孙春艳
免e监控特约撰稿人
华中科技大学附属协和医院血液科，三级教授，主任医师，博士生导师。中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会常委，中华医学会血液学分会青年委员，中华医学会血液学分会实验诊断学组委员，中华医学会血液学分会浆细胞学组委员等。
引言
浆细胞病是一组克隆性浆细胞增殖性疾病，包括意义未明的单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）、多发性骨髓瘤（MM）、浆细胞瘤（孤立性骨浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤）、免疫球蛋白沉积病（原发性轻链型 淀粉样变、轻链和重链沉积病）、POEM综合征等。既往浆细胞病的诊断依赖于骨髓穿刺等有创方法，随着液体活检技术的兴起，相对无创的外周血检测 技术应运而生。大量研究表明，应用流式细胞术（FCM）检测外周血循环浆细胞（CPCs）有助于浆细胞病的早期筛查、预后判断以及治疗选择。
为促进FCM检测CPCs在临床中的规范使用，由中华医学会血液学分会浆细胞疾病学组、中华医学会血液学分会实验诊断学组牵头，集结40余名专家，胡豫教授、吴德沛教授、黄晓军教授共任通讯作者，并由华中科技大学同济医学院附属协和医院孙春艳教授和蔡丽执笔，共同制定了《外周血循环浆细胞流式细胞术检测在浆细胞病中的应用中国专家共识（2024年版）》1。该共识以当前外周血CPCs检测在浆细胞病中应用的循证数据为依据进行总结及建议，同时对FCM检测外周血CPCs的技术要点进行了推荐。本期将对该共识进行详细解读。
CPCs在MGUS中的临床价值
共 识 一
为准确了解MGUS疾病状况并预判疾病进展风险，患者诊断时和随访过程中，可以在常规检测项目基础上通过FCM检测CPCs。【推荐强度：建议采用】
【解读】
MGUS监测的重要性
所有的MM均由MGUS进展而来，每年大约1％的MGUS患者进展为MM、淀粉样变性、轻链沉积病等，而接受严密随诊的MGUS患者的总生存率更高、并发症更少。因此，采用灵敏度高、适用性强的方法对MGUS患者进行监测可能具有重要价值。
CPCs在MGUS中的研究证据
MGUS患者的外周血CPCs阳性率为21％～59％。CPCs数量高（≥0.058 个/μl）的MGUS患者进展至冒烟型骨髓瘤（SMM）或活动性MM的比例显著高于CPCs低（＜0.058个/μl）的患者（21％ vs. 0%，P＜0.0001）2，提示CPCs可预测MGUS进展风险。
CPCs在SMM中的临床价值
共 识 二
FCM检测CPCs具有预测SMM疾病进展的能力，CPCs水平升高是SMM的独立预后因素；建议在SMM诊断时通过FCM检测CPCs，并与sFLCR和M蛋白等常规检测相结合，以更好识别高危患者。【推荐强度：建议采用】
【解读】
SMM监测现状
SMM诊断后的前5年内，每年大约10％的患者进展为MM。目前较常用的SMM风险评估模型包括梅奥模型和西班牙模型，但是两个模型一致性欠佳，临床如何识别出高危SMM仍具有挑战。
CPCs在SMM中的研究证据
CPCs的预测效能明显优于梅奥模型：梅奥风险模型［高危组：骨髓浆细胞≥10％，血清单克隆免疫球蛋白（M蛋白）≥3 g/dl］预测SMM患者2年内进展为MM的风险特异性为85％，但阳性预测值仅有33％。而以CPCs≥0.1％（即每150,000个外周血细胞中检出150个异常克隆浆细胞）为临界值进行预测，特异性高达97％，阳性预测值为78％3。
FCM检测CPCs可能有助于SMM危险分层，完善梅奥20/2/20模型：iMMunocell多中心研究表明CPCs＞0.015％（相当于外周血检出0.773个异常克隆浆细胞/μl）是独立的预后不良因素；提出了包含CPCs的新SMM模型20/2/0.015（sFLCR＞20，M蛋白＞2 g/dl，CPCs＞0.015％），将患者分为低、中、高三个危险组，低、中危组的疾病进展时间（TTP）尚未达到，而高危组患者的TTP为21.3个月（图1）4。
图1 20/2/0.015模型下患者风险分层的TTP分析
CPCs在MM中的临床价值
① NDMM初诊时检测CPCs
共 识 三
CPCs阳性为NDMM独立预后不良因素；建议NDMM患者在初诊时通过FCM检测CPCs。【推荐强度：强烈建议】
【解读】
CPCs在NDMM中的研究证据
NDMM初诊时检测CPCs在国外已成为常规检测，多项国内外临床研究显示，CPCs与MM预后显著相关，各中心在不同实验室条件下通过统计分析得出各自的cut-off值，详见表1。
表1 各项研究中外周血循环浆细胞的临界值与结论
CPCs可优化患者风险分层
CPCs可优化R-ISS风险模型的分层效果：将R-ISS分期为Ⅰ期和Ⅱ期且CPCs阳性（≥5/μl，相当于400/150,000）的患者定义为Ⅱb期，结果显示，Ⅱb期患者的至下次治疗时间和总生存（OS）期明显短于Ⅰ期和Ⅱ期患者（图2）5。
图2 不同分期患者的至下次治疗时间和OS分析
CPCs结合PET-CT等方法也可提高风险分层能力：PET-CT高代谢病变部位＞3个、CPCs≥0.01％是独立预后因素，两者联合能有效预测MM患者预后，与R-ISS分期结合能够进一步区分Ⅱ期及Ⅲ期无进展生存（PFS）期较差患者6。
② MM化疗后检测CPCs
共 识 四
MM化疗后CPCs阳性预示缓解深度不足，并与更短的EFS和OS期相关，建议MM化疗后通过FCM检测CPCs，有助于识别预后不佳患者。【推荐强度：建议采用】
【解读】
治疗后的CPCs状态与患者的预后显著相关
一项研究应用了外周血微小残留病（PBMRD）概念，在诊断时、3个疗程后（PBMRD1）和6个疗程后（PBMRD2），使用10～13色高敏感度多参数FCM检测CPCs（灵敏度10-6），PBMRD阳性定义为CPCs≥0.0001％。结果显示，PBMRD1与PBMRD2中任一时间点的CPCs状态都与无事件生存（EFS）期和OS期显著相关7。
③ auto-HSCT前后检测CPCs
共 识 五
auto-HSCT前后CPCs状态是影响MM患者PFS期、OS期和TTP的独立预后因素。建议auto-HSCT前及移植后100 d进行CPCs FCM检测。【推荐强度：建议采用】
【解读】
auto-HSCT前后的CPCs状态与患者预后相关
auto-HSCT造血干细胞采集前、移植前以及移植后100d CPCs阳性患者的预后更差，PFS期、OS期和TTP明显变短。研究显示，auto-HSCT前后使用6色多参数FCM（灵敏度10-4），CPCs持续阴性患者获得严格意义的完全缓解的比例及生存情况均优于持续阳性、由阳转阴及由阴转阳患者8。
图3 不同CPC状态下的移植后反应和存活率
CPCs在浆细胞白血病（PCL）中的临床价值
共 识 六
CPCs≥5％是诊断PCL的标准，EuroFlow NGF检测CPCs≥2％的患者可能具有PCL特征，建议初诊怀疑PCL时通过FCM检测CPCs，识别具有潜在PCL特征的超高危MM患者。【推荐强度：建议采用】
【解读】
PCL诊断现状
原发性PCL的侵袭性强，预后差，其诊断标准也在不断变化。2021年IMWG提出将外周血涂片浆细胞比例≥20％下降到≥5％作为PCL的诊断标准；最新研究提出根据FCM检测结果将比例进一步下降到2％。
CPCs在PCL中的研究证据
研究表明，EuroFlow NGF检测CPCs 在2％～5％的MM患者和CPCs在5％～20％的MM患者中位PFS期相近（3.4个月 vs. 5.1个月，P＝0.42），且PFS期均明显短于CPCs＜2％的MM患者9。
图4 根据CPCs分组的患者PFS分析
CPCs检测技术：多参数FCM vs. EuroFlow NGF
FCM检测CPCs的技术包括常规的多参数FCM和EuroFlow为代表的NGF技术，两者的比较见下表。结合国内检测现状，常规多参数FCM检测CPCs更具有普适性。
多参数FCM检测CPCs的技术要点
共 识 七
建议FCM检测CPCs的LOD至少达到10-4，检测方案建议包含胞质轻链的抗体组合方案，推荐CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD27、cyκ和cyλ组成的单管8色检测方案，有条件实验室可采用双管8色或单管10色方案。采用EuroFlow NGF方案的实验室采用NGF标准下的适当cut-off值，未达EuroFlow NGF标准的实验室可通过各自标准化的FCM操作流程、合理的抗体组合方案设计以及严谨的临床研究分析，建立各自中心的cut-off值。【推荐强度：建议采用】
【解读】
抗体选择
一般患者的抗体选择：
接受靶向CD38单抗治疗患者的抗体选择：靶向CD38的单抗药物会干扰浆细胞表面CD38的检测，导致假阴性结果。建议应用此类药物的患者检测CPCs时使用多表位CD38 Me，或使用可识别内质网膜上的CLIMP-63蛋白的VS38c以及CD38纳米单抗等代替。其他抗体如CD319、CD229、CD54等在浆细胞中高表达，与CD45、CD138等组合作为单抗治疗后的浆细胞的圈门抗体仍有待更多研究证实。
检测灵敏度选择
建议以30个和50个细胞分别作为CPCs的方法学检测限和可定量的最小细胞数，则LOD＝30/获取细胞数×100％ ，LLOQ＝50/获取细胞数×100％。
方法学灵敏度越高，可能临床意义更大。研究表明，LOD为10-4时，CPCs在新诊断MGUS、SMM、MM及治疗后MM患者中的阳性率分别为25％、24％、67％、19％；LOD为10-6时（采用NGF），CPCs阳性率可分别提高至59％、100％、100％、26％10。
不同患者的LOD或LLOQ标准不同。对于新诊断SMM和MM患者，CPCs检测的LOD达到10-4即可辅助预后判断，且该检测灵敏度对所需标本量、分析软件等要求不高，更易推广和实施。因此，建议CPCs检测的LOD至少达到10-4，有条件实验室可增加获取细胞数，使LOD或LLOQ达到10-5或更低。对于MGUS及治疗后MM患者，对MGUS患者及治疗后MM患者的CPCs监测，LOD或LLOQ达到10-5或更低可提供更好的研究价值，有条件实验室可采用。
样本储存及制备
需注意以下几点：
◆ 抗凝剂选择 建议采用EDTA抗凝，肝素抗凝时CD138的表达会减弱；
◆ 储存时间 建议在24h内完成检测，尽量不超过48h。标本放置时间延长，容易出现CD138抗原脱落。如放置超过48h，应注意存在假阴性可能，须在报告中注明；
◆ 获取细胞数 标本染色前，需先对外周血计数以决定用血体积对于治疗后MM患者，有条件实验室可获取（2～3）×106个细胞/管，使LOD达到10-5，可对足量外周血进行富集，通过氯化铵溶红的步骤，将细胞总体积控制在200μl，再进行抗体标记；为LLOQ达到10-5，则需至少获取5×106个细胞/管；
◆ 样本制备法 建议参考EuroFlow NGF的标准标本制备流程。不建议采用Ficoll密度梯度离心法富集单个核细胞，富集过程会造成浆细胞选择性损失，并加速CD138等抗原丢失。
以下为获取（2～3）×106个白细胞的细胞富集及染色流程。
细胞获取、设门分析及报告要求
需注意以下几点：
◆ 细胞获取 由于肿瘤浆细胞FSC参数变异较大，建议控制FSC电压避免肿瘤细胞群超出右界限，并设定合适的FSC阈值，以尽量减少细胞碎片的获取比例；
◆ 圈门 圈总浆细胞门时，应圈入CD38briCD138-细胞群，以防止漏掉正常浆细胞或CD138阴性的异常浆细胞；
◆ 报告方式 建议以单克隆浆细胞占白细胞百分比的方式进行报告，该计算方法不受红细胞裂解效果和细胞碎片的影响。建议报告LOD及LLOQ并参考国际临床细胞计量学学会（ICCS）MM FCM MRD建议：①检测结果＞LLOQ：报告异常单克隆浆细胞百分比、异常单克隆浆细胞数、白细胞总数；②检测结果介于LOD～LLOQ之间：报告异常单克隆浆细胞百分比＜LLOQ、异常单克隆浆细胞数、白细胞总数；③检测结果＜LOD：报告异常单克隆浆细胞百分比＜LOD、异常单克隆浆细胞数、白细胞总数。
以下为设门分析策略示例。
FCM检测CPCs的临床应用价值日益凸显，该共识的发布明确了CPCs检测在MGUS、SMM、MM和PCL中的临床价值，包括辅助诊断、预测疾病进展、改善患者风险分层、预测预后等；同时，规范了FCM检测CPCs的方法。但部分方面尚待完善，例如检测方法标准化、抗体组合持续优化和cut-off值一致化等，期待未来的进一步发展。
e小道诚邀各位同道
长按关注【免e监控】公众号
因本系统/平台/文件中对部分医院某些信息的收集可能构成国家秘密、重要数据或基于国家安全考量不宜收集的数据，所以本系统/平台/文件不允许采集及输入这些敏感信息以确保公司在数据合规方面严格遵守中国法律、法规的要求。
