引言
原发性免疫缺陷（PID）是一组由各种免疫系统缺陷引起的异质性罕见疾病。PID种类繁多，早期诊断危及生命的PID[如重症联合免疫缺陷（SCID）]，对于促进及时干预和预防并发症至关重要。多参数流式细胞术（FCM）是常规临床实践中诊断PID不可或缺的工具，EuroFlow为标准化FCM检测做出了巨大贡献。在PID领域，EuroFlow开发并验证了一种创新的解决方案，其核心为PID筛查管（PIDOT），它可以高效的检测淋巴细胞计数中的免疫表型异常，尤其在SCID等严重的PID亚类中；通过结合EuroFlow参考数据库（EuroFlow Database）和年龄匹配参考范围，有助于早期淋巴细胞PID的诊断筛查。随着国际医学实验室标准的更新，EuroFlow开发了创新且易于实施的室间质量评价计划（EQAS），旨在对常规使用EuroFlow解决方案的临床实验室的整体操作流程进行质量评价。EQAS将本地实验室技术的性能评估（湿式）与数据解读（干式）分开评价，其干式设计对于淋巴细胞PID的检测分析尤为重要。
Tomas Kalina教授及其团队于近期报道了EuroFlow PIDOT-EQAS的设计和主要结果，该项目涵盖连续6轮的EQAS，共有来自4大洲11个国家不同地区的20个实验室参与，并且使用了来自3个制造商的5种不同FCM仪器。其结果证实了EuroFlow PIDOT-EQAS在提高罕见淋巴细胞PID诊断方面的潜力，并为实验室提供了一个有效的质量检测和教育平台。
什么是PIDOT-EQAS？
PIDOT-EQAS的目的
EuroFlow PIDOT是淋巴细胞PID诊断筛查的有力工具，PIDOT-EQAS项目旨在监控本地PIDOT的开展情况并发现可能存在的技术和解读问题，同时可对各个实验室的质量（即准确性、可重复性和结果解读）提供反馈。
PIDOT-EQAS的设计
PIDOT-EQAS分为“湿式”和“干式”两种模式（图1）。在湿式模式中，对当地采集的健康对照样本进行分析，将目标细胞的标志物染色强度（MedFls）与EQAS目标值进行比较。在干式模式中，参与实验室分析了统一提供的PlDOT流式细胞术数据。成功完成每轮EQAS后，参与实验室将获得一份关于结果和常见问题的总结报告，可在EQAS管理者组织的教育研讨会上讨论检测结果。
图1 EuroFlow PIDOT-EQAS概述
PIDOT-EQAS的优势
PIDOT-EQAS无需在实验室中分发全血样本，而是基于本地收集的样本（湿式）和统一分发的流式细胞术FCS文件（干式）。PIDOT-EQAS取消样本分发，避免了样本因固定和/或长时间运输而变质的风险，并确保所评估的样本代表“真实”的样本类型。同时还避免了从儿科患者身上采集大量样本进行分发的需要。
在湿式模式下，健康对照者的外周血样本中，每轮EQAS每个标志物亚群组合的平均MedFIs %rCV从23%到58%不等，所有测量的中位%rCV为35%（图2）。在干式模式下，所有PID病例中大多数细胞亚群（84.5%）的绝对细胞计数的%rCVs低于30%，所有主要淋巴细胞亚群（即总B、总T、TCD4+、TCD8+和NK细胞）的绝对细胞计数显示出较低的平均%rCVs（3.1-7.1%）。
图2 PIDOT-EQAS湿式模式下的MedFIs %rCV
使用湿式模式总分（＞91%为成功，76%~91%为可接受，＜76%为失败）评估实验室的表现，结果表明随着重复参与，实验室的表现有所改善。湿式模式总分的平均值和中位值分别为82%、91%（图3A）。随着参与轮次的增加，EuroFlow追随实验室的平均总分也呈上升趋势，在超过3轮测试后达到82.9%，与参与3轮或以上测试的EuroFlow成员实验室（86.1%）相当（图3B）。在每轮EQAS中，EuroFlow追随实验室和EuroFlow成员实验室、液体试剂和冻干试剂之间均未观察到总分的显著性差异（图3C）。
图3 PIDOT-EQAS湿式模式下的湿式模式总分
使用干式模式总分评估实验室的数据解读能力，结果显示大多数实验室（每个病例的回复率超过80%）都能识别出免疫细胞变化的严重PID病例，如SCID和无丙种球蛋白血症。干式模式总分的平均值和中位数分别是85.3%、89.0%（图4）。在所有PID病例中，79.3%的绝对细胞计数解读结果与参考实验室相一致。实验室可根据所提供的免疫表型和最基本的临床信息选择最匹配的PID亚型。
图4 PIDOT-EQAS干式模式下的干式模式总分
在所有EQAS轮次中观察到单个细胞类型的细胞计数解读不一致，可能是由于当地应用的年龄匹配参考范围和/或数据分析策略（手动或自动圈门）不同造成的。例如在干式模式中，使用自动圈门的实验室其细胞计数变异性显著低于手动圈门的实验室（中位%rCV：2.5 % vs. 7.6%，P=0.0002）。使用EuroFlow标准化FCM程序和定期更新的年龄匹配参考值，可提高标准化程度。
在PID的临床诊断中，最重要的是专科和非专科实验室都能通过分析和解释FCM数据，对照年龄匹配的参考范围，熟练识别相关的淋巴细胞异常。PIDOT-EQAS干式模式中参考实验室可收集PID病例的FCS文件，并根据IUIS诊断类别进行分类，区分IUIS I和IUIS II中的严重T细胞缺陷病例以及IUIS III中的B细胞缺陷病例，并分发给其他实验室以供指导。
小结
综上，PIDOT-EQAS推动了实验室对于PID检测流程的标准化，通过标准化整体流程，可有效监测PIDOT免疫表型分析的质量和本地报告程序，从而提高检测结果的准确性以及结果解读的能力。此外，PIDOT-EQAS提供了一个独特的教育支持平台，实验室可从急需进一步临床治疗的重症病例中汲取经验。PIDOT-EQAS提高了PID筛查中流式细胞术检测的质量，为未来罕见病背景下的免疫表型EQAS提供了范例。
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参考文献
Neirinck J, Buysse M, Brdickova N, et al. The EuroFlow PIDOT external quality assurance scheme: enhancing laboratory performance evaluation in immunophenotyping of rare lymphoid immunodeficiencies. Clin Chem Lab Med. 2024 Oct 21.
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