作者：
陈曼1 同格乐2
作者单位：
1北京陆道培医院病理及医学检验科，北京 100176；2北京陆道培医院移植科，北京 100176
通信作者：
陈曼，Email：m15110162210@163.com
病史摘要 患者，女性，64岁。2021年12月于外院经骨髓MICM诊断为"再生障碍性贫血"，予以海曲泊帕、十一酸酮酸睾酮、环孢素口服治疗，血象无明显恢复。2022年1月10日行供者为其儿子（HLA 5/10，B+供O）半相同造血干细胞移植，预处理方案BU/FLU/CY/ATG（即）。+17 d白细胞、血小板均植活。+19 d外周血CD3、CD56嵌合率均为100%供者型；+23 d骨髓形态增生活跃，嵌合率为100%供者型。+42 d出现尿频、尿急等膀胱炎症状，尿液BKV阳性，予以利尿、水化碱化等治疗后上述不适好转。+45 d出现血浆巨细胞病毒阳性，给予抗病毒及输注丙球提高免疫力治疗。随后三系血象下降，以血小板下降为主。
症状体征 入院全身皮肤未见出血点及瘀斑等。咽部无红肿，双侧扁桃体无肿大，口腔内未见溃疡。双肺呼吸音清，未闻及干湿性啰音。心率86次/min，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。肝脾肋下未触及。肠鸣音不亢进，双下肢无水肿。
诊断方法 淋巴细胞亚群检测提示病毒感染B/T/NK增殖，移植后淋巴增生性疾病检测提示浆细胞增殖不平衡，流式分选后进行病毒检测，明确病毒感染及异常增殖细胞类型，诊断为EB病毒病。但在其他检测未能明确感染，如持续监测感染指标无明显增高，且未筛查到明确致病菌。
治疗方法 逐渐减量激素，免疫监控方案，移植后淋巴增生性疾病检测方案。
临床转归 患者经上述治疗后血象逐渐恢复，无移植物抗宿主病及感染表现，无病生存中。
适合阅读人群 移植科；检验科
移植后淋巴增生性疾病（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）是造血干细胞移植和实体器官移植的常见并发症，大部分的发生和移植后机体本身潜在的EB病毒激活，而造成的持续性感染以及为预防异体移植排异反应而发生的治疗性免疫抑制有关，免疫抑制导致T细胞功能下降，且失去对B细胞增殖的控制能力，于是EB病毒转化的B细胞，有助于PTLD的发展[ 1,2,3 ]。移植后T细胞的功能及活性受抑制无法控制EB病毒感染的B细胞的增殖。本例疾病造血干细胞移植后早期出现低热伴三系血象下降，临床未明确感染致病菌，无明显移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）表现。通过监测移植后淋巴细胞亚群的增殖情况怀疑患者存在异常增殖，虽然血浆EB病毒持续阴性，但用PTLD筛查倾向可见B细胞早期的异常增殖，使用流式分选技术确诊感染并明确感染的细胞亚群。通过免疫细胞亚群提示患者移植后感染状态及B、浆细胞异常增殖倾向，通过对B及浆细胞的克隆性监测，使用分选流式，明确感染细胞群体及感染依据，对异常增殖倾向的患者早期治疗处理，防止PTLD的发生与进展。
临 床 资 料
一般资料
患者：
女性，64岁，因“尿频尿急1 d”于2022年2月22日就诊我科。患者症状持续2 d，于外院就医水化碱化后未得到缓解，遂就医本院，心肺腹未见明显异常。
既往史：
无特殊。
个人史：
无特殊。
家族史：
无特殊。
体格检查
全身皮肤未见出血点及瘀斑等。咽部无红肿，双侧扁桃体无肿大，口腔内未见溃疡。双肺呼吸音清，未闻及干湿性啰音。心率86次/min，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。肝脾肋下未触及。肠鸣音不亢进，双下肢无水肿。
检查
血常规：提示三系进行性减低，尤其PLT进行性减低显著见表1 。血浆巨细胞和EB病毒定量检测见表2 。
表1 患者血常规检测
表2患者血浆巨细胞和EB病毒定量
血清微小病毒B19：2022年2月18日、2022年2月28日、2022年3月14日、2022年3月21日、2022年3月28日检测结果均为0。尿液BK病毒：2022年2月21日5.5×109，2022年3月1日7.4×1010，2022年3月24日2.9×109。免疫细胞亚群监测结果见表3 。细胞因子检测结果见表4 。
表3患者免疫细胞亚群检测结果
表4患者细胞因子检测结果
在移植后2个月时，在无感染的情况下，正常B细胞数量极少。而在本例患者移植后2个月时间点（3月11日时间点）达到57/μl，尤其伴随，NK及CD8阳性T细胞的显著增多。CD8阳性T细胞的绝对计数3516/μl，NK细胞绝对计数达到1246/μl，结合细胞因子水平检测，淋巴细胞增殖以NK及CD8+T细胞为主，并且TEM比例极高，但是与CD8+T细胞及NK细胞杀伤功能相关IFN-gamma、颗粒酶B并不高，说明增高的NK及T细胞功能不良，无法达到有效杀伤病毒的功能。在淋巴细胞亚群的结果中，3月11日时间点，Treg细胞10/μl，B细胞57/μl，NK细胞及CD8+T细胞同时增高，提示了病毒感染的可能性大。
2022年3月11日为移植后第60天，送检骨髓微小残留病变的同时送检了骨髓的EB病毒检测，EB病毒拷贝数为8.8×102。EB病毒阳性，但拷贝数低。2022年3月28日免疫细胞亚群中B细胞、NK细胞以及CD8+T细胞持续性显著增多，CD4细胞功能显著受抑制，建议采用流式细胞仪分选免疫细胞送检病毒，并行PTLD检查。结果提示患者为抑制相关的移植后增殖不平衡，为避免PTLD及早对症治疗。患者3月21日时间点B细胞kappa/lambda比值增高，浆细胞中可疑存在单克隆细胞；3月28日可见B细胞kappa/lambda比值进一步升高，浆细胞比例极低，可疑出现单克隆细胞；4月11日经抗病毒治疗后，患者未见明显浆细胞，且B细胞的kappa、lambda比值倾向恢复；5月17日的结果提示治疗方向正确，B细胞及浆细胞的异常增殖情况得到控制（图1）。
图1 患者治疗前后B细胞及浆细胞的变化情况
流式细胞分选结果：使用流式细胞技术标记B细胞、浆细胞、NK细胞及T细胞对患者外周血进行分选，明确EB病毒感染的相关细胞群，如下检查所示依次为B细胞、NK细胞、PC细胞、T细胞四群（图2）。可见B细胞内感染EB病毒，拷贝数在5.1×106，完全超出临床治疗限。其余细胞群无EB病毒，分选的意义在于明确EB病毒的胞内感染以及感染的细胞类型，从而决定治疗方式，感染使用抗病毒药物，明确B细胞单克隆可使用美罗华等治疗。
图2 患者分选方案及细胞群展示
诊断与鉴别诊断
诊断：移植后淋巴细胞增殖性疾病。
鉴别诊断：不明原因血象进行性下降，以血小板明显，需要与移植物抗宿主病、血栓性微血管病、肝窦隙阻塞综合征鉴别诊断。（1）移植物抗宿主病。患者无发热皮疹、无腹痛腹泻、无恶心呕吐、无肝肾功能损害等GVHD临床表现。（2）血栓性微血管病。患者无高血压、水肿、蛋白尿，外周血无破碎红细胞，无LDH进行性增高或结合珠蛋白进行性下降，无C5b9增高等TMA临床表现。（3）肝窦隙阻塞综合征。患者无黄疸、肝大腹水，无门静脉增宽或血流速度减慢等SOS临床表现。（4）在淋巴细胞亚群的结果中，3月11日时间点为移植后2个月，此时Treg细胞10/μl，B细胞57/μl，NK细胞及CD8+T细胞同时增高，CD8阳性T细胞的绝对计数3516/μl，NK细胞绝对计数达到1246/μl，提示了病毒感染的可能性大，而非GVHD的免疫状态。与极高细胞数CD8+T细胞及NK细胞不相符的是，细胞因子中与其杀伤功能相关的IFN-gamma、颗粒酶B并不高，说明增高的NK及T细胞功能不良，无法达到有效杀伤病毒的功能。
治疗
包括干预类型（如药物、外科治疗、预防、自我护理）、干预方案（如剂量、强度、持续时间）。最终诊断为EB病毒病，遂逐渐减量激素，他克莫司浓度从5~10 ng/ml降至2~5 ng/ml，联合阿昔洛韦10 mg/kg、每8小时1次，丙球0.4 g/kg、1次/d。患者经上述治疗后血象逐渐恢复。
1．免疫监控方案：
（1）6c-TBNK绝对计数。
（2）CD45RA-FITC/CD127-PE/CD4-PerCP/CD197-PECy7/CD25-APC/CD8-APC CY7/CD38-APC R700/CD279-BV421/CD3-BV510。
2．PTLD检测方案：
（1）ckappa-FITC/clambda-PE/CD38-PerCP/CD19-PE Cy7/CD10-APC/CD20-APC Cy7/CD56-BV421/CD45-V500。
（2）kappa-FITC/lambda-PE/CD19-PECy7/CD5-APC/CD20-APC Cy7/CD45-V500。
3．分选方案：
CD7-FITC/CD22-PE/CD3-PerCP/CD19-PECy7/CD138-APC/CD20、APC、CY7/CD38-BV421/CD45-V500c。
治疗结果、随访及转归
随访至2022年8月23日患者造血干细胞移植后7个月余，血常规及肝肾功能均未见异常，无GVHD及感染表现，无病生存中。
讨
论
PTLD包括在实体器官移植（solid organ transplantation，SOT）和异基因造血细胞移植（异体HCT）后发生的良性增生到恶性淋巴瘤的进展疾病。PTLD是儿童最常见的SOT后恶性肿瘤。在成人中，PTLD是SOT后第二大最常见的恶性肿瘤，仅次于非黑色素瘤皮肤癌[4]。
大多数PTLD（55%~65%）与EB病毒感染相关[5,6]。在免疫能力强的宿主中，EB病毒基因组在潜伏感染的B细胞中形成一个小片段。免疫抑制导致T细胞增殖及功能下降，且缺失对B细胞异常增殖控制，从而导致EB病毒转化的B细胞不受控制地增殖，有助于PTLD的发展[7]。细胞因子基因的多态性，包括白细胞介素10、白细胞介素-6和（IFN-α），可能影响PTLD的易感性[8]。
免疫抑制剂的使用，如抗胸腺细胞球蛋白、抗CD3、钙调神经磷酸酶抑制剂、他克莫司和环孢霉素等个体用药已被认为是PTLD潜在危险因素[9,10]。大约30%~45%的PTLD病例外周血检测为EB病毒（−），故诊断更晚，常发生在SOT的中位时间为62个月，而EB病毒（+）病例的中位时间为11.5个月[11,12]。而PTLD早期病变仅表现为感染性单核细胞增多症和浆细胞增生特征的病变，并没有组织结构的破坏。故早期诊断是PTLD预后的重要因素[13,14]。
患者近3周血象进行性下降，除外周血巨细胞病毒阳性，未筛查到明确致病菌。回顾性分析2022年2月9日首次检测淋巴细胞亚群，可见淋巴细胞以NK细胞为主且比例异常，NK细胞占淋巴细胞达到90.11%，效应相关T细胞CD4+TEM和CD8+TEM比例显著增高，T淋巴细胞90%以上为效应T细胞，TCM比例极低，T细胞储备能力有限，提示感染的可能性。2022年3月11日（+60 d）复测淋巴细胞亚群，结果显示淋巴细胞显著增高，并且以免疫重建早期主要免疫作用细胞CD8+T细胞及NK细胞增殖为主，且可见在免疫重建的第2个月B细胞相对于正常增殖情况来讲，呈现显著增长趋势，显著提示感染的可能性大。B细胞约1~2年后恢复完成，IgM+B细胞在2~6个月开始恢复，是恢复最早的B细胞。故在移植后2个月时，在无感染的情况下，正常B细胞数量极少。依照诊断正确治疗，可以明显看到免疫重建的恢复，以及B、浆细胞正常增殖的恢复。
故免疫细胞监测的使用支持正确的诊断，为临床指导正确的治疗方向，使患者避免向PTLD发展，在改变患者预后上起到一定作用。
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