逆转录聚合酶链反应（RIP-qPCR）测定进一步证实circDNA2与YTHDF2相互作用（图 4D，E）。qRT-PCR和蛋白质印迹（WB）均证实YTHDF2 OEX抑制GADD45A表达（图 4F，G）并且YTHDF2 KD减弱了circDNA2 OEX对GADD45A的抑制作用（图 4H，I）。正如预期的那样，YTHDF2 OEX 降低了野生型 (WT) GADD45A 报告基因的荧光素酶活性，而这种降低被GADD45A mRNA m 6 A 共有位点的突变所消除（图4J）。YTHDF2 m 6 A 识别突变体 W432A 和 W486A 消除了 YTHDF2 对 GADD45A 蛋白水平的影响（图 4K）。为了进一步阐明 circDNA2 和 YTHDF2 之间的相互作用区域，我们使用过表达截短的 YTHDF2 的 HBE 细胞进行了 Flag-RIP 测定。结果表明，YTHDF2 的 LC 结构域对于其与 circDNA2 的相互作用至关重要（图 4L，M）。Pull-down 测定证实了 YTHDF2 的 LC 结构域和 circDNA2 之间的相互作用（图 4N）。总之，我们的数据表明 circDNA2 通过与 YTHDF2 LC 结构域结合来调节 GADD45A 表达。
图4 CircDNA2 通过与 m 6 A 阅读器蛋白 YTHDF2的 LC 结构域相互作用来抑制 GADD45A 表达
4.CircDNA2 通过与 YTHDF2 LC 结构域结合促进 YTHDF2 LLPS
为了探索circDNA2/YTHDF2调节GADD45A表达的潜在机制，我们首先检测了circDNA2和PM 2.5暴露是否能够调节YTHDF2表达。我们的结果表明，YTHDF2 蛋白表达并未受到 circDNA2 OEX 和长期低水平 PM 2.5暴露的显著影响（图 5A，B）。鉴于蛋白质表达没有变化，我们推测可能涉及另一种作用机制，例如相分离。YTHDF2 LC 的关键作用尤其引起了我们的注意。YTHDF2的LC结构域具有形成液-液相分离(LLPS)的潜力，并且circRNA与LLPS相关事件相关。由于我们已经确认了 circDNA2 和 YTHDF2 LC 结构域之间的特异性结合（图 4），我们假设 circDNA2 通过与 YTHDF2 LC 结构域结合来促进 YTHDF2 LLPS。我们发现circDNA2 OEX显著增加了体内HBE细胞中YTHDF2斑点的形成，而circDNA2 KD抑制了YTHDF2斑点的形成（图 5C，D）。此外，circDNA2在体外促进YTHDF2液滴形成（图 5E）。此外，这种增强作用被 RNase A 减弱，但不被 RNase R 减弱，这表明 YTHDF2 液滴的形成是由 circDNA2 介导的（图 5F）。然后我们探讨了 circDNA2 诱导的表型是否需要 YTHDF2 LLPS。我们首先在 HBE 细胞中构建并过表达 YTHDF2 full-Flag、YTHDF2 LC-Flag 和 YTHDF2 YTH-Flag 载体。如图 5G所示，仅当YTHDF2保留其诱导LLPS和识别m 6 A的能力时，circDNA2才能够抑制GADD45A表达。同时，相分离抑制剂（1,6-己二醇）的添加阻碍了PM 2.5或circDNA2诱导的GADD45A表达的调节（图 5H，I）。总之，这些结果证实了 circDNA2 通过与 YTHDF2 LC 结构域结合来促进 YTHDF2 LLPS。
图5 CircDNA2 通过与 YTHDF2 LC 结构域结合来促进 YTHDF2 LLPS
5.CircDNA2和GADD45A是肺癌潜在的预后生物标志物
鉴于circDNA2在PM 2.5诱导的HBE细胞恶性转化中的重要作用，我们进一步探讨了circDNA2在肺癌中的潜在作用。首先，我们通过组织微阵列（TMA）的原位杂交（ISH）染色分析检测了 90 对肺癌和邻近非肿瘤组织中的 circDNA2 表达。我们观察到肺癌组织中circDNA2表达显着增加（图 6A，B），并发现肿瘤circDNA2水平升高与肺癌患者总生存时间缩短显着相关（图 6C）。多变量Cox回归分析表明，circDNA2低表达是肺癌的独立预后因素（图 6D））。同样，我们证实了肺癌组织中GADD45A的低表达，这也是肺癌的独立不良预后因素（图 6E）。此外，GADD45A水平与circDNA2表达负相关（图 6F）。为了进一步评估 circDNA2 和 GADD45A 表达的预后价值，我们对删失数据进行了时间依赖性受试者工作特征曲线（ROC）分析，结果表明，包括 circDNA2 和 GADD45A 在内的预后模型作为患者存活率的预测指标优于临床指标（图 6G）。
图6 CircDNA2 和 GADD45A 是肺癌潜在的预后生物标志物
结论
总之，我们揭示了 circDNA2 诱导的 YTHDF2 相分离通过减弱 GADD45A 表达来促进 PM 2.5诱导的 HBE 细胞恶性转化的机制，为 LLPS 参与颗粒污染物诱导肿瘤发生提供了明确的证据。此外，我们评估了 circDNA2 和 GADD45A 作为肺癌潜在预后生物标志物的临床价值。这项研究提供了新的见解，指导探索 circRNA 在 PM 2.5诱导的肺癌中的机制作用。
Xu J, Ling Z, Yin L, Xu D, Wu S, Chen R. CircDNA2-Educated YTHDF2 Phase Separation Promotes PM2.5-Induced Malignant Transformation Through the Blunting of GADD45A Expression. Adv Sci (Weinh). 2025 Jan 17:e2410532. doi: 10.1002/advs.202410532.
