引言
脓毒症是指由于宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍。免疫反应失调是脓毒症的关键病理生理学特征之一，表现为过度炎症和免疫抑制共存。不同患者的促炎和免疫抑制反应程度及其对脓毒症相关免疫病理机制的相对贡献存在较大的异质性。这种异质性被认为是脓毒症患者免疫调节失败的主要因素，为此有学者提出基于宿主反应特征将脓毒症患者分层为不同亚组（内型）或许可以提升治疗效果。
鉴于免疫反应复杂且对脓毒症的预后至关重要，华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科汪峰教授等系统地研究了与脓毒症和菌血症患者预后相关的免疫指标，采用无监督分层聚类方法识别具有相似免疫特征的患者群体。研究揭示了三类具有不同生存率的脓毒症患者群体，并构建了基于免疫数据的预测模型以识别不同内型的脓毒症患者。研究结果发布在Frontiers in immunology（IF：5.7），汪峰、侯红艳为共同通讯作者。
研究设计
研究共招募115例血培养呈阳性的患者，其中包括25例菌血症患者和90例脓毒症患者，同时招募了40例健康个体作为对照组（HCs）。采用流式细胞术对所有受试者进行外周血免疫细胞亚群检测，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、T辅助细胞（Th）、滤泡辅助T细胞（Tfh）、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞（DCs）和髓源性抑制细胞（MDSCs），同时检测细胞因子和趋化因子。对免疫指标数据进行无监督k-means聚类分析，以识别脓毒症患者集群，并采用有监督的随机森林方法建立脓毒症内型分类预测模型。
图1 外周血免疫细胞亚群
研究结果
脓毒症患者的外周免疫分析
在先天性免疫方面，菌血症患者表达HLA-DR的单核细胞水平显著低于HCs，这一趋势在脓毒症患者中更为明显；从HCs到菌血症、脓毒症患者，单核样MDSCs（M-MDSCs）比例逐渐增加，而DCs尤其是髓样DCs（mDCs）比例逐渐下降，NK细胞数量也逐渐减少（图2A）。在细胞免疫方面，从HCs到菌血症、脓毒症患者，CD4+和CD8+T细胞数量逐渐下降，而活化的HLA-DR+CD8+T细胞比例在菌血症和脓毒症患者中往往高于HCs；与HCs相比，脓毒症患者的Th2和Th17细胞比例显著更高，但Th1和Tfh细胞比例显著更低（图2B）。在体液免疫方面，菌血症和脓毒症患者的B细胞数量和非转换记忆型B细胞比例显著低于HCs，而浆细胞比例显著高于HCs（图2D）。在细胞因子谱方面，与HCs相比，菌血症和脓毒症患者的促炎细胞因子（如IL-6、GM-CSF和CXCL10）和抗炎细胞因子（如IL-1ra、IL-10和PD-L1）水平均显著升高（图2C）。
聚类分析显示，在脓毒症患者中，低水平的免疫潜能指标（如CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数和单核细胞上的HLA-DR表达）与高水平的免疫抑制性细胞（如Treg细胞、M-MDSCs和Th2细胞）并存（图2E）。当与菌血症和HCs比较时，免疫抑制和炎性细胞因子是脓毒症患者最显著的特征。这些数据支持脓毒症患者在炎症加剧的同时先天性和适应性免疫受损的观点。
图2 脓毒症患者的免疫状况
脓毒症和菌血症患者的鉴别
PMN-MDSCs、M-MDSCs、HLA-DR+单核细胞等免疫指标在鉴别脓毒症患者和HCs方面表现出良好的性能（图3A）。尽管脓毒症和菌血症患者之间的许多指标，如M-MDSCs比例、CD4+T细胞计数和Tfh17细胞比例存在显著差异，但使用单一指标的鉴别性能不佳，最高AUC为0.75（图3B）。基于80项免疫指标的t-SNE分析显示，脓毒症患者与HCs能够很好地鉴别，但脓毒症和菌血症患者之间存在较大重叠，无法很好地鉴别，可能与脓毒症患者的异质性较大相关（图3C）。随后的主成分分析显示，免疫潜能指标（CD4+T细胞计数、HLA-DR+单核细胞比例和mDCs比例）和抗炎细胞因子IL-1ra分别是HCs和脓毒症患者最重要的变量（图3D）。
图3 脓毒症和菌血症患者的鉴别
不同生存结局脓毒症患者的外周免疫特征
90例脓毒症患者中，24例死亡，66例存活。与死亡患者相比，存活患者显示出更高水平的代表正常免疫潜能的指标，如CD4+T细胞计数、HLA-DR+单核细胞比例和mDCs比例；相反，与存活患者相比，死亡患者的免疫抑制性细胞（M-MDSCs、PMN-MDSCs）和抗炎细胞因子（PD-L1、IL-1ra）水平更高。尽管主成分分析显示，免疫潜能指标（CD4+T细胞计数、HLA-DR+单核细胞比例和mDCs比例）和抗炎细胞因子IL-1ra分别是脓毒症存活患者和死亡患者最重要的变量（图4C），但t-SNE分析并未支持结合这些免疫指标来区分死亡和存活患者（图4B）。
图4 不同临床结局脓毒症患者的免疫特征
利用外周免疫指标对脓毒症内型进行分类
考虑到使用免疫指标来鉴别脓毒症与菌血症或预测脓毒症临床结局的难度，可能归因于脓毒症患者之间的显著异质性，因此研究人员基于80项免疫指标进行无监督k-means聚类分析，将脓毒症患者分为三个不同集群（图5）：
Cluster 1占比为36.7%，命名为“效应型（effector-type）”。此类患者特征是T细胞上表达的效应表型与其他集群不同，具体表现为CD4+和CD8+T细胞上的HLA-DR表达水平较高，同时效应记忆CD4+T细胞比例增加，这表明机体正在积极有效地对抗感染，此类患者生存率为75.76%。
Cluster 2占比34.4%，命名为“潜在型（potential-type）”。此类患者表现为CD4+T细胞计数、初始CD8+T细胞比例和CD28+CD8+T细胞比例等免疫潜能指标水平较高，这表明机体正在积极地从骨髓中生成免疫细胞来对抗感染，此类患者生存率最高，达83.87%。
Cluster 3占比28.9%，命名为“失调型（dysregulation-type）”。此类患者特征是免疫失调，同时具有最高水平的促炎细胞因子（如CXCL-10和GM-CSF）、抗炎细胞因子（如IL-1ra和PD-L1）和免疫抑制性细胞（如M-MDSCs和Treg细胞），这种完全的免疫功能失调会导致患者预后极差，死亡率最高，生存率为57.69%。
图5 基于免疫指标的脓毒症内型分类
构建脓毒症内型分类预测模型
考虑到三种脓毒症内型的生存率差异，研究基于90例脓毒症患者的80项免疫指标数据，构建了一个用于对脓毒症内型（Cluster 1、Cluster 2、Cluster 3）分类的预测模型。根据准确率的平均下降率，按预测的重要性对前30项免疫指标进行了排序，前15项免疫指标分别是HLA-DR+CD8+T细胞比例、HLA-DR+T细胞比例、初始CD8+T细胞比例、CD28+CD8+T细胞比例、CD4+T细胞计数、B细胞比例、T细胞计数、T细胞比例、CD8+T细胞计数、CD8+T细胞比例、IL-10、Tfh1细胞比例、IL-1ra、B细胞计数和mDCs比例（图6）。
图6 克利夫兰点图显示了根据准确率平均下降率按预测重要性排序的前30项免疫指标
混淆矩阵显示了根据90例脓毒症患者80项免疫指标数据建立的模型的准确性，除Cluster 3外，其他两个集群的分类误差均小于0.10（图7）。随后，研究人员将基于90例脓毒症患者的原始数据集构建的预测模型用于预测另一组由37例脓毒症患者队列的集群，预测模型的准确率为86.5%（图8）。
图7 以90例脓毒症患者80项免疫指标为基础的预测模型的准确性
图8 基于另一组37例脓毒症患者数据的预测模型准确性
小结
本研究在脓毒症患者中发现了代表不同免疫状态的三种免疫内型，在一定程度上揭示了脓毒症异质性的原因。这三种免疫内型均表现出免疫失调，其中“失调型”最为严重，死亡率也最高，其特点是炎症因子和抗炎因子同时过度释放，同时存在大量免疫抑制性细胞，这一免疫特征或许可以作为脓毒症患者免疫反应失调的一种表现和解释。本研究还建立了一个基于免疫指标数据的预测模型，可准确地将脓毒症患者分为三种免疫内型，这对精准选择治疗脓毒症的免疫调节剂具有潜在价值。
脓毒症个体间异质性以及缺乏预测和预后标志物阻碍了对脓毒症有效的分诊和实施个性化治疗。内型的概念在脓毒症中相对较早就被提出，基因组学广泛用于定义这些内型，但根据免疫指标将脓毒症患者分层为不同内型较为少见。本研究系统描述了脓毒症患者的免疫状况，并将脓毒症患者分层为三种生存结局不同的免疫内型，为脓毒症内型研究提供了一项重要补充。通过外表型（临床表型）结合内型的脓毒症分型方式，指导制订更加多元化的精准治疗策略是未来的重要发展方向，也是主要挑战和难点所在。
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参考文献
Tang G, Luo Y, Song H, et al. The immune landscape of sepsis and using immune clusters for identifying sepsis endotypes[J]. Front Immunol, 2024, 15:1287415.
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