流式在整形外科的新应用 | 外周血sHLA-E可作为瘢痕疙瘩诊断和复发监测的单一生物标志物

瘢痕疙瘩是一种真皮纤维增生性疾病，可持续生长多年，并很少自发消退。不仅影响患者的外观，还可能带来严重的身体和心理负担。瘢痕疙瘩的形成和发病机制尚未完全明确，因此，准确预测、可靠预防和有效治疗瘢痕疙瘩仍具有挑战。现有研究揭示了部分潜在发病机制包括基因多态性、成纤维细胞异常等，同时越来越多的证据表明免疫细胞失调在瘢痕疙瘩形成过程中发挥重要作用。例如，瘢痕疙瘩病变部位发现大量T细胞、B细胞和肥大细胞浸润；瘢痕疙瘩组织中发现高效巨噬细胞，可促进FoxP3⁺Treg细胞分化等。因此，瘢痕疙瘩病变的免疫微环境失调值得进一步深入研究。基于血液循环和原发性病灶的分子和细胞水平表征疾病特异性特征，将有助于开发用于风险评估的新型生物标志物和用于无复发治疗的治疗靶点。

上海交通大学附属第九人民医院整复外科章一新教授团队在Cellular & molecular immunology（IF=21.8）杂志上发表了题为“Downregulated cytotoxic CD8⁺ T-cell identifies with the NKG2A-soluble HLA-E axis as a predictive biomarker and potential therapeutic target in keloids”的研究，由许恒等人担任共同一作，深入探索了健康皮肤、正常疤痕和瘢痕疙瘩组织中的T细胞亚型，并通过单细胞RNA测序进一步分析了颗粒酶B⁺CD8⁺细胞毒性T细胞（CTLs）的谱系。其结果不仅揭示了参与瘢痕疙瘩发病和复发的新信号机制，同时通过病灶内治疗确定了一种新型外周血致病因子，或可作为有效评估瘢痕疙瘩形成风险的诊断标志物，以及作为病灶内治疗后临床结局的预后标志物。

图1 瘢痕疙瘩组织中浸润T细胞的特征

图2 瘢痕疙瘩患者外周血细胞毒性CD8⁺T细胞谱

图3 瘢痕疙瘩患者和健康受试者外周血scRNA-seq分析

将簇1-CTL细分为五个亚簇（亚簇0-4），并用t-SNE进行可视化（图4A）。t-SNE 图和条形图的分布模式显示，四个瘢痕疙瘩样本中亚簇0塌陷（图4B）。进一步分析12个功能相关的基因（GZMB、IFNG、TBX21、KLRG1、EOMES、PDCD1、LAG3、HAVCR2、SLAMF6、MKI67、BCL2 和 BCL2L11）发现，亚簇0高度富集GZMB、TBX21和KLRG1标记基因，表明CTLs数量减少（图4C）。

随后，研究分析了瘢痕疙瘩患者和健康受试者间前10个差异表达的基因（在健康受试者或瘢痕疙瘩患者中较高，共20个基因；图4D）。结果显示，相较于健康受试者，瘢痕疙瘩患者的外周血中CD3⁺CD8⁺HOPX⁺T（HOPX基因编码HOPX）和CD3⁺CD8⁺T-bet⁺CD94⁺NKG2A⁺T（KLRD1和KLRC1分别编码CD94和NKG2A）的细胞数量显著增加（图4E）。DAPI、CD8、颗粒酶 B 和 NKG2A 的mIHC染色显示，瘢痕疙瘩组织中的CD8⁺颗粒酶B⁺细胞数量减少、CD8⁺NKG2A⁺细胞数量增多。根据病程对瘢痕瘢痕样本进行重新分组，以2年为临界值。观察到NKG2A/CD94复合物的表达随疾病进展而增加，回归分析发现两者存在弱相关性（R²＜0.4）。这些结果表明，CTLs下调可能归因于瘢痕疙瘩患者特定亚型T细胞中的HOPX尤其是NKG2A/CD94的表达上调。

图4 基于scRNA-seq数据的簇1-CTL亚型分析

为进一步探索NKG2A/CD94复合物的调控机制，研究人员评估了瘢痕疙瘩患者治疗（曲安奈德联合5-氟尿嘧啶）前后的CTLs情况（图5A）。温哥华瘢痕评定量表（VSS）评分显示治疗效果显著（图5B）。由于曲安奈德的抑制作用，治疗后CD3⁺CD8⁺T细胞的数量显著减少（图5C）。同时，治疗后CTLs的比例恢复到正常水平，且CD3⁺CD8⁺T-bet⁺T细胞和Ki67⁺CTLs细胞均恢复到正常水平（图5D-F）。治疗后CTLs水平上调，表明CTLs在瘢痕疙瘩发病机制中具有重要作用。但HOPX尤其NKG2A/CD94的表达水平在治疗后无变化（图5G-H），因此，无法明确CTLs的调控机制。

鉴于NKG2A/CD94复合物通常在NK细胞表面表达，研究进一步分析了CD3⁻CD56⁺CD94⁺NK细胞。结果发现，瘢痕疙瘩患者的CD3⁻CD56⁺CD94⁺NK细胞数量增加，且无法通过病灶内注射治疗逆转。此外，未接受治疗的患者与接受治疗的患者NK细胞中的NKG2A/CD94复合物表达水平无显著性差异。因此，依然无法明确NKG2A/CD94在CTLs减少和恢复中的作用。

图5 瘢痕疙瘩患者治疗前后的细胞毒性CD8⁺T细胞水平变化

NKG2A/CD94复合物可与人类白细胞抗原e（HLA-E）进行特异性结合，因此研究人员对健康皮肤、正常疤痕和瘢痕疙瘩组织样本进行蛋白石mIHC染色，以评估瘢痕疙瘩患者体内HLA-E的表达情况。与之前的结果一致，相较于健康皮肤和正常疤痕组织，瘢痕疙瘩组织中的CD3⁺T细胞数量减少、CD3⁻CD56⁺NK细胞数量增加以及CD3⁻CD56⁺NK细胞/CD3⁺T细胞的比例显著升高（图6A-D）。需要注意的是，HLA-E主要在健康皮肤和疤痕组织的波形蛋白⁺成纤维细胞上表达，而富含成纤维细胞的瘢痕疙瘩组织中没有观察到HLA-E信号（图6A-C）；但是蛋白质免疫印迹显示瘢痕疙瘩组织中较高的HLA-E表达（图6E-F）。相反，免疫荧光染色和蛋白质印迹观察到人类白细胞抗原-G（HLA-G）在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达显著上调。由于HLA-E和HLA-G会以可溶性HLA-E（sHLA-E）和可溶性HLA-G（sHLA-G）存在于体液中，因此进一步分析了血清样本中sHLA-E和sHLA-G的含量。结果发现，瘢痕疙瘩患者外周血sHLA-E水平显著升高（图6H，P＜0.0001），但sHLA-G无显著性变化。

研究还分析了基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，发现瘢痕疙瘩组织中MMP1、MMP3、MMP8、MMP9（图6E,G）和MMP1,3上调，而MMP2、MMP7无变化。MMP9是人类皮肤成纤维细胞中HLA-E溶解的介质，由于MMP9的异位表达，使得HLA-E表达略有升高。这些结果表明，sHLA-E是局部瘢痕疙瘩成纤维细胞分泌的主要形式，然后释放到循环系统中。经过三次病灶内注射治疗后，sHLA-E的水平较治疗前显著降低（图6I），但仍高于健康受试者。

图6 HLA-E的异常表达与瘢痕疙瘩的关系

为进一步验证sHLA-E的性能，研究人员将人群扩大至104 例未接受治疗的瘢痕疙瘩患者、512 例健康受试者和100例干扰性疾病患者。通过血液样本分析发现，瘢痕疙瘩患者血清sHLA-E水平显著高于健康受试者和干扰性疾病患者（6.34 ± 2.58 ng/mL vs. 1.26 ± 1.00 ng/mL vs. 2.05 ± 2.41 ng/mL）（图7&图8）。将sHLA-E的临界值设定为3 ng/mL时，区分瘢痕疙瘩患者与非瘢痕疙瘩患者（健康受试者和干扰患者）的敏感性和特异性分别为83.69%、92.16%，区分瘢痕疙瘩患者与健康受试者、瘢痕疙瘩患者与干扰患者的特异性分别为94.73% 、79.00%（图7）。

对61例在12个月内接受过＞3次治疗（曲安奈德联合5-氟尿嘧啶）的瘢痕疙瘩患者进行随访，发现在暂停治疗后，13例（21.31%）患者6个月内出现瘢痕疙瘩复发，复发患者末次治疗后的血清sHLA-E水平显著高于其他6个月内未复发的患者（4.06 ± 1.70 ng/mL vs. 1.73 ± 1.07 ng/mL，P＜0.0002）（图7）。同时瘢痕疙瘩复发更倾向于女性患者（P=0.02），表明性别差异与治疗反应有关。此外，sHLA-E能够区分瘢痕疙瘩与增生性疤痕、恶性隆突性皮肤纤维肉瘤、基底细胞癌以及其他多种干扰性疾病（图8）。这些结果表明，在瘢痕疙瘩患者的外周血和瘢痕疙瘩病灶中，sHLA-E水平均与CTLs数量呈负相关。随着致病过程或缓解期的进展，sHLA-E水平与CTL的下调或恢复发生同步变化。

图7 健康受试者、干扰患者及瘢痕疙瘩患者的sHLA-E水平

图8 干扰病例的sHLA-E水平

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