家族性自主神经功能障碍（FD）是一种影响外周神经元发育和存活的罕见遗传病。在本文中，Saito-Diaz等利用患者来源的细胞模型筛选了潜在的治疗化合物。作者发现，在栀子等植物中发现的一种化合物京尼平，可以改善感觉神经元（SN）的发育，并在体外防止SN变性。作者认为京尼平的交联特性是其疗效所必需的。在FD小鼠模型中，京尼平改善了周围神经支配和神经元功能的缺陷。
2024年11月20日，美国乔治亚大学分子医学中心Nadja Zeltner团队在Sci Transl Med（IF 15.8）上发表题为“Genipin rescues developmental and degenerative defects in familial dysautonomia models and accelerates axon regeneration”的文章。高通量化学筛选鉴定京尼平是一种针对 FD 中 SN 缺陷的化合物。京尼平源自栀子，是中药栀子的活性成分，用于治疗神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病。Genipin能够挽救家族性自主神经失调模型中的发育缺陷和退行性病变，并促进损伤的神经元的轴突再生。京尼平交联了细胞外基质（ECM），增加了ECM的硬度，重组了肌动蛋白细胞骨架，并促进了yes相关蛋白依赖基因的转录。
摘要
周围神经系统（PNS）对于身体正常功能至关重要。世界上有很高比例的人口患有神经变性或周围神经损伤。尽管如此，对人类PNS发育和退化的认识仍有很大的差距。因此，目前尚无有效的治疗方法。家族性自主神经功能障碍（FD）是一种由ELP1基因纯合点突变引起的毁灭性疾病。FD特异性地影响PNS的发展并引起PNS的变性。我们之前使用患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）证明外周感觉神经元（SNs）再现了FD中观察到的发育和神经退行性缺陷。在本研究中，我们进行了一项化学筛选，以识别能够挽救FD中SN分化效率低下的化合物。我们发现，在患者来源的iPSCs和两个FD小鼠模型中，京尼平恢复了神经嵴和黑质的发育。此外，京尼平可预防FD患者来源的SNs的FD变性，提示其可用于改善神经变性。此外，京尼平交联了细胞外基质（ECM），增加了ECM的硬度，重组了肌动蛋白细胞骨架，并促进了yes相关蛋白依赖基因的转录。最后，在体外轴突切断术模型中，京尼平促进了健康感觉和交感神经元（PNS的一部分）以及前额叶皮质神经元（中枢神经系统的一部分）的轴突再生。我们的研究结果表明，京尼平有潜力治疗fd相关的神经发育和神经变性表型，并促进损伤后健康神经元的再生。这提示ECM可以作为治疗FD的靶点。
1.化学筛选挽救 FD 中的 SN 表型
我们首先重现了之前的发现，即来自 FD 患者的 hPSC 衍生的 SN 无法在体外有效生成。Chambers等人定义的分化方案(图1A）用于区分源自健康胚胎干细胞（H9/WA09 和 hPSC-ctr-H9）的 hPSC、健康对照 iPSC（iPSC-ctr-C1）以及来自 FD 患者的两个 iPSC 系（iPSC-FD-S2 和iPSC-FD-S3)，先前已表征。尽管未分化集落看起来相似，但与对照品系相比，FD 品系中的 SN 数量显著下降（图 1B）。基于这种表型，我们着手进行化学药物筛选，以鉴定允许 FD-iPSC 有效生成 SN 的化合物。我们首先将 SN 分化方案适应高通量筛选条件。我们测试了以下参数：(i) 96 孔板和 384 孔板格式；(ii) 将方案缩短至 10 天；(iii) 在第 2 天和第 5 天或第 2 天、第 5 天和第 8 天进行完全培养基更换；(iv)在第12天取消重新电镀步骤；(v) 用 KnockOut 血清替代品 (KSR) 和 N2 培养基的 1:1 混合物替换培养基梯度（图 1C）。简化导致 SN 数量总体下降，从常规方案中的约 60% 减少到 hPSC-ctr-H9 细胞中的约 30%。在这些条件下，96 孔格式和三种培养基变化在对照中产生了最稳健的 SN（图 1D）以及对照和 FD 之间的最大差异。我们利用这些条件仅使用阳性 (hPSC-ctr-H9) 和阴性 (iPSC-FD-S2) 对照进行试点筛选。在这些条件下，计算出的屏幕Z ' 因子为 0.14，这表示边际测定。然而，由于我们筛选的设计和读数，阳性和阴性对照是可以区分的。我们推断，在分化第 2 天开始的治疗将允许初始分化为外胚层，但会影响分化为 NC 和 SN 的命运。然后，我们从药理活性化合物库 (LOPAC) 中筛选了 640 种化合物（图 1E）。每种化合物均在二甲基亚砜 (DMSO) 中以 1 和 10 μM 浓度进行筛选。然后对所有孔进行 SN 标记脑特异性同源盒/POU 结构域蛋白 3A (BRN3A) 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色，如果倍数变化 (FC) 超过所有 DMSO 孔的平均值高于所有化合物加上三个 SD 的平均值（图 1F）。我们的筛选得到了三个结果：氟奋乃静二盐酸盐（Flu，10 μM，一种多巴胺受体拮抗剂）、AC-93253 碘化物（AC，1 μM，一种视黄酸受体激动剂）和京尼平（1 和 10 μM）。作为对照，我们使用健康的 hPSC-ctr-H9 和 iPSC-FD-S2，均溶于 DMSO 和单独的 DMSO。京尼平的z分数在 1 μM 时为 15，在 10 μM 时为 17。
图1 . FD SN 上的化学筛选
2. Hit 验证
接下来，我们进行了几项检测来验证这三种命中的化合物。我们在两个系中观察到相同的表型。因此，我们关注京尼平。我们滴定京尼平浓度（图2，A和b），发现京尼平以剂量依赖性方式增加了对照组（约7倍）和iPSC-FD-S2细胞（30倍以上）的SNs数量。为了进一步证实京尼平的作用，我们在我们新的化学定义的[胚胎第8天(E8)/E6] SN分化方案中进行了测试。我们发现，京尼平稳健地增加了iPSC-FD-S2细胞中NC簇的大小和SNs的数量（图2C），提示FD表型的挽救。而在20 μM时，NC团簇的大小有所减小；因此，京尼平的理想浓度较低(10 μM；图2C-e)与KSR的比较，可能是因为缺少缓冲。最后，我们测试了来自不同商业来源的京尼平（Sigma-Aldrich和Biomaterials），发现尽管两种化合物都有效，但Biomaterials的京尼平在10 μM时表现出更稳健的表型（图2f）。使用该来源的京尼平进行进一步实验。综上所述，我们的小分子筛选使京尼平在我们的FD模型中被确定为一种挽救性化合物。
图2 Hit药物京尼平的验证
3.京尼平对FD iPSCs中NC细胞和SNs神经发育的影响
我们试图确定京尼平在整个发育过程中的作用（图3a）。在人类胚胎发育中，NC细胞（由SOX10标记）产生sn特异性的NC细胞（由NGN1/2标记），随后是BRN3A+ sn，同时也表达ISL1， PRPH， TRKA， TRKB和TRKC。因此，我们首先评估了京尼平对NC形成的影响。我们发现暗NC脊增加（图3b），这与iPSC-FD-S2和iPSC-FD-S3细胞中的SOX10表达（mRNA和蛋白）相关（图3C-d）。然后，我们通过免疫荧光成像（图3e）和流式细胞术（图3f）证实，京尼平通过增加FD中SNs的数量进一步促进了SN的发育。此外，京尼平恢复了FD中各种SN基因（BRN3A、ISL1、PRPH、TRKA、TRKB和TRKC）的表达（图3G-H）。在目前的条件下，这种分化可能接近其最大效率，而京尼平仅略微改善了这种效率。最后，京尼平增加了通过多电极阵列（MEA）记录测量的iPSC-FD-S2和iPSC-FD-S3 SNs的电活动（图3I-j）。具体来说，京尼平增加了动作电位（棘波）的频率和数量，可能是由于SNs的数量增加。京尼平也增加了爆发的次数，但没有增加它们的持续时间（图3K-m），这表明京尼平没有改变神经元的放电特征。总之，我们的结果表明京尼平在NC和SN阶段挽救了FD神经发育缺陷。
图3 京尼平挽救了FD细胞模型中的NC和sn相关表型
4.京尼平可改善FD小鼠的感觉缺陷
接下来，我们评估了京尼平是否也可以在体内挽救FD神经发育缺陷。我们首先使用了复合杂合子Elp1Δ20/flox FD小鼠模型。这只小鼠密切代表了FD和严重疾病患者的表型。这只小鼠携带一个Elp1等位基因，该等位基因的外显子20被删除（Δ20），模拟了患者因Elp1突变而发生错误剪接时的情况。Elp1的第19和20内含子含有LoxP位点，导致重组后第20外显子丢失。这类似于导致外显子20缺失的FD患者内含子20 ELP1突变。总之，这一基因型导致患者中观察到的所有细胞类型均缺失Elp1，并产生了与FD患者非常相似的FD小鼠，该FD小鼠在胚胎时期不致命，但出生时较小，出生后需要严格护理才能存活。因为FD突变小鼠胚胎（Elp1Δ20/flox）在妊娠晚期有严重缺陷，我们评估了京尼平是否有可能挽救它们的发育缺陷。孕鼠从妊娠中期开始给予京尼平补充饲料。在E18.5，收集胚胎并进行分析（图4a）。京尼平耐受性良好，未观察到雌性妊娠期体重增加、产仔数或胚胎发育发生变化。
在E18.5，京尼平处理的FD胚胎与未处理的FD胚胎相比，在重量和大小上没有差异（分别为779.33±94.00 mg和783.6±137.62 mg），但仍然小于对照胚胎。另一方面，妊娠期间的京尼平治疗挽救了FD DRG体积和神经元细胞数量（图4，B-d）。由于感觉伤害性神经元在妊娠晚期FD中尤其缺乏，因此我们通过降钙素基因相关蛋白（CGRP，伤害性感受器的特异性标志物）的免疫组化方法评估了伤害性神经元的缺乏。在FD胚胎中，cgrp阳性神经元减少到总腰椎L1 DRG神经元的20%，而在京尼平处理的FD胚胎中，cgrp阳性神经元数量增加到总神经元的40%左右（图4E-f）。我们发现，京尼平治疗还挽救了FD小鼠胚胎的感觉皮肤神经支配（图4g），而这一神经支配在FD患者和FD小鼠模型中严重受损。京尼平还通过增加星状神经节的大小来评估交感神经元的神经发育表型。
为了证实我们的结果，我们测试了另外一个FD小鼠模型（Sox10-Cre;Elp1LoxP/LoxP）。这是一个条件敲除小鼠模型，Elp1外显子4两侧有LoxP位点。当与细胞类型特异性Cre重组小鼠（Sox10 -Cre）杂交时，这只小鼠在NC细胞中特异性缺乏Elp1表达(Sox10是早期NC标记；图4图像查看器中的hopens)。这只小鼠表现出类似fd的发育表型，但在胚胎晚期或出生后不久，它大多是致命的。在我们的研究中，Sox10-Cre；Elp1LoxP/LoxP小鼠也表现出DRG大小减小和cgrp阳性神经元数量减少，而京尼平治疗增加了这些神经元数量。接下来，我们询问神经元数量的变化是否影响电活动。我们解剖了E18.5胚胎的腰椎DRGs，并将其植入MEA中。我们发现，与健康对照相比，FD胚胎的DRG神经元放电率较低，京尼平可以挽救这一情况（图4I-j）。接下来，我们测试了京尼平是否影响新生FD幼鼠的感觉知觉。与对照动物相比，FD幼鼠对连续10次触摸没有反应（图4K-L）。相比之下，在接受京尼平治疗的FD幼鼠中，约有一半的病例对机械刺激有反应（图4l）。综上所述，这些结果表明京尼平在体内具有良好的耐受性和拯救FD感觉表型。
图4 京尼平可在体内挽救FD的外周缺陷
5.京尼平对FD患者SNs神经变性的影响
由于 FD 既是一种神经发育障碍，也是一种神经退行性疾病，而且患者出生时 SN 数量减少，因此患者护理必须开发一种能够阻止或减缓 SN 变性的药物。因此，我们着手评估京尼平阻止 SN 变性的能力。在涂有 PO 和 FN 的培养皿上用 NGF (1 ng/ml) 进行存活测定。直到第 12 天，SN 才与没有京尼平的 hPSC 系区分开来，此时将它们重新铺板并开始用京尼平处理（图 5A）。我们发现健康对照 SN 在体外存活到第 34 天及以后，并且它们表现出经典的聚类/神经节样结构（图 5B）。然而，iPSC-FD-S2 和 iPSC-FD-S3 SN 从第 13 天开始死亡（图 5，B 和 C），京尼平可以预防这种情况（图 5，B 和 C）。这在基于 KSR 的协议中得到了证实（图 1A）。此外，京尼平增加了神经突长度（图 5，D 和 E），与健康的 SN 类似。因此，京尼平支持 FD 中 SN 的存活。
GO分析显示，参与信号通路激活、细胞迁移、细胞间粘附和炎症反应的基因在FD中上调（图6A）。相反，涉及 ECM 组织、胶原组织和细胞粘附的基因在 FD SN 中下调（图 6B）。此外，差异表达分析表明，ECM相关基因COL2A1、COL5A2、POSTN、BCAN、CSPG4、EMILIN1和GPC6等在FD中下调（图6C）。与对照 SN 中仅SHH、NOTCH1和FGF1相比，FD SN 中的多种形态发生素（ WNT4、WNT5A、WNT6、WNT10B、TGFB1、TGFB3、BMP6和BMP7 ）上调。这些结果与我们使用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 对 hPSC-ctr-H9 和 iPSC-FD-S3 SN 沉积的 ECM 进行的分析一致。来自对照 SN 的 ECM 主要由糖蛋白组成（EMILIN1、EMILIN3、GPC2、GPC6、HMCN1 和 BGN）（图 6D ）。相比之下，iPSC-FD-S3 SN 的 ECM 由胶原蛋白 [I 型胶原蛋白 α1 (COL1A1)、COL1A2、COL4A1、COL4A2 和 COL12A1]、糖蛋白（EMILIN2、原纤维蛋白 2 和纤连蛋白 1）、形态发生素（ WNT5A、WNT6、转化生长因子-β1、和骨形态发生蛋白 1）和蛋白酶（丝氨酸蛋白酶抑制剂家族 E 成员 1/2、具有血小板反应蛋白 1 型基序的 ADAM 金属肽酶 18、丝氨酸蛋白酶 23 和 HtrA 丝氨酸肽酶 1）（图 6D）。然而，京尼平上调了参与细胞粘附（ITGA6和PCDH9）、细胞迁移和极化（CDC42和SCRIB）以及细胞膜信号传导（PDGFRB、DLG2和LRP1）的基因（图6E）。京尼平下调参与线粒体呼吸链（NDUFA1、NDUFA4、NDUFB4、NDUFS3等）、细胞质中蛋白质翻译（RPL24、RPL32和RPL34）和线粒体（MRPL27、MRPL36和MRPL41）的基因（图6E和F）。此外，京尼平引起神经退行性疾病相关通路的下调，例如帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病（图6G）。这与京尼平报道的应用 (i) UCP2 抑制剂和 (ii) 预防神经退行性疾病一致。
图6 健康和 FD SN 表达不同的 ECM 成分
7.京尼平通过 FD 中 ECM 蛋白的交联发挥作用
京尼平形成分子间和分子内交联（图 7A），由于京尼平-甲胺单体的形成，导致细胞被染成蓝色（图7B ）。因此，我们推断，如果 ECM 交联可以挽救 FD，那么其他交联剂应该具有与京尼平相同的效果。然而，目前尚不清楚细胞外或细胞内蛋白质或两者的交联是否可以挽救 FD 表型。因此，我们使用双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS3），一种膜不可渗透的交联剂，仅交联 ECM 中的蛋白质（图 7C在图像查看器中打开）。我们发现BS3挽救了iPSC-FD-SN2中的NC和SN表型（图7D）以剂量依赖性方式。总之，我们的数据表明，细胞外蛋白的交联对于挽救 FD 的发育表型是必要且充分的。此外，它支持京尼平通过 ECM 蛋白交联在 FD 中发挥作用的模型。为了证实这一假设，我们使用了 1,10-脱水京尼平 (AG；图 7E），京尼平的一种形式，不具有交联活性，但保留其其他作用，例如 UCP2 抑制。确认AG不具有交联活性，AG没有将细胞染成蓝色（图7F）。此外，与京尼平相反，AG 既不能挽救 FD 细胞中的 NC，也不能挽救 SN 表型（图 7，G 和 H）。总之，我们的结果表明京尼平的交联作用是 FD 表型拯救的原因。
图7 .京尼平通过 ECM 蛋白交联拯救 FD 表型并激活转录共激活因子 YAP
8.京尼平增加 FD SN 的 ECM 的刚度
原子力显微镜 (AFM) 可用于研究活细胞或固定细胞的形态和机械特性在不同条件下受到的影响，包括 ECM 的变化。在 AFM 中，尖端扫描细胞表面，并使用光电探测器检测瞄准固定尖端的悬臂的激光束。测量尖端位置的垂直变化（由于表面的不同高度），从而产生高分辨率的地形图像（图7I）。使用这种方法，我们测量了京尼平如何影响 hPSC-ctr-H9 和 iPSC-FD-S3 SN 及其沉积的 ECM 的生物物理特性（图 7J）。此外，由于形成交联束，京尼平的样品高度也增加。从这些获取的细胞图像中，我们选择了表面上的不同点（图 7I）并测量了它们的力谱。我们发现健康的 SN 与 FD SN 相比具有更高的杨氏模量，并且京尼平增加了两种细胞系的杨氏模量（图 7K）。为了确认我们的结果，我们移除了 SN 并仅测量了剩余的 ECM（图 7J）。我们发现健康 SN 沉积的 ECM 的杨氏模量高于 FD SN。这些差异和变化只能归因于健康样本和 FD 样本中 ECM 的不同组成以及京尼平与 ECM 的直接交联。
9.ECM 交联导致肌动蛋白重组和 YAP 依赖性基因转录
我们首先评估健康和 FD SN 之间的肌动蛋白表达模式是否不同。我们测量了来自细胞体和轴突的信号。我们发现健康SNs中的肌动蛋白信号在细胞体中最高，而FD SNs在轴突中表现出更强的肌动蛋白信号（图7L）。京尼平治疗部分恢复了 FD SN 中的肌动蛋白表达模式（图 7L）。ECM 硬度导致肌动蛋白细胞骨架组织发生变化，从而激活 Hippo 通路。在僵硬的 ECM 中，转录共激活因子 YAP（Hippo 途径的最下游效应子）从细胞质转移到细胞核以激活转录程序。我们试图使用免疫荧光评估 YAP 在 SN 中的定位。我们发现，在健康和 FD SN 中，YAP 都存在于细胞质中（图 7，M 和 N）。然而，经京尼平处理后，YAP 被转运至细胞核，如仅在细胞核边界内检测到 YAP 荧光信号所示（图 7，M 和 N）。这表明京尼平介导的交联导致的 ECM 硬度增加激活了 SN 中的 Hippo 通路。接下来我们评估了 YAP 核易位是否导致 YAP 依赖性基因的转录。我们发现用京尼平处理的 FD SN 中YAP1和CYR61 的表达较高（图 7O）。Runt 相关转录因子 1 (RUNX1) 是伤害感受器（SN 的一种亚型）成熟所必需的转录因子。在癌症中，YAP 与 RUNX1 相互作用来调节转录；因此，我们询问京尼平是否也激活 FD SN 中的这些基因。京尼平增加了所有依赖于 YAP-RUNX1 相互作用的测试基因的表达（图 7O）。总之，我们的结果表明京尼平依赖性 ECM 交联会导致 FD SN 中肌动蛋白重组和 Hippo 通路激活。
8.京尼平增强周围和中枢神经系统神经元的轴突再生
接下来，我们询问京尼平是否可能有益于损伤后的轴突再生（一种更常见的三七总皂甙疾病）。我们之前已经证明，hPSC-ctr-H9 衍生的 SN 可以在后期重新铺板，在随时间重新生长的过程中酶促切割神经突。因此，我们首先评估是否可以使用这种方法作为轴切术模型。我们发现hPSC-ctr-H9 SN的重新铺板引起ATF3和SPRR1A的表达（图8A），两个参与再生的关键基因。在再生阶段添加京尼平进一步增加了这两个基因的表达，并且持续时间更长（图8A）。此外，经京尼平处理的 SN 在重新铺板后 18 小时和 6 天显示出更长的轴突（图 8、B 和 C），表明京尼平提高了轴突再生的速度。为了扩大京尼平在三七总皂甙中的应用，我们测试了外周交感神经元再生。为此，我们使用了微流体装置，该装置将细胞体和轴突维持在两个不同的隔室中，使我们能够在不干扰细胞体的情况下破坏轴突（图8D）。我们发现京尼平增加了损伤后 2 天 hPSC-ctr-H9 衍生的交感神经元再生轴突的数量和长度，这是通过免疫荧光法外周蛋白 (PRPH) 染色的增加来测量的（图 8，E 和 F）。这些结果表明京尼平增加了外周交感神经元的再生速度。最后，我们使用hPSC-ctr-H9细胞分化的前额皮质（PFC）神经元来测试京尼平是否增强CNS神经元的再生。使用我们的重镀方法（图8G），我们发现经京尼平处理的 PFC 神经元比对照神经元再生轴突的速度更快，这是通过微管蛋白 β3 III 类（TUJ1）阳性像素数量的增加来衡量的（图 8，H 和 I）。总之，我们的结果表明京尼平可用于促进三七总皂甙和中枢神经系统的神经元再生，扩大其潜在应用。
图8 .京尼平可加速外周和中枢神经元损伤后的轴突再生
结论
京尼平可以挽救基于 hPSC 的 FD 疾病模型中的神经发育和神经退行性表型。我们进一步表明，京尼平可在体内挽救 DRG 发育和电生理表型。此外，我们还发现了健康和 FD SN 的 ECM 组成差异，并证明京尼平通过交联 ECM 蛋白、引起细胞骨架重排并增加 YAP 依赖性基因的转录来拯救 FD 表型。最后，我们发现京尼平可促进损伤后三七总皂甙和中枢神经系统神经元的再生。因此，京尼平具有治疗 FD 和神经元损伤的应用潜力。
Saito-Diaz K, Dietrich P, Saini T, Rashid MM, Wu HF, Ishan M, Sun X, Bedillion S, Patel AJ, Prudden AR, Wzientek CG, Knight TN, Chen YW, Boons GJ, Chen S, Studer L, Tiemeyer M, Xu B, Dragatsis I, Liu HX, Zeltner N. Genipin rescues developmental and degenerative defects in familial dysautonomia models and accelerates axon regeneration. Sci Transl Med. 2024 Nov 20;16(774):eadq2418. doi: 10.1126/scitranslmed.adq2418.
