作者：
吴正宙
作者单位：
中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广州 510120
通信作者：
吴正宙，Email：wuzhzh28@mail.sysu.edu.cn
病史摘要 患儿，女性，1岁9个月，因"确诊急性髓系白血病4个月余，拟行造血干细胞移植术"收入院治疗。移植前评估原发病为完全缓解状态，无移植禁忌证，予地西他滨去甲基化治疗后桥接无关脐血移植，采用清髓性预处理方案"白舒非+环磷酰胺+氟达拉滨"，予静脉他克莫司（FK506）、吗替麦考酚酯预防移植物抗宿主病。+12 d中性粒细胞植入，+35 d血小板植入，+14 d查供者嵌合比例为100%。
症状体征 +22 d患儿头部、后颈部出现密集红色丘疹，瘙痒明显。+27 d患儿皮疹明显增多（皮疹面积>90%），双手掌、足底充血明显，呈网状红褐色斑丘疹，伴明显皮肤脱屑。
诊断方法 期间密切监测患儿移植后免疫状态，采外周血行流式细胞术检测：淋巴细胞亚群（CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞）、调节性T细胞Treg、T淋巴细胞活化状态（CD3+CD69+细胞、CD3+HLA-DR+细胞）等情况，结果提示CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD3+CD69+细胞、CD3+HLA-DR+细胞比例明显升高，Treg细胞比例下降。
治疗方法 续贯口服FK506抗排斥，并先后加用甲泼尼龙、肿瘤坏死因子单抗、甲氨蝶呤、芦可替尼治疗，皮疹仍消退不理想，予停FK506，改口服环孢素抗排斥，并加强外用药"丙酸氟替卡松软膏+他克莫司软膏"。
临床转归 患儿皮疹逐渐消退。移植后2个月停糖皮质激素，期间环孢素、芦可替尼逐渐减量，于移植后6个月完全停用免疫抑制剂。定期监测原发病完全缓解、植入比例100%，随访至移植后32个月，患儿无病存活。
适合阅读人群 造血干细胞移植专科；肿瘤科；感染科；风湿免疫科；检验科
急性移植物抗宿主病（acute graft versus-host disease，aGVHD）是造血干细移植后常见并发症之一[1,2]。其发生机制为抗原提呈细胞激活供者来源的同种异体反应性T细胞，导致后者大量扩增并攻击受者自身组织，引起组织细胞损伤与器官功能障碍[3]。aGVHD的发生率高达30%~60%，经典aGVHD发生在移植后100 d内，以斑丘疹、胃肠道症状或瘀胆型肝炎为临床表现[4]。GVHD的临床表现并没有特异性。本文报道1例以皮疹为主要表现的aGVHD在免疫监控指导下的精准诊疗，旨在为临床医生在移植患者的术后管理中提供相关经验。
临 床 资 料
一般资料
患儿，女性，1岁9个月，因"确诊急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）4个月余，拟行造血干细胞移植术"于2019年8月12日就诊我科。患儿因"咳嗽1个月余，发热20余日，发现白细胞升高1周余"于2019年4月1日第1次入住本院。完善MICM检查，确诊为"AML（M5，伴TET2、TP53突变，WT1高表达）"。分别于2019年4月11日、2019年5月27日、2019年6月27日开始予NOPHO-2004方案AIET、AM、HA1M化疗。AIET方案化疗15 d流式检测示幼稚细胞比例0.15%。骨髓涂片示骨髓明显抑制。其后监测骨髓形态、流式均提示白血病完全缓解，但仍可检测到TET2基因、TP53基因等突变位点，诊断高危AML。期间查脑脊液检查未见异常。化疗过程中曾出现PICC管处血栓形成、腮腺炎、重症肺炎等并发症，先后予两性霉素、伏立康唑、利奈唑胺、左氧氟沙星、达托霉素、头孢哌酮等治疗后好转。
患儿已在山东脐血库寻得HLA8/10相合无关（脐血）供者，现为行造血干细胞移植术，收治我科。父母非近亲结婚，父亲体健，母亲怀孕前查甲状腺5项示促甲状腺素升高，考虑"甲状腺功能减低"，口服优甲乐数月后，甲状腺功能正常后自行停药。其祖母有"宫颈癌"病史。患儿患有"先天性甲状腺功能减退症"，规律口服优甲乐治疗，定期监测甲状腺功能正常。手术史、冶游史无特殊。
体格检查：体温36.7℃，脉搏120次/min，呼吸22次/min，血压99/66 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），体重12.5 kg（+0.9 SD），身高82 cm（−0.7 SD），身高的体重+1.7 SD。发育正常，营养中等。神清，反应可。全身皮肤黏膜无苍白、黄染、皮疹及出血点。全身浅表淋巴结未扪及肿大。巩膜无黄染。口唇尚红润，口腔黏膜光滑。咽无充血，双侧扁桃体无肿大、异常分泌物。双肺呼吸音粗糙，未闻及干湿啰音。心音有力，律齐，各瓣膜听诊区未闻及杂音。肝脾肋下未及。肠鸣音正常。神经系统体格检查无异常。
检查
入院后完善相关检查（2019年8月13日），具体结果如下。
血细胞分析+CRP：WBC 1.66×109/L，Hb 106 g/L，PLT 219×109/L，NEUT 0.37×109/L，CRP<5.0 mg/L。尿检B、粪便分析、肝肾功能、心肌酶、凝血常规等未见异常。
甲功7项：T3 2.66 nmol/L，T4 84.9 nmol/L，FT3 7.3 pmol/L，FT4 11.40 pmol/L，TSH 6.06 mU/L，抗甲状腺过氧化酶抗体172 U/ml，抗甲状腺球蛋白抗体157 U/ml。结核感染T细胞斑点试验、肝炎系列、血巨细胞病毒DNA定量、EB病毒DNA定量（全血、血浆）等阴性。巨细胞病毒抗体2项：巨细胞病毒IgM抗体0.01 AU/ml，巨细胞病毒IgG抗体3.77 AU/ml。
炎症A：IL-2受体862.0 U/ml，IL-6 8.56 pg/ml，TNF-α 13.90 pg/ml，余未见异常。Coombs试验、血型抗体筛查、葡萄糖6磷酸脱氢酶活性等未见异常。血小板抗体检测：抗血小板膜蛋白抗体GpⅡb/Ⅲa 7.43阳性，GpⅠb/Ⅸ 4.44阳性，GpⅠa/Ⅱa 4.64阳性，HLA抗体阴性。8-14 DSA（HLA Ⅰ类和Ⅱ类抗体检测）均阴性。
腹部B超：肝脏、胆囊、胆管、脾、胰未见明显异常。泌尿系彩超：肾脏、输尿管、膀胱未见明显异常。心脏彩超：二尖瓣、三尖瓣及肺动脉瓣轻微反流，少量心包积液，左室收缩功能正常（EF 71%）。心电图：窦性心律不齐。鼻窦CT+胸部CT：双侧上颌窦、筛窦、蝶窦炎，双肺散在少许炎症，双侧腋窝见多发肿大淋巴结（最大者短径约6 mm），建议结合临床相关检查。头颅MR+全脊柱MR平扫：头颅及脊柱MR平扫检查未见明显异常。
骨髓常规：急性单核细胞型白血病治疗后完全缓解骨髓象（M5-CR）。流式细胞学（骨髓）：未见免疫表型异常的髓系原始/幼稚细胞，MRD<0.01%。骨髓WT1基因定量：WT1（拷贝数）12979， ABL1（拷贝数）325524，WT1表达分数65.53%，结果示高表达。骨髓TET2基因已知突变分析：TET2（Exon3错义变异c.86C>G p.Pro29Arg杂合），该变异为TET2基因的单核苷酸多态性位点（rs12498609）。骨髓TP53基因已知突变分析：TP53（Exon3+4错义变异c.215C>G p.Pro72Arg杂合），该位点为TP53基因的单核苷酸多态性位点（rs1042522）。
诊断
（1）AML（M5，伴TET2、TP53突变、WT1高表达，CR1）。发病时因"咳嗽、发热、白细胞升高"就诊。初诊时，血细胞形态：幼稚细胞46%。骨髓涂片：原始单核加幼稚单核细胞占61%，考虑急性单核细胞型白血病。流式细胞学：骨髓中可见48.92%原始细胞，免疫表型考虑AML-M5。染色体核型：46，XX，t（10；15）（p13；q22），add（11）（q23）[11]/46，XX[9]。AML 15种预后基因：TET2（Exon3错义突变c.86C>G p.Pro29Arg杂合，突变频率45.95%）、TP53（Exon3+ 4错义突变c.215C>Gp.Pro72Arg杂合，突变频率50.66%）、WT1（Exon7同义变异c.1107A>G p.Arg369=纯合）。予NOPHO-2004方案AIET、AM、HA1M化疗。期间监测骨髓形态、MRD均提示CR，但仍可检测到TET2基因、TP53基因等突变位点，WT1高表达。
（2）先天性甲状腺功能减退症（根据既往病史可明确诊断）。
（3）鼻窦炎（根据鼻窦CT结果可明确诊断）。
（4）肺炎（根据肺部查体双肺呼吸音粗糙、胸部CT结果可明确诊断）。
治疗
患儿入院后完善移植前检查，心肝肾各脏器功能未见异常，无严重感染，无移植禁忌证，诊断"AML（M5，伴TET2、TP53突变，WT1高表达）"明确，是移植适应证，家属移植意愿强烈，经移植组教授讨论，按计划行造血干细胞移植术。
移植方案：
因为WT1仍高表达，2019年8月17日—2019年8月21日予地西他滨[20 mg/（m2·d）]化疗，过程基本顺利。2019年8月17日开始行预处理化疗[氟达拉滨150 mg/m2、−8 d~−4 d，白舒非12.8 mg/（kg·d）、−7 d~−4 d，环磷酰胺120 mg/kg、−3 d~−2 d，BCNU 250 mg/m2、口服、−8 d]，GVHD预防方案FK506+MMF。2019年9月4日为0 d，予输注供者脐血[共44.4 ml，供者为男性，HLA 8/10相合，血型为B型Rh阳性，TNC 11.06×107/kg，CD34+ 11.5×105/kg（1.04%）]，输注脐血前、+7 d（2019年9月11日）予MSC 2.5 U输注，以促进植入+12 d（2019年9月16日）中性粒细胞植入，+35 d（2019年10月9日）血小板植入，+14 d（2019年9月18日）查植入比例100%，为完全脐血供者嵌合状态，此后监测植入比例均提示100%。
预防感染：
移植前胸部CT提示肺炎，予舒普深抗细菌，予百炎净+氟康唑预防真菌，更昔洛韦预防病毒感染（移植后每周监测血EBV、CMV-DNA定量情况），每周予输注1次人免疫球蛋白（0.2~0.3 g/kg、每周1次）以增强抵抗力，每日严格进行口腔护理。当出现感染活动时，根据患儿情况调整抗感染方案。移植早期曾出现粒缺伴发热，予美平+他格适、替加环素、卡泊芬净抗感染后体温好转，后改口服泊沙康唑预防真菌。
预防VOD：
肝素钠（100 U/kg、静脉滴注、PI=24 h，用至移植后28 d停）、口服熊去氧胆酸。
植入情况监测：
定期监测血常规、血象恢复后每周监测植入比例。
原发病监测：
患儿移植后满+1、2、3、6、9、12个月行骨穿，了解骨髓形态、流式检测、 WT1基因定量等情况。移植后行骨穿检查均提示原发病完全缓解状态。
免疫监控方案：
患儿移植后满+1、2、3、6、9、12个月抽取患者外周血，采用流式细胞术检测，淋巴细胞亚群（CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B淋巴细胞、NK细胞）、调节性T细胞Treg、T淋巴细胞活化状态（CD3+CD69+细胞、CD3+HLA-DR+细胞）、胸腺近期输出功能（CD4+CD45RA+细胞、CD4+CD45RA+PTK-7+细胞）（表1 ）。在患儿调整免疫抑制剂期间，增加淋巴细胞亚群、T淋巴细胞活化状态的监测频率，以协助判断GVHD诊治情况。
表1 患儿免疫状态监测时间及结果（%）
注：NT为未测试，CD3+T正常范围为56%~75%，CD4+T正常范围为28%~47%，CD8+T正常范围为16%~30%，CD19+正常范围为14%~33%，CD16+CD56+正常范围为4%~17%，Treg正常范围为4.5%~6.2%，CD3+CD69+正常范围为1.2%~3%，CD3+HLA-DR+正常范围为1%~3%
其他：
每周监测肝肾功能，按需监测凝血功能等。
移植后+22 d，患儿头部、后颈部出现密集红色丘疹，瘙痒明显，考虑为皮肤aGVHD，予苯海拉明软膏、糠酸莫米松软膏外涂，口服他克莫司（血药浓度11.4~15.1 mmol/L）治疗，皮疹较前消退。+27 d（2019年10月1日），患儿皮疹明显增多，主要分布在颈部、胸前、后背、腰腹部、臀部及大腿根部，较密集红色丘疹（面积>90%），瘙痒明显，双手掌、脚底充血明显。结合CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD3+CD69+细胞、CD3+HLA-DR+细胞比例明显升高，考虑诊断"Ⅱ度aGVHD（皮肤3级）"明确。结合近期炎症因子TNF-α 23.80 pg/m（参考范围0~8.1 pg/ml，以下同）较正常参考值上限升高2倍、白介素2受体2512 U/ml（223~710 U/ml）明显升高，治疗上加用甲泼尼龙[2 mg/（kg·d），3周逐渐减至口服量]，美卓乐6 mg、每晨1次，肿瘤坏死因子单抗（2019年10月3日、2019年10月6日），MTX（8 mg/m2、2019年10月4日、2019年10月10日），芦可替尼（1.25 mg、2次/d、2019年10月10日—2019年10月16日，2.5 mg、2次/d、2019年10月17日至今）抗GVHD，期间皮疹有所好转，但消退慢，瘙痒明显。监测他克莫司浓度偏低（Cmax 6 mmol/L），他克莫司口服剂量已达0.166 mg/（kg·d），考虑药物吸收不佳。2019年10月16日停用他克莫司，拟2019年10月17日改服环孢素抗GVHD。但停用他克莫司后，当天下午患儿出现新发红色丘疹（主要分布于面部、胸前、后背、双下肢，原陈旧皮疹仍未完全消退），四肢末端皮疹可见蜕皮，双侧手掌、脚底充血明显。2019年10月16日晚上予口服环孢素抗排斥。经上述处理后，患儿面部、胸前皮疹较前减少，后背、双下肢皮疹消退仍较慢，基底皮肤充血较明显，伴明显皮肤脱屑。+48 d（2019年10月22日）患儿全身皮疹再次增多，网状红褐色斑丘疹，伴明显皮肤脱屑，不排除皮肤真菌感染可能。复测CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD3+HLA-DR+细胞比例仍偏高，支持免疫性皮肤损伤。同时予请皮肤科会诊，会诊意见考虑为移植后皮肤反应，建议加强外用药，丙酸氟替卡松软膏+他克莫司软膏或苯海拉明软膏。后患儿皮疹逐渐消退。
治疗结果、随访及转归
患儿于移植后50 d（2019年10月24日）病情稳定出院，无新发皮疹，头面部皮疹明显消退，臀部皮疹消退，后背、腹部、双下肢可见陈旧性皮疹，颜色变淡，可见明显皮屑，无发热，无咳嗽、咳痰，无呕吐、腹泻，无尿频、尿痛、肉眼血尿，无皮肤黄染、出血点等。出院时免疫抑制方案：美卓乐片（4 mg、口服、每早1次，自2019年10月23日起），环孢素口服液（0.28 ml、口服、每隔12小时1次），芦可替尼（2.5 mg、口服、2次/d）。移植后60 d，患儿皮疹基本消退，此时查CD3+T细胞比例恢复正常，CD8+T细胞轻度升高，虽然晚期活化T淋巴细胞比例仍偏高，但Treg较1个月前上升20%。评估皮肤aGVHD控制良好，且患儿为高危AML，为减少复发风险，予停用甲泼尼龙片，环孢素、芦可替尼逐渐减量。免疫抑制剂减量期间，患儿皮疹无复发，血象稳定，监测CD3+T细胞、CD8+T细胞比例恢复正常，CD3+HLA-DR+细胞比例稳步下降。于移植后6个月完全停用免疫抑制剂。定期监测原发病完全缓解、植入比例100%，随访至移植后32个月，患儿无病存活。
讨
论
异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是目前治疗多种难治性恶性血液病的最有效方法，其成功的关键环节之一是移植后免疫系统重建，而aGVHD是影响移植后免疫重建的主要因素[5,6]。对移植后病人的免疫状态进行动态监测，有利于评估其免疫功能重建恢复情况及疾病状态。移植后免疫细胞重建包括天然免疫系统细胞与获得性免疫系统细胞[7]。天然免疫系统细胞包含粒细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞等，恢复时间较快，一般数周至数个月。获得性免疫系统细胞包含T淋巴细胞与B淋巴细胞，重建较慢，一般需要1~2年时间。研究表明，移植后1~3个月，CD3+T细胞、CD8+T淋巴细胞明显升高的患者，发生GVHD的风险高，而活化T淋巴细胞比例升高，也可用于预警GVHD[8]。Treg是抑制移植排斥反应的重要亚群，在aGVHD患者Treg细胞有显著减低，通过监测移植后患者Treg的数量和比值，有助于了解aGVHD治疗效果、指导药物调整[9]。T细胞的完整重建需依赖胸腺产生naïve T细胞分化发育，通过检测胸腺初始性T细胞（CD4+CD45RA+细胞）在移植后病人体内的含量，可以预估病人是否会出现CD4+细胞重建迟缓，可协助指导移植后病人免疫抑制剂的调整[10]。
在本例中，移植后免疫状态监测（淋巴细胞亚群、调节性T细胞Treg、T淋巴细胞活化状态、胸腺近期输出功能）的结果为我们早期诊断aGVHD及鉴别感染起到了非常重要的作用。本例AML移植患儿在移植后22 d即出现皮肤aGVHD表现，口服他克莫司、外用激素类药物治疗情况下，皮疹无好转。此时监测CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD3+CD69+细胞、CD3+HLA-DR+细胞比例均明显升高，Treg细胞比例显著减低，免疫指标与临床表现相符，遂予加强免疫抑制方案。患儿皮疹有所消退、但反复，并伴随皮肤明显脱屑，在免疫抑制较强的情况下，发生感染的风险显著增加，此时需要与皮肤真菌感染等相鉴别，是进一步加强免疫抑制还是减弱免疫抑制？这是摆在医生面前的一个严峻问题。通过复测CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD3+HLA-DR+细胞比例情况，提示仍明显偏高，支持GVHD诊断，遂再次调整、加强抗排斥方案，患儿皮肤GVHD得以好转，且获得较好的生存预后。
异基因造血干细胞移植术后，患者的免疫重建与临床预后密切相关，尽管移植后免疫重建及免疫耐受的机制、机体GVHD机制等，目前仍未完全清楚，但移植后免疫细胞的恢复情况与临床之间的相关性却可以给移植患者的术后管理提供非常可贵的意见，以协助临床医生制定合理的治疗方案。
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