引言
脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍，其特点是宿主对感染的炎症反应失衡。在接受重症监护的脓毒症患者中，约三分之一会在28天内死亡。免疫功能障碍是脓毒症的关键病理生理学特征之一，涉及不同类型的免疫细胞及其复杂的分子调控。研究表明，脓毒症患者的T细胞、B细胞和NK细胞的数量和质量发生改变，导致免疫细胞的分化和活化受损，以及负性共刺激分子高表达。此外，脓毒症患者免疫抑制标志物（如BTLA+CD4+T 细胞、TIM-3+CD4+T细胞和Th17/Treg比率）的水平增加与死亡率或继发感染率升高有关。因此，监测脓毒症患者的免疫状态对于评估预后和器官功能保护具有重要意义，迫切需要确定脓毒症患者免疫细胞改变的关键特征，并根据免疫表型生物标志物进行风险分层。
北京协和医院感染内科主任李太生教授团队应用流式细胞术和机器学习（ML）法，探讨了T细胞和NK细胞（尤其PD-1+NK细胞）在脓毒症中的作用。该研究结果发表于Frontiers in Immunology（IF：5.7），首次提出了脓毒症免疫表型及其与炎症生物标志物之间的相关性，以及根据免疫亚型确定了死亡风险增加的患者。
研究设计
该回顾性研究纳入100例脓毒症患者（根据脓毒症3.0标准确诊，且包含患有慢性感染、自身免疫性疾病或癌症等基础疾病的患者）和89例年龄与性别相匹配的健康对照者，收集其临床特征和实验室检测数据。采用18色流式细胞术分析外周血淋巴细胞免疫表型，XGBoost和k-means聚类作为机器学习法用以分析免疫细胞谱，并根据脓毒症患者的免疫亚型对其进行分层。此外，研究人员还基于Cox回归生存分析和ROC曲线确定了可用于预测28天死亡率的潜在生物标志物及其准确性。
研究结果
脓毒症患者外周血淋巴细胞发生显著变化
脓毒症患者的淋巴细胞谱与健康对照组相比表现出显著差异。相较于健康对照组，脓毒症患者的Tregs、纯真CD4+T、PD-1+CD4+T、Ki67+CD4+T、CD38+HLA-DR+CD4+T、PD-1+CD8+T、Ki67+CD8+T、HLA-DR+CD8+T、CD38+CD8+T、CD38+ HLA-DR+CD8+T、HLA-DR+NK、CD38+NK、PD-1+NK和Ki67+NK细胞比例显著升高；但脓毒症患者的绝对淋巴细胞、记忆CD4+T细胞和NK细胞比例显著低于健康对照组。该结果表明，脓毒症患者的外周血免疫细胞谱被破坏。
图1 脓毒症患者和健康对照者淋巴细胞亚群的比较
机器学习法确定和验证可用于区分脓毒症和健康对照者的淋巴细胞特征
在XGBoost模型中，CD38+CD8+T、PD-1+NK和HLA-DR+CD8+T细胞是区分脓毒症患者与健康对照者的前3种外周免疫细胞亚型（图2A）。XGBoost模型在测试集中区分脓毒症患者和健康对照者的准确率为1.0，在训练集和测试集中AUC分别达100%和99.8%，表明XGBoost模型可有效区分脓毒症患者和健康对照者（图2B）。
图2 XGBoost模型和SHAP值评估变量的重要性
脓毒症中不同淋巴细胞亚群与血清生物标志物之间的相关性
相关性分析结果显示，脓毒症患者的淋巴细胞比例与高敏C反应蛋白（hsCRP，r=-0.2911）和降钙素原（PCT，r=-0.3034）呈显著负相关，CD3+T细胞比例也与hsCRP（r=-0.4066）和PCT（r=-0.4802）呈显著负相关。相反，NK细胞比例与PCT呈显著正相关（r=0.3895）。
图3 免疫细胞亚群与实验室参数的相关性分析
使用机器学习法对脓毒症患者的外周免疫分型进行聚类分析
研究人员在脓毒症患者的淋巴细胞亚群中发现两个聚类，并通过k-means在两个聚类中探索了T细胞亚群和NK细胞的免疫模式（图4A）。
在聚类1中，PD-1+NK (13.80% vs. 8.38%)、CD38+CD8+T（79.25% vs. 40.45%）、HLA-DR+CD8+T（76.60% vs. 40.45%）、CD38+HLA-DR+CD8+T（56.00% vs. 20.75%）和记忆T细胞（75.25% vs. 50.60%）的比例显著更高；在聚类2中，CD4+T（32.95% vs. 59.35%)、纯真CD4+T（18.95% vs. 42.90%）和CD4+CD28+T（91.65% vs. 95.25%）细胞的比例显著更高。值得注意的是，PD-1+NK细胞比例的差异在两个聚类间最为显著（图4B）。
图4 基于脓毒症淋巴细胞亚群的聚类分析
基于PD-1+NK免疫细胞分层预测脓毒症患者28天内的死亡率
上述机器学习结果表明PD-1+NK细胞是潜在的免疫风险生物标志物，研究人员进一步分析了PD-1+NK细胞在预测脓毒症患者28天死亡率方面的临床实用性。初步结果表明，28天内死亡的脓毒症患者，其PD-1+NK细胞水平显著高于存活者（15.1% vs 8.6%，P<0.01）。ROC曲线分析显示，PD-1+NK细胞比例、hsCRP、PCT、白介素6（IL-6）、序贯器官衰竭评估（SOFA）评分预测28天死亡率的AUC分别为0.69、0.58、0.52、0.56、0.727。当PD-1+NK细胞比例与SOFA评分组合时，AUC可达0.91（图5）。
将SOFA+PD-1+NK模型与单一指标进行对比发现，相较于PD-1+NK、hsCRP、PCT和IL-6，SOFA+PD-1+NK模型的死亡率预测效果均更优，但SOFA+PD-1+NK模型与SOFA评分之间没有统计学差异（0.91 vs. 0.89，P>0.05）。
图5 PD-1+NK、炎症标志物和SOFA预测患者28天死亡率的ROC曲线
将脓毒症患者PD1+NK细胞比例按11.25%的临界值分为升高组和正常组，进行单变量和多变量Cox回归分析。结果显示，PD1+NK细胞可预测脓毒症死亡率（HR=3.96，P=0.007）。校正年龄、性别和SOFA评分后，PD1+NK细胞比例增加仍然与28天死亡率显著相关（aHR=1.34，P<0.001）。
图6 28天死亡率的Cox回归分析
小结
综上，该研究首次调查了PD-1+NK细胞比例在脓毒症中的预后作用，PD-1+NK细胞的表达是脓毒症28天死亡率的独立危险因素，可作为预测患者（基于脓毒症3.0标准）预后的重要指标。
随着脓毒症引发的免疫失调越来越受到关注，国内外的研究者也在大力探索脓毒症外周免疫标志物，以期用于患者的预后评估。李太生教授团队首次揭示了PD-1+NK细胞在脓毒症预后中的重要价值，且将PD-1+NK细胞纳入SOFA评分系统可能会优化SOFA评分的预测效果。这表明反映免疫功能的指标与临床常用标准相结合或可更好地服务于临床管理，改善脓毒症患者预后，但尚待进一步研究。
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参考文献
Tang J, Shang CM, Chang Y, et al. Peripheral PD-1+NK cells could predict the 28-day mortality in sepsis patients[J]. Front. Immunol. 2024,15:1426064.
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