代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）是代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）的进行性亚型，可选择的药物治疗有限。核苷磷酸激酶2(cmpk2),一种主要位于线粒体中的核苷磷酸激酶,调节线粒体DNA(mtDNA)的合成。在脂多糖(LPS)刺激下,巨噬细胞表现为干扰素调控因子1(IRF1)转录增加,随后Cmpk2表达升高。cmpk2介导的线粒体DNA合成导致活性氧簇（ROS）氧化线粒体DNA （ox-mtDNA）的产生。ox-mtDNA通过线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mptp）和电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channels, vdac）从线粒体释放，随后激活NLRP3炎症小体。
2025年1月22日，中国药科大学肖易倍/徐晓军团队在J Hepatol（IF 26.8）在线发表题为“Hepatocellular CMPK2 promotes the development of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis”的文章。发现CMPK2在MASH患者和饮食诱导的MASH小鼠的肝脏中显著上调。肝脏Cmpk2过表达通过Nlrp3炎症小体激活和细胞焦亡加重了肝损伤、炎症和纤维化。去甲二氢愈创木酸（NDGA）是一种有效的CMPK2抑制剂，可抑制MASH进展。
•CMPK2在肥胖患者和MASH小鼠的肝脏中上调。
•肝细胞CMPK2与MASH发展期间的炎症和纤维化相关。
•在脂肪性肝炎中，CMPK2缺失可降低NLRP3炎症小体活性和细胞焦亡。
•药物抑制CMPK2可减轻肝损伤和代谢功能障碍。
摘要
利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus， GEO）数据库和从MASH患者获得的人肝组织鉴定MASH中的差异表达基因。我们在肝细胞特异性过表达小鼠、条件敲除小鼠和几种小鼠MASH模型中评估了胞苷/尿苷单磷酸激酶2 （CMPK2）的功能作用。通过表面等离子体共振成像结合间接酶活性检测发现CMPK2抑制剂。CMPK2，一个参与线粒体DNA合成的关键酶，在患有MASH的肥胖个体和饮食诱导的MASH小鼠的肝脏中表现出显著的上调。肝细胞特异性Cmpk2缺失显著减轻了小鼠的肝损伤、炎症和纤维化。通过基因调控或去甲二氢愈创木酸（NDGA）药物干预抑制CMPK2，可抑制nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （Nlrp3）炎症小体活化和随后的肝细胞焦亡。此外，NDGA减轻了饮食诱导的代谢紊乱，炎症和纤维化。这些发现证实了CMPK2是代谢功能障碍相关脂肪肝（MASL）进展为MASH的关键介质，并突出了其作为代谢性疾病治疗靶点的潜力。
影响和意义
CMPK2在MASH阶段表达上调，但在MASLD的早期阶段没有。我们的研究表明，在肝细胞特异性cmpk2敲除小鼠中，饮食诱导的MASH表型，包括肝损伤、炎症和纤维化减轻。这些发现表明，CMPK2在脂肪肝进展为脂肪性肝炎的过程中起关键作用，为MASH的发展提供了新的机制见解。此外，这一发现表明CMPK2是开发MASH治疗药物的一个有前景的靶点。
1.CMPK2在MASH患者和饮食诱导的MASH小鼠的肝组织中表达上调
对三个独立的基因表达综合（Gene Expression Omnibus， GEO）数据库（GSE89632、GSE63067和GSE130970）进行的分析侧重于从健康人和MASH患者获得的肝样本，以确定关键的差异表达基因。针对MASLD表达谱的分层强调了CMPK2作为一个独特的鉴别标志物，显示了与对照样本相比，MASH样本中的选择性上调(图1A)。免疫组织化学染色显示，CMPK2在MASH患者的肝组织中表达显著上调（图1B）。为了验证CMPK2在MASLD/MASH不同阶段的作用，我们使用了ob/ob小鼠和不同时间的高脂饮食（HFD）或高脂高果糖高胆固醇（HFFC）饮食的小鼠。在ob/ob小鼠中，Cmpk2表达升高与肝脂肪变性和f4 /80阳性巨噬细胞浸润增加一致（图1C-E）。在HFD喂养24周后，这些小鼠表现出Cmpk2表达增加，同时伴有炎症细胞浸润和纤维化（图1F-H）。同样，12周时，HFFC饮食的小鼠显示出最小的Cmpk2表达变化(图S1I-K)，但在22周时显著增加（图1I-K）。这些数据表明，Cmpk2表达的升高特异性地表现在MASH阶段，而不是在MASLD的早期阶段。Cmpk2的表达主要在MASH肝脏的肝PCs中升高，表明其在MASH进展中发挥重要作用。
图1 CMPK2在MASH患者和饮食诱导的MASH小鼠的肝组织中表达上调
2.Cmpk2过表达可加重饮食诱导的肝损伤、炎症和纤维化
为了确定Cmpk2在MASH中的关键作用，我们使用携带Cmpk2过表达盒的8型腺相关病毒（AAV-Cmpk2）诱导肝细胞特异性Cmpk2过表达（AAV-Cmpk2，图2A、B）。接受AAV-Cmpk2并接受16周HFFC饮食的小鼠在体重或脂质积累方面没有显著变化（图2C-G）。然而，组织学分析显示AAV- Cmpk2小鼠的肝脏MASH显著进展，尤其是小叶炎症（图2G）。过表达加重了肝损伤（图2E和H），并导致f4 /80阳性细胞增加，血清促炎标志物（IL-1β和MCP-1）升高，炎症基因表达增强（图2I-L）。此外，AAV-Cmpk2小鼠肝组织中Col3a1（图2K）和羟脯氨酸含量（图2M）增加，伴随纤维化相关基因表达升高（图2N）。这些发现强烈提示肝脏Cmpk2表达的升高加速了MASH的进展。
图2 Cmpk2过表达加速了MASH的进展
3.肝细胞特异性Cmpk2缺陷可阻止MASH的发展
通过Cmpk2-Flox小鼠和Alb-Cre小鼠杂交获得肝细胞特异性cmpk2敲除小鼠（Cmpk2-hKO）。经过22周的HFFC饮食喂养后，在Flox和Cmpk2-hKO小鼠之间，未观察到身体和肝脏重量、脂肪量或脂质积累的显著差异（图3A-D)。然而，Cmpk2-hKO小鼠的NAS评分较低，肝损伤改善（图3E-F），血清IL-1β和MCP-1水平降低（图3G-H）， f4 /80阳性细胞显著减少，肝脏样本中促炎细胞因子和趋化因子表达减少（图3I-J）。这些小鼠还表现出胶原沉积、羟脯氨酸水平和胶原生成相关基因表达减少（图3I， 3K-L）。总之，这些结果表明Cmpk2可能显著促进MASH的进展。
图3 肝细胞特异性Cmpk2敲除改善了hffc诱导的肝损伤、炎症和纤维化
4.Cmpk2介导饮食诱导的Nlrp3炎症小体活化和肝细胞焦亡
通过检测肝组织中NLRP3、caspase-1和Il-1β的表达，探讨CMPK2表达与NLRP3炎症小体活化的关系。在MASH表型小鼠的肝脏中检测到ox-mtDNA水平升高和炎症。注射AAV-Cmpk2的小鼠肝组织中，mtDNA含量、ox-mtDNA水平和Nlrp3炎症小体活化显著增加（图4A-C）。在hffc喂养的小鼠原代肝细胞中，Cmpk2过表达增强了总mtDNA和ox-mtDNA水平，同时增强了Nlrp3炎症小体的激活（图4D-F）。在肝细胞特异性cmpk2敲除小鼠的肝组织和分离的原代肝细胞中，升高的mtDNA含量、ox-mtDNA水平和Nlrp3炎症小体活化均被减弱（图4G-L）。这些结果强调，肝细胞Cmpk2水平的升高与Nlrp3通过氧化- mtdna生成增加而激活相关，这与之前的发现一致。
图4 Cmpk2促进了饮食诱导的Nlrp3炎症小体活化
为了验证Cmpk2在肝细胞焦亡中的作用，我们分析了Gsdmd-N蛋白水平，并在肝组织中进行了末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色。有趣的是，AAV-Cmpk2小鼠的肝组织中细胞焦亡增强（图5A）。同样，过表达Cmpk2的原代肝细胞表现出碘化丙啶（PI）阳性细胞增加、乳酸脱氢酶（LDH）释放增加（图5B）和较高的Gsdmd-N水平（图5C）。相反，Cmpk2-hKO小鼠的肝细胞焦亡减少，而非坏死或凋亡（图5D和图S8N-O）。此外，cmpk2缺陷的原代肝细胞显示LDH释放（图5E）、Gsdmd-N水平（图5f）和pi阳性细胞计数显著减少。这些发现表明，在缺乏Cmpk2的肝细胞中，饮食诱导的细胞焦亡受到抑制。
图5 Cmpk2促进饮食诱导的肝细胞焦亡
6.CMPK2抑制剂NDGA可降低Nlrp3炎症小体活化和肝细胞焦亡
阻断Cmpk2可抑制Nlrp3炎症小体活化和细胞焦亡，提示其可能是MASH进展的治疗策略。我们采用了一种创新的筛选方法，将SPRi与间接酶活性检测（IEAD）相结合，以识别直接的CMPK2抑制剂（图6A）。在3,180个化合物中，22个对CMPK2具有高亲和力。IEAD测量的ATP水平是CMPK2活性的反向指标，较高的ATP浓度表示较低的酶活性。我们发现NDGA是22种高亲和力化合物中最强的CMPK2抑制剂，IC50为6.003 μM（图6B）。表面等离子体共振（SPR）表明CMPK2的结合亲和力KD值为3.77x10-7M（图6C）。与MCC950不同，NDGA降低了HFFC饮食喂养小鼠的原代肝细胞中的ox-mtDNA水平（图6D-E）。NDGA显著抑制caspase-1活化和IL-1β加工，而不影响pro-IL-1β和pro-caspase1水平（图6F）。NDGA和MCC950均减少了LDH释放和PI染色（图6G）。然而，在CMPK2过表达后，NDGA的保护作用减弱（图6H-K）。总之，NDGA被确定为CMPK2抑制剂，可有效调节Nlrp3炎症小体活化和肝细胞焦亡。
图6 NDGA抑制CMPK2活性，减少肝细胞焦亡
7.NDGA减轻了HFFC饮食诱导的大鼠MASH表型
为了研究NDGA在体内的作用，在22周的高脂饮食实验的最后8周，小鼠接受NDGA（50, 100，或150 mg/kg）治疗。NDGA给药使小鼠的体重和肝脏重量减轻，但不影响摄食量（图7A-C）。在HFFC饮食喂养的小鼠中，NDGA治疗引起了显著的代谢改善，表现为脂质谱增强、肝脂肪变性减轻和脂肪减少（图7D-F）。NDGA治疗显著降低了肝损伤（图7E-H）和NAS评分，同时改善了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性（图7G-J）。此外，NDGA降低了炎症反应（图8A-D），降低了mtDNA和ox-mtDNA水平（图8E-F），抑制了Nlrp3炎症小体活化和细胞焦亡（图8G），并减轻了肝纤维化（图8H-J）。
图7 NDGA改善了HFFC饮食诱导的肥胖、血脂紊乱和胰岛素抵抗
图8 NDGA抑制HFFC饮食诱导的炎症和纤维化
结论
综上所述，CMPK2是一种桥接肝脏脂肪变性和炎症的新型介质，有望成为代谢性疾病的治疗靶点。
CMPK2在MASH肝脏中的上调促进mtDNA和随后的氧化-mtDNA的产生。释放的ox-mtDNA激活NLRP3炎症小体，触发肝细胞焦亡和促炎介质释放。这一级联反应放大了炎症信号并加剧了纤维化。NDGA是CMPK2的特异性抑制剂，通过抑制CMPK2的酶活性来抑制这一病理通路。
