Nat Commun | 6-和8-姜酚变构激活GPX4保护绝经后骨质疏松症

2025年1月17日，暨南大学李怡芳/何蓉蓉，南方医科大学王晓刚团队在Nat Commun（IF=14.7）发表题为“Regulation of enzymatic lipid peroxidation in osteoblasts protects against postmenopausal osteoporosis”的文章，揭示成骨细胞中的磷脂过氧化在绝经后骨质疏松症中起关键作用。而GPX4的两种天然变构激活剂6-和8-姜酚促进成骨细胞生成并表现出显著的抗骨质疏松作用。

摘要

1.磷脂过氧化是人类和小鼠骨质疏松骨组织的重要代谢特征

为了进一步阐明高脂蛋白过氧化与骨质疏松症之间的相关性,我们首先对老年股骨头置换患者的骨组织中作为高脂蛋白过氧化的关键最终产物的4-Hne水平进行了量化。我们的结果显示,随着年龄的增长,股骨头组织中的4Hne含量逐渐升高(图1a )。同样地,观察到4-Hne水平升高在两个OVM小鼠的股骨和胫骨(图1b, c )和衰老老鼠(图1d, e ),提示高脂类脂质过氧化与骨质疏松的进展有关。值得注意的是,4-Hne积累在奥特氏体小鼠的小梁骨中尤为显著,特别是在成骨细胞中(图1f )。此外,4-HE染色与碱性磷酸酶(ALP)--一种成熟的成骨细胞标记物--共合,在OVX小鼠的股骨头切片上(图1g, h ),提示骨质疏松症骨中的成骨细胞受到脂质过氧化的不利影响。

为了进一步确定骨质疏松性骨中存在的氧化磷酸酯(OXPLS)种类的特征,我们用LC-MS对其进行了相对含量的分析。热图强调了oxPLs谱的显著差异，在OVX骨组织中氧化磷脂酰乙醇胺（oxPEs）和氧化磷脂酰胆碱（oxPCs）的水平富集，这被投影分析中的变量重要性（VIP）证实（图1i）。火山图进一步表明，在OVX（图1j）和老年小鼠中，oxPLs水平显著增加，这与之前的研究一致，表明中和oxPLs可减轻老年性骨质疏松。为了验证磷脂过氧化作用在骨质疏松中的作用，我们在去卵巢手术的小鼠中每日灌胃给予维生素E （α-生育酚），一种脂质过氧化物自由基的清除剂，从去卵巢手术后一周开始。Micro-CT分析表明，通过维生素E （100 mg/kg）抑制磷脂过氧化显著预防了OVX诱导的骨丢失（图1k），并显著提高了OVX小鼠股骨的骨密度（BMD）、骨体积与组织体积比（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）（图1l）。这些发现强调了维生素E对OVX小鼠的保护作用。

图1:老年人和OVX小鼠的骨质疏松性骨组织中积累了过多的磷脂过氧化物

2.GPX4在OVX和老龄小鼠成骨细胞中表达下调

磷脂酰辅酶a合成酶长链家族成员4 （ACSL4）、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 （LPCAT3）和15-脂氧合酶（ALOX15）是调节磷脂过氧化的关键酶。值得注意的是，GPX4是唯一能够中和磷脂过氧化物的酶17（图2a）。为了阐明磷脂过氧化相关基因在骨质疏松症中的作用，我们进行了qPCR检测，结果显示Alox15、Ptgs2、Lpcat3、Acsl4和Tfrc在OVX小鼠（图2b）和老龄小鼠（图2g）中的表达均上调，同时Gpx4的表达显著下调。同样，在老年患者（图2c）、OVX小鼠（图2d）和老年小鼠（图2h）的骨组织中，GPX4蛋白水平显著降低，表明在骨质疏松条件下，GPX4缺乏和磷脂过氧化物积累之间的潜在联系。免疫组化进一步表明，OVX小鼠的成骨细胞中GPX4水平显著降低（图2e）。此外，GPX4与成骨细胞标志物ALP的共定位在OVX（图2f）和老年小鼠（图2i）的股骨中显著减少。综上所述，这些发现强调了GPX4在骨质疏松骨组织中的成骨细胞中的特异性下调。

图2:OVX和老龄小鼠成骨细胞中抑制的GPX4表达

3.雌激素缺乏导致成骨细胞GPX4转录失活

鉴于在雌激素缺乏的患者和小鼠中观察到GPX4的表达下调，我们进一步研究了雌激素介导的GPX4转录激活机制。首先，我们用雌激素（17β-雌二醇）处理MC3T3-E1细胞不同时间，分析Gpx4 mRNA的表达。正如预期的那样，雌激素治疗以时间依赖性方式上调Gpx4基因的表达（图3a）。相应的，GPX4的蛋白表达也在雌激素暴露后MC3T3-E1细胞中增加（图3b）。为了证实雌激素在GPX4调节中的作用，我们使用了氟维司群，一种广泛使用的雌激素受体拮抗剂。如图3c所示，雌激素显著上调GPX4的表达，而氟维司群有效抑制了这一作用。雌激素主要通过雌激素受体（er）、ERα或ERβ发挥生物学效应，ERα或ERβ形成二聚体、转位到细胞核，并与雌激素反应元件（EREs）结合，从而调节靶基因转录。以Esr1 siRNA（编码ERα）或Esr2 siRNA（编码ERβ）处理MC3T3-E1细胞24小时，然后再用雌激素处理12小时，以确定负责GPX4调控的特定ER亚型。结果表明，敲低ERβ，而不是ERα，消除了雌激素诱导的GPX4表达（图3d-g）。值得注意的是，当使用蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理时，雌激素不能改变GPX4的蛋白表达（图3h）。这些发现共同支持雌激素通过ERβ调节GPX4转录的假设。

为了进一步研究ERβ对GPX4的转录调控，我们进行了双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀（ChIP）实验。GPX4的启动子区（约2 kb）被克隆到荧光素酶报告载体（pGL4.1 basic）中，以评估ERβ对GPX4转录的直接影响（图3l）。ERβ的过表达以剂量依赖的方式显著增强GPX4的转录（图3i， j）。利用JASPAR数据库和ERE共有序列（AGGTCA/TC/CCT）对GPX4启动子进行的生物信息学分析（图3k），预测了GPX4启动子内假定存在的ERE区域（图3l）。电泳迁移率变化实验进一步验证了这种相互作用，表明ERβ蛋白与GPX4启动子的E-box元件直接结合（图3m）。此外，ChIP分析，遵循制造商的方案（图3n），显示ERβ在GPX4启动子的E-box显著富集（图3o）。为了证实ERβ对GPX4启动子的转录激活作用，我们在GPX4 E-box上产生了一个特定突变的突变荧光素酶-GPX4报告基因（图3l）。这一突变消除了ERβ的转录激活活性（图3p）。综上所述，这些发现表明雌激素通过直接结合GPX4启动子区的E-box元件来激活GPX4转录（图3q）。

图3：成骨细胞中GPX4转录受雌激素/ERβ调控

4.成骨细胞特异性敲除或抑制GPX4可破坏骨形成

为了阐明GPX4在成骨细胞生成和骨质疏松中的作用，我们构建了成骨细胞特异性GPX4敲除小鼠（Gpx4OBs−/−），并研究它们对成骨细胞介导的骨形成的影响。Micro-CT分析显示，与Gpx4flox/flox同窝小鼠相比，两个月大的Gpx4OBs - / -小鼠的骨量显著减少（图4a）。骨量减少的特征是Gpx4OBs - / -小鼠股骨皮质骨的BV/TV、BMD和皮质骨厚度（Ct.Th）显著降低，同时Tb减少。骨小梁的Th和BV/TV（图4b）。与这些发现一致的是，使用苏木精-伊红染色（图4c）和von Kossa染色（图4d）进行的组织学分析显示，Gpx4OBs - / -小鼠的股骨中骨小梁减少，骨矿化受损。进一步分析表明，在gpx4ob−/−骨组织中，成骨细胞数量显著减少（图4e， f）和关键骨形成基因（包括Runx2， Osx, Alp, Atf4, Col1α， Opn和Ocn）的表达减少（图4g），表明骨形成受损。同样，在MC3T3-E1细胞中，GPX4敲低导致ALP活性降低和矿物质沉积减少（图4h），证实了体内的发现。

图4：成骨细胞特异性Gpx4敲除或敲低抑制成骨细胞的生成

Micro-CT分析表明，RSL3抑制GPX4可导致明显的骨损失,这表现在骨密度、高血压/电视和结核病明显减少(图5a, b )。这些观察进一步得到组织学分析的支持,包括H≈E染色和冯科斯沙染色,这证实了结构的恶化(图5c, d )。此外,甲苯胺蓝染色显示成骨细胞数目明显减少,如减少的OB.S/BS(图 5e )所示。RSL3对Gpx4的抑制也显著抑制了骨形成相关基因的表达( Runx2, Osx, Alp, Col1α, and Ocn ) and proteins (RUNX2, ALP, and OCN) (Fig.  5f, g ),表示造骨功能受损。与这些体内发现一致的是,RSL3治疗成骨细胞导致骨形成相关基因的表达减少(图 5h ),成骨细胞分化受损,矿化能力降低(图 5i )。这些结果共同强调了GPX4在维持骨形成方面的重要作用,并突出了它在成骨细胞功能和骨平衡中的作用。

图5:RSL3使GPX4失活，抑制成骨分化，破坏骨形成

5.磷脂过氧化介导的ILK 4-HNE修饰抑制RUNX2信号通路

为了阐明被4-HNE修饰的参与骨形成的特定蛋白，我们进行了基于lc - ms的蛋白质组学分析（图6a）。该方法鉴定了几个候选蛋白，包括MAP激酶活化蛋白激酶3 （MAPK3）、纤溶酶-3 （PLS3）和整合素连接蛋白激酶（ILK），所有这些蛋白都与骨形成或成骨细胞分化有关（图6b）。值得注意的是，与对照组相比，4- hne修饰的ILK在gpx4抑制组（RSL3处理）中显著升高（图6b）。免疫共沉淀（Co-IP）实验（图6c， d）和免疫荧光染色（图6e）证实了这一观察结果，结果显示在gpx4抑制的MC3T3-E1细胞中，4-HNE和ILK的共定位增强。我们的研究表明，GPX4抑制导致ILK蛋白的下调（图6f），而不影响其mRNA水平（图6g），表明4-HNE-ILK加合物的形成可能驱动ILK降解。正如预期的那样，在chx诱导的蛋白质合成抑制后12小时内，ILK降解迅速发生（图6h）。此外，蛋白酶体抑制剂MG132而不是自噬抑制剂3-MA有效地逆转了rsl3诱导的ILK降解（图6i）。此外，RSL3抑制GPX4可增加MC3T3-E1细胞中ILK泛素化水平（图6j）。

RUNX2是一个成熟的转录因子，对成骨细胞分化至关重要。我们的研究结果表明，ILK敲低显著降低了RUNX2的蛋白和mRNA的表达水平（图6k， 1），伴随的是下游成骨标志物，包括Osx， Alp和Col1α的mRNA表达降低（图6l）。这表明ILK正向调控RUNX2信号通路。此外，ILK敲低导致alp阳性染色细胞减少（图6m），进一步支持ILK缺陷损害runx2介导的成骨细胞分化。相反，ILK过表达恢复了由GPX4失活引起的骨形成基因表达下降（图6n， o）。总之，这些发现表明磷脂过氧化衍生的4-HNE修饰ILK，促进其泛素化依赖性降解。这种降解随后抑制RUNX2和OSX的表达，最终破坏骨形成（图6p）。

图6：磷脂过氧化引起的ILK 4-HNE修饰抑制了RUNX2信号通路

7.GPX4的天然变构激活剂可挽救骨生成并改善骨质疏松

认识到GPX4在骨质疏松症中的重要作用，我们的目的是鉴定天然产物中潜在的GPX4变构激活剂。如图7a所示，我们使用天然产物的化学库进行分子对接，目标是已报道的GPX4变构位点。计算对接预测6-姜酚通过其酚羟基与GPX4的Lys31和Phe100形成分子间氢键，并与Asp21、Val27和Phe103形成疏水作用（图7b）。同样，8-姜酚通过其羰基与GPX4的Lys31形成氢键，并与Asp101的羟基结合，与Asp23形成疏水作用（图7b）。值得注意的是，6-姜酚比8-姜酚与GPX4的结合更强，这可能是由于8-姜酚的碳链较长，这可能会阻碍其在GPX4的结合口袋中的最佳匹配。

为了进一步验证预测的6-姜酚和8-姜酚与GPX4的相互作用，我们进行了细胞热位移实验。结果表明，这两种化合物都能稳定GPX4蛋白，防止温度引起的变性（图7c）。微尺度热泳动试验进一步证实了这种相互作用（图7d）。值得注意的是，6-姜酚和8-姜酚在RSL3存在和缺失的情况下均显著增强了GPX4的活性（图7e），支持它们作为强效变构GPX4激活剂的作用。此外，6-姜酚和8-姜酚在体内和体外模型中均可增加GPX4的表达（图7i）。这种双重机制，包括GPX4活性和表达的增强，突出了这些化合物在恢复GPX4功能的治疗潜力。

随后，6-姜酚和8-姜酚（25 mg/kg）显著增加骨密度，骨小梁BV/TV和Tb。这些化合物还上调了关键成骨基因的表达，包括Runx2， Col1α和Ocn（图7h），以及相应的骨形成相关蛋白Runx2， OSX和ALP（图7i）。此外，6-和8-姜酚处理降低了去卵巢小鼠骨骼中的4-HNE水平（图7j）。综上所述，这些体内和体外的研究结果证实了6-和8-姜酚是GPX4的天然变构激活剂，并表明以GPX4为靶点的治疗策略在骨质疏松症的治疗中具有重要的潜力。

图7:GPX4的天然变构激活剂可挽救成骨并改善骨质疏松

结论

综上所述，本研究提供了强有力的证据表明GPX4缺乏会加剧骨丢失并破坏骨形成，最终导致骨质疏松的发病机制。此外，这些发现强调了磷脂过氧化在骨质疏松潜在机制中的关键作用。因此，以调节GPX4活性和预防磷脂过氧化为靶点的治疗策略对骨质疏松的治疗具有显著的潜力。

成骨细胞中的磷脂过氧化作用在绝经后骨质疏松症中起关键作用，这是由雌激素调节的GPX4表达减少引起的。脂质过氧化副产物4-HNE通过降解ILK干扰RUNX2信号通路。而天然的GPX4激活剂6-和8-姜酚则能促进成骨细胞的生成，并显示出显著的抗骨质疏松作用。

Zhang QY, Gong HB, Jiang MY, Jin F, Wang G, Yan CY, Luo X, Sun WY, Ouyang SH, Wu YP, Duan WJ, Liang L, Cao YF, Sun XX, Liu M, Jiao GL, Wang HJ, Hiroshi K, Wang X, He RR, Li YF. Regulation of enzymatic lipid peroxidation in osteoblasts protects against postmenopausal osteoporosis. Nat Commun. 2025 Jan 17;16(1):758. doi: 10.1038/s41467-025-55929-4.