牙周炎是一种常见的口腔疾病，其特征是牙龈持续发炎、牙槽骨吸收，最终导致牙齿脱落。流行病学调查显示，全球50%以上的成年人患有牙周炎，其中约8%为重度牙周炎。Eupalinolide B (EB) 是从 Eupatorium lindleyanum DC 中提取的主要倍半萜类化合物之一。近年来的研究表明，EB 具有抗神经炎、抗急性肺损伤和抗肝癌的作用。
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2025年1月14日，南方科技大学第一附属医院王继刚教授团队在MedComm（IF=10.7）发表题为“Eupalinolide B inhibits periodontitis development by targeting ubiquitin conjugating enzyme UBE2D3”的文章。通过ABPP技术鉴定野马追内酯B的靶点是UBE2D3。EB 通过靶向 UBE2D3 抑制 IκBα 泛素化降解，导致核转录因子 -κB 信号通路失活来改善牙周炎。
摘要
牙周炎是成人常见的由牙周病原菌引起的慢性牙周炎症性疾病。Eupalinolide B (EB) 是从 Eupatorium lindleyanum 中提取的倍半萜类天然产物，已被报道为治疗癌症和免疫疾病的潜在药物。在此，我们首次探讨了EB对牙周炎的改善作用及其潜在分子机制。我们通过结扎牙周炎小鼠模型证明 EB 可改善牙周炎症和牙槽骨吸收。此外，在 Raw264.7 细胞系中检查了 EB 对巨噬细胞炎症的影响。我们通过使用基于活性的蛋白质分析的化学蛋白质组学方法，确定了泛素结合酶 UBE2D3 作为 EB 的直接共价结合蛋白靶标，生物层干涉测量法和细胞热位移测定法。此外，使用高分辨率质谱法鉴定了 EB 与 UBE2D3 的直接结合位点，并通过实验证实。综上所述，EB 通过靶向 UBE2D3 抑制 IκBα 泛素化降解，导致核转录因子 -κB 信号通路失活来改善牙周炎。炎症巨噬细胞中 siRNA 介导的基因敲低证实了这一点。我们的结果表明EB可能是一种新型的UBE2D3抑制剂，并可能成为一种有前途的抗牙周炎治疗剂。EB 通过靶向 UBE2D3 抑制 IκBα 泛素化降解，导致核转录因子 -κB 信号通路失活来改善牙周炎。炎症巨噬细胞中 siRNA 介导的基因敲低证实了这一点。我们的结果表明EB可能是一种新型的UBE2D3抑制剂，并可能成为一种有前途的抗牙周炎治疗剂。EB 通过靶向 UBE2D3 抑制 IκBα 泛素化降解，导致核转录因子 -κB 信号通路失活来改善牙周炎。炎症巨噬细胞中 siRNA 介导的基因敲低证实了这一点。我们的结果表明EB可能是一种新型的UBE2D3抑制剂，并可能成为一种有前途的抗牙周炎治疗剂。
1 EB在体内发挥抗牙周炎症和牙槽骨丢失作用
为了探讨EB是否对牙周炎具有保护作用，建立了基于C57BL/6小鼠的结扎诱导牙周炎实验模型。每天给小鼠腹腔注射或不注射 EB，持续 14 天，以评估对牙周炎引起的炎症和牙槽骨吸收的影响（图 1A）。牙骨质连接处与牙槽骨嵴之间的距离（CEJ-ABC）是评价牙槽骨吸收的临床指标（图 1B、C）。骨体积/组织体积（BV/TV）百分比用于量化骨矿物质密度并解释骨量的变化。与对照组相比，Lig + 生理盐水组牙周上颌骨吸收显著，而 Lig + EB 组牙槽骨吸收减轻（图 1B - D）。苏木精和伊红（HE）染色表明，EB可以减轻实验性牙周炎小鼠的炎症细胞浸润并减轻牙槽骨破坏（图 1F）。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色结果显示，与对照组相比，Lig+盐水组破骨细胞增多。值得注意的是，EB 治疗实际上减少了结扎牙周炎小鼠模型中牙槽骨中的破骨细胞（图 1E，F），这表明与对照组相比，Lig + 盐水组的骨吸收明显更高，而 EB 减弱了结扎牙周炎的不良趋势。牙槽骨吸收。这些结果表明EB可以有效改善牙周炎性损伤并抑制牙周破坏。
图1 Eupalinolide B 可减轻体内牙周炎
2 蛋白质组学分析证明NF-κB信号通路参与EB抗牙周炎作用
为了进一步研究 EB 抑制牙周炎的潜在机制，我们对小鼠牙龈组织进行了全面的蛋白质组分析。主成分分析和热图显示，对照组、Lig + 盐水组和 Lig + EB 组之间存在显著差异（图2A）。与牙周炎组相比， EB治疗组中有112种蛋白质显着减少（倍数变化<0.8，p值<0.05），362种蛋白质增加（倍数变化>1.2，p值<0.05）。然后，应用基因本体论和京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径分析来分析差异表达的蛋白质（图 2B）。值得注意的是，EB 给药下调了“NF-κB 转录因子活性的正向调节”、“免疫系统过程”和“先天免疫反应”途径（图 2B）。为了探讨体内EB对NF-κB活化的抑制作用，采用免疫荧光染色法检测小鼠牙龈组织中p-NF-κB p65的分布和表达情况。如图 2C所示，与对照组相比，Lig+生理盐水组小鼠第二磨牙牙周区牙龈组织中p-NF-κB p65荧光显著增强，而EB给药抑制p-NF-κB p65表达（图 2C、D）。此外，我们分析了结扎位点邻近牙龈组织中 NF-κB 下游基因的转录水平。结果显示， Lig + saline组iNOS、CCL-2、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平显着高于对照组，而EB则显着降低转录水平。水平（图 2E - J）。这些结果表明EB可以通过抑制体内NF-κB转录因子活性来抑制实验性牙周炎。
图2 小鼠牙龈组织中的蛋白质组确定了下调的途径
3 EB抑制Pg-LPS诱导的NF-κB通路
进一步评估了 EB 对 Pg-LPS 诱导的 NF-κB 信号通路激活的影响。我们发现，在 4 µM 和 8 µM 的较低浓度下，IκBα 的磷酸化均被 EB 显著抑制（图 3A、B）。此外，在 Raw264.7 细胞中，Pg-LPS 处理后，IκBα 显著稳定，磷酸化 NF-κB p65 水平被 EB 下调（图 3A、B）。我们还发现，在Pg-LPS刺激后，EB显著抑制NF-κB p65的核转位（图 3C）。为了进一步阐明 EB 处理的 Raw264.7 细胞中 NF-κB 驱动的转录活性降低的后果，进行 qPCR 来测量NF-α、IL-6和IL-1β（NF-下游基因）的转录水平。κB 通路（图 3D – F）。此外，还利用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量了上述相关炎症因子的分泌情况（图 3G - I）。结果表明，与对照组相比，EB处理的细胞中上述炎症细胞因子的mRNA水平和分泌水平均显著受到抑制。
图3 Eupalinolide B (EB) 抑制细胞中的核转录因子-κB (NF-κB) 信号通路
4 ABPP蛋白质组分析证实UBE2D3为EB的靶蛋白
鉴于EB显著的抗炎作用，我们基于ABPP分析技术进一步探讨了EB的靶蛋白和分子机制（图 4A）。简而言之，合成了一种基于活性的 EB-P，其带有可点击的 EB 炔烃标签（图 4B）。荧光染料 TAMRA 或生物素可以通过点击化学反应与 EB-P 连接，以标记 EB 直接结合的蛋白质靶点。然后，目标蛋白可以通过质谱法进行鉴定或通过荧光成像进行可视化（图 4A）。EB和EB-P之间的抗炎生物活性没有显著差异，表明EB-P可以代替EB进行目标识别和荧光成像实验。我们进一步将Raw264.7细胞与EB-P孵育不同时间并进行亚细胞定位实验。结果显示，EB-P随着时间的推移逐渐进入细胞，2小时后荧光强度达到最强（图 4D）。我们观察到 EB-P 可以标记定位于细胞质和细胞膜的靶蛋白（图 4D）。为了通过ABPP方法进一步鉴定EB的直接靶蛋白，将活化的RAW264.7细胞用或不用EB预处理，然后用50μM EB-P标记4小时，将EB-P共价标记的靶蛋白与通过点击化学反应产生荧光染料，然后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行电泳分离，并通过荧光成像进行可视化（图 4E）。正如预期的那样，50 µM EB-P 可以标记大多数细胞蛋白质，并且蛋白质的标记被 RAW264.7 细胞中预孵育的 400 µM EB 竞争掉（图 4E），表明 EB-P 标记蛋白具有特异性。然后，EB-P标记的目标蛋白通过链霉亲和素琼脂糖富集，并通过胰蛋白酶消化成肽。最后，通过二甲基化标记对肽进行定量并通过质谱进行鉴定。从鉴定的总共 1247 个蛋白质中筛选了 79 个候选靶蛋白（探针/con 的倍数变化 > 1 和竞争/探针 < 1，p值 < 0.05）（图 4F），值得注意的是，UBE2D3最高的探针与竞争比，探针组显著高于竞争组（图 4F）。作为一种泛素结合酶，UBE2D3 参与蛋白质的翻译后泛素化。此外，对候选靶蛋白的KEGG通路分析显示，靶蛋白主要富集于“泛素介导的蛋白水解”（图 4G）。一致地，我们注意到在 SDS-PAGE 中的 EB-P 泳道中观察到的主要不同条带之一与 UBE2D3 蛋白具有相似的分子量，约为 17 kDa，而在没有 EB-P 孵育的泳道中未观察到这一点。EB 竞赛车道中的强度显著降低（图 4E）。综上所述，上述结果表明UBE2D3是EB潜在的直接靶蛋白。
图4 Raw264.7 细胞中 Eupalinolide B (EB) 靶蛋白的鉴定
5 EB直接靶向RAW264.7细胞中的UBE2D3
我们通过在 RAW264.7 细胞中 EB-P 预孵育后用抗体进行免疫荧光染色来研究 UBE2D3（绿色）的定位，然后通过点击反应将 EB-P 与 TAMRA 标签（红色）连接（图 5A）。结果显示UBE2D3和EB-P主要在细胞质中共定位（黄色）（图 5A）。此外，通过细胞热位移分析-蛋白质印迹（CETSA-WB）实验评估了UBE2D3蛋白的热稳定性，结果表明，与对照组相比，EB增强了UBE2D3的热稳定性（图 5B）。为了深入了解EB与UBE2D3结合的分子机制，用EB-P处理重组小鼠UBE2D3蛋白，然后进行点击化学反应。结果表明，重组UBE2D3蛋白被EB-P浓度依赖性标记（图 5C）。接下来，我们对重组UBE2D3蛋白进行了EB-P竞争实验。UBE2D3用不同浓度的EB或碘乙酰胺（IAA，半胱氨酸烷化剂）预处理，然后与EB-P一起孵育。结果显示，与EB类似，IAA也显著削弱了EB-P与UBE2D3蛋白的结合，表明EB-P可以与UBE2D3的半胱氨酸残基结合（图 5D）。此外，我们使用含有炔基（IAA-yne）的IAA-炔基探针代替EB-P，可以通过点击化学反应与半胱氨酸结合来进行竞争实验。46值得注意的是，UBE2D3 可以被 IAA-yne 标记，而 EB 和 IAA 都可以显著竞争 IAA-yne 与 UBE2D3 蛋白的结合（图 5E）。此外，EB-P不仅可以拉低活化Raw264.7细胞的细胞裂解液中的UBE2D3，并且可以被EB竞争掉（图 5F），而且可以有效地与小鼠牙龈组织中的UBE2D3蛋白结合并浓缩。-由 EB 管理部门独立竞争（图 5G），表明EB在体外和体内均可直接结合UBE2D3蛋白。为了进一步证实UBE2D3和EB之间的直接相互作用并确定其动态特性，我们使用生物层干涉测量（BLI）技术测量了EB和UBE2D3之间的平衡解离常数，发现EB与UBE2D3显著结合，结合亲和力（K d值）为 9.25 µM（图 5H、I）。
图5 Eupalinolide B (EB) 和 UBE2D3 之间的直接相互作用
6 EB共价靶向UBE2D3蛋白并与Cys85残基结合
此外，为了确定 EB 与 UBE2D3 的特异性结合位点，将重组 UBE2D3 在有或没有 EB 的情况下孵育，然后用胰蛋白酶将蛋白质消化成肽。通过液相色谱结合基于质谱的方法对肽进行分析。通过高分辨率质谱法以高置信度鉴定了分子量为 2504.24 的肽，该肽具有明确的质量变化，该肽源自 EB 孵育样品中 UBE2D3 蛋白的消化（图 6A）。该肽片段含有UBE2D3的活性胱氨酸Cys85，表明UBE2D3在Cys85处被EB修饰。有趣的是，没有发现含有其他游离半胱氨酸的肽被 EB 修饰，这表明 EB 与 UBE2D3 存在共价结合，对 Cys85 残基具有空间选择性。随后，使用 UBE2D3-C85A 突变体反向验证 EB-P 标记和 EB 结合亲和力实验（图 6B）。为了进一步推导UBE2D3活性位点残基的动态行为，我们进一步利用Maestro软件在真实溶液环境条件下进行了100 ns的分子动力学模拟，并分析了它们的分子动力学轨迹。使用均方根偏差（RMSD）相对于模拟时间的曲线来测试系统的构象稳定性。结果表明，UBE2D3（黑色）或EB-UBE2D3复合物（红色）中α-碳（Cα）原子的RMSD值最终在10 ns后达到平衡状态，波动很小（图 6C），表明复杂结构在模拟过程中达到了稳定状态。EB 与 UBE2D3/EB 复合物系统中整个分子轨迹上的氨基酸 ILE84、CYS85 和 LEU89 产生连续接触（接触以橙色显示）（图 6D），进一步表明 EB 和 UBE2D3 形成了强相互作用。
分子对接模拟使 EB 和 UBE2D3 的结合状态可视化。从所提出的结合模型可以发现，EB的立体构象与作为结合位点的活性Cys85残基非常吻合（图 6E），并且EB中的羟基和羰基与UBE2D3的Ile84和Leu89残基形成氢键，分别（图 6F）。作为倍半萜内酯化合物，EB 含有 α,β-不饱和羰基部分，可以通过 Michael 加成与 UBE2D3 的游离半胱氨酸残基在 Cys85 处共价结合。基于上述发现，考虑到EB可以与UBE2D3结合并抑制IκBα降解和NF-κB活化，我们得出结论，EB与Cys85通过Michael加成形成共价加合物，从而失活UBE2D3。
图6 Eupalinolide B (EB) 与 UBE2D3 的半胱氨酸残基共价结合
7 沉默Ube2d3损害活化RAW264.7细胞中EB介导的抗炎保护作用
为了进一步研究UBE2D3在抗炎活性中的具体作用以及EB对牙周炎的影响，我们在Raw264.7细胞中转染siRNA以敲低（KD）Ube2d3。与si-NC对照组相比，si- Ube2d3在蛋白水平上显著抑制UBE2D3表达（图 7A）。暴露于 EB 后，磷酸化 IκBα 在 Pg-LPS 刺激下降低，而在Ube2d3 KD 后显著上调。然而，观察到Ube2d3沉默组中 IκBα 的蛋白水平显著下降（图 7A）。WB进一步研究了EB对NF-κB激活的影响，结果显示EB有效降低了激活的Raw264.7中Pg-LPS诱导的激活的NF-κB p65（p-NF-κB p65）的水平细胞。然而，在Ube2d3沉默组中，EB对NF-κB激活的抑制作用显著降低（图 7A）。此外，在Pg-LPS刺激下，通过免疫荧光染色，EB显著抑制NF-κB p65的核转位，而Ube2d3 KD则降低了抑制作用（图 7B）。上述实验表明，Ube2d3KD 特异性阻断 EB 处理诱导的 IκBα 去磷酸化和稳定化，从而逆转 EB 对 NF-κB p65 磷酸化和稳定化的抑制作用。为了检查Ube2d3沉默的 Raw264.7 细胞中 NF-κB 驱动的转录活性增加的结果，使用实时 qPCR 来检测参与 NF-κB 信号通路的基因的水平。结果显示，Ube2d3 KD 显著逆转了 NF-κB 下游基因iNOS、CCL-2和COX-2的下调（图 7C – E）。此外，使用 ELISA 测定 NF-κB 通路下游细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的分泌水平（图 7F – H）。一致地，与对照相比，EB 处理对细胞因子释放的抑制在Ube2d3中也被逆转沉默的群体。上述结果表明EB对细胞炎症的抑制作用是由UBE2D3蛋白介导的。在本研究中，我们证明EB与UBE2D3的Cys85残基共价结合，有效抑制UBE2D3的活性，阻止IκBα的降解和NF-κB的激活，抑制下游炎症基因的表达和促炎因子的释放。炎症细胞因子，最终抑制牙周炎症的进展。总的来说，我们的研究提供了一种有前途的治疗牙周炎的候选药物。
图7 Ube2d3 的敲低会抑制 Eupalinolide B (EB) 的抗炎活性
结论
为探讨EB对牙周炎的治疗作用，本研究首次合成了EB的特异性探针，并利用基于活性的蛋白谱（activity-based protein profiling， ABPP）技术筛选了该探针的直接靶蛋白UBE2D3。基于小鼠牙周组织蛋白质组学研究，阐明了EB抑制NF-κB炎症信号通路的分子机制。事实上，通过高通量筛选技术获得EB调控的靶点和潜在通路更为合理。此外，我们通过高分辨率质谱鉴定了EB与UBE2D3蛋白的Cys85残基共价结合，并进一步证明了Cys85对EB与UBE2D3蛋白结合至关重要。EB抑制UBE2D3-NF -κB信号通路可能有助于减轻牙周炎的进展。
Kuang W, Zhuge R, Song P, Yi L, Zhang S, Zhang Y, Wong YK, Chen R, Zhang J, Wang Y, Liu D, Gong Z, Wang P, Ouyang X, Wang J. Eupalinolide B inhibits periodontitis development by targeting ubiquitin conjugating enzyme UBE2D3. MedComm (2020). 2025 Jan 14;6(1):e70034. doi: 10.1002/mco2.70034.
