Salidroside 是源自红景天的主要活性化合物。据报道，通过刺激血管生成和减少氧化应激可以克服各种器官的缺血。在皮肤修复中，红景天苷被发现可以增强 VEGFA 的表达，促进血管形成。此外，之前的一项研究还表明，红景天苷治疗可通过促进超氧化物歧化酶活性、增加过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平，同时抑制细胞内活性氧的产生来减轻内皮氧化应激。这表明红景天苷具有作为治疗剂的潜力，可通过减轻氧化应激来增强内皮细胞功能并促进血管生成。然而，红景天苷是否有利于卵巢血管生成和衰老卵巢的生育功能尚不清楚。
2025年1月2日，中国农业大学生物学院的张华教授团队在Nature Communications发表了题为“Physiological premature aging of ovarian blood vessels leads to decline in fertility in middle-aged mice”的文章。采用高分辨卵巢器官成像技术结合基因修饰动物模型、单细胞组学以及药物筛选等手段，揭示了哺乳动物卵巢在中年期存在着特异性的血管系统退化，从而导致卵巢血液供给能力下降，卵泡发育受阻，最终导致生殖力衰退。机制研究证实，卵巢血管内皮增龄性老化是导致卵巢在中年期血管退化的原因。更为重要的是，本研究通过对大量天然产物的筛选，发现了红景天苷具有显著提升高龄卵巢血管新生的能力，改善卵巢血供，进而促进卵泡发育，提升高龄小鼠生育力的作用。
摘要
随着女性进入中年，卵巢功能显著下降，但这种下降的机制尚不清楚。在这里，我们利用全器官成像观察中年小鼠卵巢血管（oBV）密度和血管生成强度的显著下降。这导致卵巢血液供应减少，导致卵巢卵泡发育和成熟不足。利用基因修饰的小鼠模型，我们证明颗粒细胞分泌的VEGFA控制卵巢血管生成，但oBV的生理性下降并不归因于VEGFA不足。相反，通过单细胞测序，我们确定卵巢血管内皮的衰老是导致oBV下降的主要因素。因此，红景天苷是一种具有逆转oBV衰老和促进卵巢血管生成功能的天然化合物，其给药显著改善老年女性的卵巢血液供应和生育力。我们的研究结果表明，增强oBV功能是提高女性生育力的一种有前景的策略。
1.卵巢特异性血管功能下降导致中年卵巢血供不足
在成年期，卵巢不断发生血管生成，以重建支持卵泡发育的血管网。为了研究年龄相关性生殖衰退过程中卵巢血管网的变化，我们建立了一个三维全器官血管成像系统，以捕捉不同年龄阶段卵巢血管的发育。简而言之，我们对Tek-CreERT2；mTmG小鼠模型的透明卵巢进行了全器官成像，其中所有血液内皮都表达膜gfp（图1a），以以亚细胞分辨率重建卵巢血管网络的3D图像（图1b）。通过对这些图像的分析，我们可以评估不同年龄阶段卵巢血管的整体轮廓（图1b），同时通过量化尖端细胞（图1b，箭头）的数量来识别血管生成的强度，这些细胞是血管生成的标记细胞。
采用全组织血管成像系统，选取4、8、12月龄女性分别代表生殖活动、生殖衰退、生殖衰老阶段，进行卵巢血管全组织成像。总之，我们观察到在所有年龄的卵巢中都有丰富的血管网（图1c，左）。高分辨率分析显示，在所有年龄的卵巢中都存在尖端细胞（图1c，右，箭头），表明衰老的卵巢中正在发生血管生成。然而，定量分析表明，随着年龄的增长，卵巢基质区尖端细胞的密度显著降低（图1d）。尖端细胞密度的这一下降对应于4个月至12个月期间总体卵巢血管密度的显著降低（图1c，左，e）。此外，当我们分析其他非生殖器官（包括心脏、肝脏、肺和肾脏）的血管密度时（图1f， g），我们发现从4个月到12个月，卵巢的血管密度下降是一个组织特异性特征。这提示年龄相关性卵巢血管密度下降可能与女性生育力下降有关。
卵巢作为一种内分泌腺，其供血效率直接决定其功能。由于卵巢血管密度随年龄增长而显著下降，我们进一步通过体内注射伊文思蓝（EB）染料来评估不同年龄各组织的血液供应状况。静脉注射后，对照耳组织在15分钟内显示了充分的血液灌注，4个月、8个月和12个月的组织之间没有观察到显著的统计学差异（图1h）。然而，蓝色染料进入8月龄和12月龄大鼠卵巢的效率与进入4月龄大鼠卵巢的效率相比明显下降（图1h,i），显示出与衰老相关的卵巢血液供应的显著减少。
图1：年龄相关性卵巢血管从中年开始下降
2. 中年女性血管下降导致体内卵泡发育不足
在卵巢中，最活跃的血管生成发生在卵泡，而卵泡是决定女性生育力的功能单位。因此，我们接下来的重点是卵巢血管生成和血液供应随年龄的变化。通过分析3D卵巢血管成像，我们发现，随着年龄的增长，卵巢卵泡顶端细胞的密度（图2a，箭头）显著下降，从4个月（8.47±2.16）×103/mm3）到12个月（1.57±0.67）×103/mm3）（图2b）。与尖端细胞的下降一致，通过体外培养Tek-CreERT2；mTmG卵泡，对卵泡血管内皮生长的实时成像示踪表明，在8个月和12个月的卵巢中，卵泡血管生长明显迟缓（图2c， d），提示老年卵巢中卵泡血管网络构建不足。有趣的是，虽然中年卵巢出现了明显的卵泡血管生长迟缓，但体外示踪显示，所有年龄段的卵泡发育进展是相似的，24小时内直径增加了约40%（图2c， e）。这一发现提示卵巢血管的下降是卵巢卵泡发育迟缓和生育能力随年龄增长而下降的主要原因之一。
由于体内卵泡的发育严格依赖于血液运输的上游激素，我们接下来测试了中年女性的卵泡血管生成不足是否影响卵泡的血液供应和发育。我们进行了体内EB注射实验，发现与4个月卵巢相比，8个月和12个月卵巢进入卵泡的染料信号显著减少（图2f）。与血液供应的下降一致，我们发现严格依赖上游激素刺激的窦状卵泡的GCs增殖率在8个月和12个月的卵巢中显著降低（图2g， h）。此外，即使我们提供额外的促性腺激素（PMSG），在8个月（7.8±0.5%）和12个月（4.6±0.6%）的卵泡中仅观察到GCs增殖率的小幅增加。这与4个月时（20.5±0.9%）卵泡中GCs增殖的增加形成了鲜明的对比（图2i， j）。这些结果表明，随着年龄的增长，卵巢血管生成和血液供应的减少显著降低了卵泡的生长效率，这可能是中年女性生育力下降的原因。
图2：中年卵巢血管下降降低卵泡发育潜能
3.卵泡颗粒细胞分泌的VEGFA调控成年期卵巢血管生成
为了探索卵巢血管生成下降与衰老相关的机制，我们研究了成人卵巢中活跃血管生成的维持信号，重点关注支持血管生成的关键因子VEGFA的表达。原位杂交染色显示Vegfa主要表达于卵巢的卵泡GCs（图3a，黑色箭头）。随后，我们将GCs特异性fox12 - cre小鼠与Vegfaflox/flox （nocre）小鼠杂交，建立了在卵巢GCs中特异性删除Vegfa的GCs- cre；Vegfafl/fl （vko）小鼠模型（图3b）。RT-PCR分析证实vko卵巢的gc中Vegfa完全缺失（图3c）。组织学分析表明，gcs分泌的VEGFA的缺失显著干扰卵巢发育（图3d）。组织学分析显示，在23 dpp时，卵泡发育受到显著抑制（图3d，箭头），生长卵泡的数量显著减少（图3e，左）。在成年vko卵巢中，没有健康的排卵卵泡，观察到许多空的卵泡样结构（图3d，箭头3e，右），导致vko女性不孕。这些发现表明，gcs分泌的VEGFA对于维持正常卵泡发育，尤其是生长卵泡的发育是必不可少的。
然后，我们继续研究vko女性卵巢血管网的形成。通过对卵巢内血管内皮的免疫染色，我们观察到，随着卵泡发育的进展，vko卵巢内的血管密度显著下降（图3f， g），在23 dpp和6个月时，vko卵巢内只保留了少数血管（图3f， g）。这与相同年龄nocre雌性卵巢内的高密度血管形成了鲜明的对比。此外，我们观察到vko卵巢的卵泡血管构建完全失败，因为所有生长卵泡都缺乏周围的血管（图3f，箭头）。此外，缺乏卵泡血管网导致卵泡对促性腺激素的反应完全失败，即使在广泛的PMSG治疗后，也阻止卵泡发育到窦状阶段（图3h， i）。这些发现强调了gcs分泌的VEGFA在控制活跃的血管生成和血管重建中的作用，并且GCs-VEGFA刺激的卵泡血管网络的构建对促性腺激素诱导的卵泡成熟至关重要。
图3：颗粒细胞分泌的VEGFA控制卵巢血管生成
4.中年女性卵巢血管功能下降与内皮细胞老化有关，而与VEGF分泌不足无关
由于gcs分泌的VEGFA在维持成年卵巢血管生成中的关键作用，我们下一步确定VEGFA分泌的减少是否导致卵巢血管的年龄相关性下降。出乎意料的是，定量分析显示VEGFA在gc中的表达并没有随着年龄的增长而减少。相反，在8个月和12个月的卵巢中，VEGFA的mRNA水平（图4a， b）和蛋白水平（图4c）与4个月的卵巢相比显著增加。这一发现表明，中年女性gc分泌充足的VEGFA，卵巢血管的下降不是由于缺乏刺激物引起的。因此，我们将研究重点转向卵巢血管内皮细胞（oVEs）的衰老相关变化，oVEs是卵巢血管的贡献者。
为了鉴定oVEs中的细胞图谱和基因表达变化，我们从年轻（2月龄）和中年（10月龄）卵巢中分离出Tek阳性细胞，并进行了10× Genomics单细胞RNA-seq分析。然后，选取高度可变的基因进行主成分分析（PCA）和KNN聚类，根据其基因表达特征将Tek阳性细胞分为5个簇（C0 ~ C4）（图4d）。根据特征基因的表达水平，簇0（年轻卵巢52.30%，中年卵巢44.47%）被鉴定为毛细血管（图4e），其高表达Rgcc (Regulator of cell cycle)29，Vwa1 (Von willebrand factor a domain containing protein 1)30和Emcn (Endomucin)31相关标记基因。作为血管网络与营养组织的功能成分，我们发现，与年轻卵巢相比，中年卵巢的卵巢毛细血管比例显著降低（图4e）。这一结果证实了我们的发现，中年卵巢的血液供应减少（图1h， i）。集群1和2被称为稳定的血管，包括动脉（C1，年轻卵巢为11.90%，中年卵巢为14.50%）和静脉（C2，年轻卵巢为7.88%，中年卵巢为7.38%）（图4e）。簇3 （C3，在年轻卵巢中为6.58%）被称为高表达Ccna2（细胞通信网络因子2）36、Top2a（拓扑异构酶（DNA）ⅱα）37和Mki6734的ve的增殖期（图4e）。值得注意的是，中年卵巢缺乏C3，这表明oVE的增殖能力显著降低，这与我们在中年卵巢中观察到的血管生成不足的功能性观察结果一致（图4e）。簇4 （C4，在年轻卵巢中为21.34%，在中年卵巢中为33.65%）由包括Ada（腺苷脱氨酶）38和Itga2（整合素α亚基2）39在内的基因高表达的内皮细胞组成，这些基因随着年龄的增长而显著增加，这意味着血管衰老（图4e）。
为了验证scRNA-seq的结果，我们在收集的不同年龄的女性组织中进行了KI67染色，以检测卵圆细胞的增殖。与对照组织相比，我们注意到虽然只有少数肝脏血管内皮细胞（lVEs）活跃增殖（图4f）。与此相反，随着受试者年龄的增长，卵母细胞与卵母细胞相比显示出持续活跃的增殖，但随着年龄的增长，在卵巢中观察到增殖率的显著下降（图4f）。此外，端粒长度检测显示，随着年龄的增长，oVEs中的端粒长度显著减少，而lVEs中的端粒长度无显著减少（图4g）。在中年女性中，持续的血管生成可能导致卵圆细胞端粒缩短，从而导致这些细胞增殖能力下降和卵巢血液网络不足。
为了进一步探索卵巢细胞中与衰老相关的基因表达变化，我们比较了中青年卵巢细胞的转录组学特征，并进行了基因本体（gene Ontology， GO）分析。我们的研究结果表明，oVEs的主要成分（C0到C2）中的差异表达基因（DEGs）在术语“血管生成的调节”中显著富集（图4h）。在这类基因中，一组刺激血管生成和内皮增殖的基因，包括Edn1（内皮素1）和Tspo（转位蛋白）在中年卵巢的卵中显著下调，而阻碍血管生成的Flt142在中年卵巢的卵中显著上调（图4i，上）。此外，“细胞对氧化应激的反应”和“对氧化应激的反应”也在oVEs中富集，氧化应激相关基因Gpx1、Gsr和Prdx544的mRNA表达水平在中年卵巢中显著降低（图4i，底部）。总之，单细胞测序分析和功能分析表明，氧化应激相关的内皮衰老是导致中年卵巢血管生成和血液供应减少的关键因素。
图4：血管衰老导致中年卵巢血管下降
5.补充红景天苷可通过增强卵巢血管功能改善老年女性生育力
为了评估这些成分在刺激老年卵巢血管生成方面的效果，我们从12月龄的Tek-CreERT2；mTmG雌性小鼠中分离出卵泡，并进行活细胞成像，以监测卵泡和周围gfp阳性血管的生长（图5a）。我们的结果表明，Sal和Ft1在不影响卵泡发育的情况下，都有效地改善了卵泡血管的生长（图5a， b）。此外，统计分析表明，Sal是促进卵巢血管生长最有效的兴奋剂，可以促进老年卵泡血管的生长，达到与年轻卵泡相当的水平（图5b）。在机制上，我们发现补充Sal显著逆转了H2O2诱导的卵泡血管生成抑制，表明Sal减轻了oVEs中的氧化应激积累，从而促进了血管生成。
随后，我们通过连续7天给12月龄的Tek-CreERT2；mTmG雌性小鼠注射Sal（腹腔注射，300 mg/kg体重，每日1次）来评估Sal在增强卵巢血管功能方面的体内有效性（图5c）。处理后，我们获取卵巢进行全组织成像，观察到sal处理后卵泡内的卵圆中顶端细胞密度（（5.71±0.49）× 103/mm3）显著高于对照卵巢（（1.37±0.85）× 103/mm3）（图5d）。同时，在sal处理的卵巢中观察到卵巢血管密度略有升高（图5e）。此外，在EB注射后，与对照组相比，Sal处理的雌性的卵巢和卵泡中检测到显著增加的EB信号（图5f， g），表明Sal的施用增强了卵巢血管功能和老年卵巢的血液供应。
图5：补充红景天苷增强老年卵巢的血管生成和血液供应
随着卵巢血液供应的改善，我们观察到在12月龄时，与对照卵巢（50.8±15.45）相比，在sal处理的卵巢（166.0±32.66）中，生长卵泡的数量较多，尤其是次级和窦前卵泡（图6a）。超排卵实验显示，sal处理的雌性的生长卵泡对PMSG刺激的敏感性增加，导致卵泡颗粒细胞的增殖率显著升高（图6b）。这导致排卵的卵母细胞数量（5.90±3.54）与对照组（1.70±2.26）相比显著增加（图6c）。在我们的体外受精研究中，我们注意到与对照卵巢相比，Sal组排卵的卵母细胞中2-细胞胚胎和囊胚的比例增加（图6d， e），表明Sal处理不仅提高了卵母细胞的数量，而且提高了卵母细胞的质量。最后，我们评估了丹酚酸对雌性的自然妊娠率和出生率的影响，发现与对照组相比，丹酚酸处理雌性7天后的妊娠率（丹酚酸vs.对照组：53.33% vs. 13.33%, n = 15）和产仔数（丹酚酸vs.对照组：2.13±0.31 vs. 0.71±0.62,n = 3组，每组5只雌性）显著增加（图6f）。这些结果表明，Sal是一种安全的逆转卵巢衰老和提高老年女性生育能力的药物。
综上所述，我们的研究强调了衰老卵巢中血管生成和血管老化的显著减少，导致卵巢血供减少和卵泡发育不足，从而导致中年女性卵巢老化和生殖能力下降（图6g，左、中）。补充Sal可以逆转卵巢血管老化，促进卵巢血管生成，从而有效改善老年女性的生育力和生殖质量（图6g，右）。这强调了其作为解决女性生殖老化的一种有前景的新策略的潜力。
图6：补充红景天苷可提高老年女性的生育能力
结论
总之，我们的研究表明，卵巢血管老化是导致中年女性卵巢老化和生育力下降的重要因素。这些结果为更深入、更全面地理解卵巢发育和女性生育力的保存提供了有价值的视角。此外，我们的研究也提供了一种提高高龄妇女生育能力的临床方法，通过促进卵巢血管的再生来提高卵泡发育的质量，最终恢复生育能力。Sal的发现也为未来对抗女性生殖衰老提供了一条有希望的途径。
Mu L, Wang G, Yang X, Liang J, Tong H, Li L, Geng K, Bo Y, Hu X, Yang R, Xu X, Zhang Y, Zhang H. Physiological premature aging of ovarian blood vessels leads to decline in fertility in middle-aged mice. Nat Commun. 2025 Jan 2;16(1):72. doi: 10.1038/s41467-024-55509-y.
