https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/cell-analysis-resource-library/ebioscience-resources/human-antibody-cross-reactivity-chart.html
Human Antibody Cross-Reactivity Chart
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/577759v1.full
Cell type-specific monoclonal antibody cross-reactivity screening in non-human primates and development of comparative immunophenotyping panels for CyTOF
bioRxiv 577759; doi: https://doi.org/10.1101/577759
非人类灵长类动物中细胞类型特异性单克隆抗体交叉反应筛选和 CyTOF 比较免疫表型分析面板的开发
摘要：单克隆抗体是免疫学家的重要工具，其应用包括免疫显微镜和细胞计数，非人类灵长类动物是药物开发的重要模型。针对非人类灵长类动物抗原的抗体非常少；相反，研究人员通常使用被发现与非人类灵长类动物有交叉反应的抗人抗体。NIH 维护着一个有价值的交叉反应数据库，但其覆盖范围并不完整，尤其是对于不太常见的物种。此外，该数据库仅显示染色的存在与否，并不显示 NHP 物种中染色的细胞群是否与人类不同。我们从食蟹猴 ( Macaca fascicularis )、恒河猴 ( Macaca mulatta )、非洲绿猴 ( Chlorocebus aethiops ) 和橄榄/黄狒狒 ( P apio hamadryas anubis × Papio hamadryas cynocephalus ) 血液中的五种免疫细胞群中筛选了 332 种抗体，从而生成了包含细胞类型特异性的综合交叉反应目录。我们随后使用此目录帮助为其中三种物种和人类创建大型 CyTOF 质谱流式细胞术面板。包含每种抗体原始数据的精选数据集已作为可浏览资源存放在https://immuneatlas.org和https://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z2Z7。
引言：
非人类灵长类动物 (NHP) 与人类相似，是药物开发的重要组成部分。许多关键的免疫学检测，如流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫荧光显微镜，都利用抗体来区分特定细胞类型并量化信号传导部分。很少有抗体是针对非人类灵长类动物抗原产生的；相反，研究人员通常使用与他们正在研究的非人类灵长类动物物种交叉反应的抗人抗体。为了帮助研究人员找到用于 NHP 研究的抗体，美国国立卫生研究院支持了一个非常有价值的数据库，其中包含市售抗体与 13 种 NHP 物种的交叉反应 ( http://www.nhpreagents.org )。该数据库来自制造商和研究人员的报告，通常提供一个简单的“是/否”陈述，说明克隆是否会染色某个物种，偶尔会评论染色强度或特异性。虽然这是一个宝贵的资源，但数据库的覆盖范围有限。例如，在本研究之前，仅在非洲绿猴中评估了 28 种 CD 标记。
此外，除了少数例外，数据库缺乏有关交叉反应抗体所结合的细胞类型的信息，并且已知有许多抗体克隆结合不同物种的不同细胞类型的实例。例如，已知粒细胞和单核细胞标记物的表达在人类和非人类灵长类动物中存在很大差异。NIH 数据库和制造商的数据表报告称，抗人 CD33 克隆 AC104.3E3 与恒河猴和食蟹猴有交叉反应，但我们的实验室和其他实验室确定，在这些物种中，它主要染色粒细胞，而在人类中，它会染色单核细胞和经典树突状细胞。另一个例子是，Fcγ 受体 CD16 存在于人类和乌白眉猴的粒细胞中，但不存在于恒河猴或狒狒中，这可能会影响评估治疗性抗体的动物研究，因为治疗性抗体可能与该 Fcγ 受体结合、通过该受体传递信号并介导内化。另一个例子是 CD56，它在恒河猴的单核细胞中表达，但它是人类的典型 NK 细胞标记物。因此，研究人员必须通过文献综述或实验验证来确认他们使用的每个克隆都染色了目标细胞群。
这里我们展示了灵长类交叉反应数据的广度和深度的扩展。我们从四种 NHP 物种中的每种物种的两个个体的血液中筛选了 332 种单克隆抗体：恒河猴 ( Macaca mulatta )、食蟹猴 ( Macaca fascicularis )、非洲绿猴 ( Chlorcebus aethiops ) 和橄榄/黄狒狒 ( Papio hamadryas anubis × Papio hamadryas cyno-cephalus hybrid)；发现每个物种中有超过 120 个克隆对一个或多个种群进行了染色。此外，我们还加入了复染抗体，使我们能够确定至少五种主要免疫细胞群的染色特异性。将来自 NHP 的数据与我们实验室对人体血液进行的相同筛选进行了比较。最后，我们利用这次筛选的结果创建了第一个针对非洲绿猴、恒河猴和食蟹猴的质谱流式细胞表型分析面板。这些面板可以对非人类灵长类动物和人类血液进行有效的并排比较。所有数据均可在https://immuneatlas.org和https://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z2Z7上公开访问。
结果
复染板和染色条件开发
为了确定这些抗原在不同物种间的特征，我们首先设计了一组复染抗体，这些抗体可以描述所有五个物种中的主要循环免疫细胞类型。该抗体组可以轻松识别粒细胞、B 细胞、T 细胞、NK 细胞和单核细胞/树突状细胞。在除非洲绿猴以外的所有物种中，我们可以根据 CD11b 表达进一步区分单核细胞和树突状细胞。在非洲绿猴中，CD11b（ICRF44）不反应，我们选择不包括替代标记以保持所有物种的技术一致性。
图1：五种复染剂可识别至少五种细胞群。图中显示的是狒狒的代表性染色。通过时间门控以排除伪影后，粒细胞被识别为 CD66abce+/SSC-A+。非粒细胞分为 B 细胞 (CD20+/CD3-)、T 细胞 (CD3+/CD20-)、NK 细胞 (CD7+/CD3-/CD20-) 和单核细胞/树突状细胞 (CD7-/CD3-/CD20-)。*在非洲绿猴以外的物种中，可根据 CD11b 染色分离树突状细胞。
此外，我们策略性地选择了荧光团以保持用于筛选抗体的 PE 通道无渗色/补偿，从而避免技术伪影。
在测试了大量方案后，我们选定了固定和红细胞裂解条件，这些方案以保留抗原染色和有效裂解非人类灵长类动物血液为依据（数据未显示）。用约 0.3% PFA 进行固定足够低，以避免明显的染色损失，并足以最大限度地减少细胞的形态变化，如在流式细胞仪上采集过程中观察到的前向和侧向散射信号变化。使用 VersaLyse 进行酶促裂解对人类和非人类灵长类动物血液都非常有效，而其他方法（如低渗裂解）对非人类灵长类动物血液则不充分或不一致。
抗体反应性筛查
我们建立了定义阳性表达的通用标准，以公正的方式确定抗原表达。如果超过 10% 的细胞的 PE 信号强度大于同一物种和种群中相应同型对照强度的第 95个百分位数，则将抗体克隆归类为与种群具有反应性（表 I）。发现该阈值准确反映了人工分类的结果：我们验证了 14,940 个克隆 × 物种 × 种群结果中的 500 个，同时考虑了报告的染色模式和与同型对照的视觉分离度，并计算出假阳性率为 7.4% 和假阴性率为 1.6%，我们数据的初始准确率为 91%。然后，我们根据需要手动验证和纠正所有不一致的重复和所有在非人类灵长类动物物种中被归类为具有反应性但在人类中不具有反应性的克隆；因此，我们最终的估计准确度超过 91%。该项目的所有数据均已公开，因此研究人员可以通过访问原始数据来独立验证目标抗原的表达。我们总共鉴定出 260、153、129、161 和 147 个克隆，它们分别与人类、猕猴、恒河猴、非洲绿猴和狒狒中的一个或多个种群有反应。
有兴趣评估本研究中抗体的研究人员可访问https://immuneat-las.org或https://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z2Z7查看原始数据，在那里可以比较不同物种之间的相对染色强度和染色分布。在评估染色稀有群体的抗体时，这种审查至关重要——尤其是占我们划定的群体之一的 10% 以下的群体，或表达较弱的群体，这些群体可能被我们应用的表达和染色阈值排除在外。此外，我们鼓励在解释 CD41 和 CD51/CD61 等标记物时要谨慎，这些标记物被列为与所有细胞类型反应，但实际上，根据这些标记物在人类中的已知分布，它们可能染色粘附在其他细胞上的血小板碎片 。还必须记住，由于基因序列、蛋白质结构和翻译后修饰的差异，实际的抗体-抗原特异性可能因物种而异。
表达模式差异的显著例子
如上所述，在恒河猴中，CD33 存在于粒细胞中，而 CD16 则仅限于单核细胞和树突状细胞。在本研究中，我们发现非洲绿猴具有相同的染色模式，尽管 CD33 染色较弱。另一个显着的差异（在观察到的众多特殊表达模式中）是 CD172g（信号调节蛋白 (SIRP) γ，也称为 SIRPβ2）在所检测的所有 NHP 物种中均在 CD11b+ 单核细胞和粒细胞上表达，但不在 T 细胞上表达。相反，在人类中，这种标记物在 T 细胞、一些 B 细胞和一定程度的粒细胞中表达（图 2）。由于它缺乏细胞质信号传导结构域，因此推测 CD172g 通过激活表达 CD47 的细胞并诱导人类、小鼠和大鼠中的 T 细胞迁移和增殖来单向发出信号。因此，我们的发现表明免疫细胞迁移和适应性反应的调节存在很大差异，值得进一步研究。
图2：在所检测的 NHP 物种中，CD172g 在单核细胞和所有粒细胞上表达，但不在 T 细胞上表达。相比之下，CD172g 在人类的所有 T 细胞、粒细胞亚群和 B 细胞亚群上表达（数据未显示）。如文中所述，CD11b 不会均匀地染色 AGM；因此，一些 CD11b 阴性细胞是单核细胞。蓝色：同种型对照，橙色：CD172g。
发现差异的另一个显著例子是，CD2 染色不仅存在于 T 细胞上，而且存在于恒河猴、食蟹猴、非洲绿猴和少量狒狒的 B 细胞上（图 3 ）。CD2 参与粘附、共刺激、抗原识别和潜在分化。在小鼠中，几乎所有循环和骨髓 B 细胞都表达 CD2。Kingma 等人此前报道，只有一小部分（5.74 ±2.46%）正常人外周血 B 细胞表达 CD2，尽管大约 25% 的被调查的 B 细胞肿瘤表达 CD2。我们在人类身上没有观察到 CD2+ B 细胞。因此，B 细胞 CD2 表达似乎在进化过程中已经消失，在最古老的物种（小鼠）中表达最丰富，在恒河猴和非洲绿猴中表达中等，在狒狒中表达较少，在最年轻的物种（人类）中基本上没有表达。有趣的是，该配体在不同物种之间并不保守：在小鼠和大鼠中，CD2 仅与 CD48 结合，而在人类中，它与 CD58 强结合，而与 CD48 仅弱结合，后者也与 CD58 共同表达。
图3：CD2 在 NHP 的 B 细胞上表达。蓝色：CD3+ T 细胞，预计在人类中表达；橙色：CD20+ B 细胞。
CyTOF Panel设计
只要有可能，我们就会对所有物种使用相同的抗体克隆。对于红细胞，我们对人类使用常见标记 CD235a，对 NHP 使用 CD233，而不是对所有物种使用不太常见的 CD233（未找到与 NHP 反应的抗 CD235 克隆）。对于 CD11c，克隆 3.9 仅用于非人类灵长类动物，因为 Bu15 不具有反应性，但据报道 3.9 优先结合活化的 CD11c并需要在染色过程中添加镁作为辅因子 。为了保持一致性，我们在门控分析期间主要使用 CD16 代替 CD11c。对于幼稚 T 细胞和记忆性 T 细胞，我们观察到 CD45RA 染色分布非常广泛，如先前报道的 ，有两个克隆（5H9 和 HI100），很难门控（参见在线数据集）。使用基于 Versa-Lyse 的方法对该标记物的染色效果比使用基于 Triton-X100 的方法更好（参见方法）（未显示数据）。
这里描述的实验对于非洲绿猴 (AGM) 免疫学的发展尤其有价值，因为讨论免疫表型的文献很少，而且 NIH 数据库中仅列出了 28 种反应性抗体。尽管如此，该物种在药物开发（尤其是 SIV 研究）中仍然很重要，并且是国际努力的主题，旨在使其成为通过表型和基因组学最全面表征的 NHP。值得注意的是，由于用于研究的恒河猴短缺，AGM 的使用正在增加 。通常可以使用与恒河猴相同的克隆来处理非洲绿猴，但有几个例外（表 II）。未发现 CD11c 的反应性克隆；相反，我们再次依靠 CD16 来门控单核细胞亚群，并依靠 CD123、CD1c 和 BDCA3 来门控树突状细胞亚群。
这些 CyTOF 抗体组经过彻底滴定以确定每种抗体的最佳染色浓度，然后在每个物种的至少两名供体中重新验证。我们随后与 BioLyph LLC 签订了合同，将每种抗体组冻干并包装数千个一次性颗粒（“LyoSpheres”），以供后续研究使用。这些颗粒解决了蒸发和沉淀等阻碍长期研究的稳定性问题，并消除了移液引起的技术变异性和误差。因此，这些抗体组可用于平行评估物种之间的直系同源群体（图 4）。
图4：对四个物种的血液进行平行门控。CyTOF 质谱流式细胞术面板被开发用于描绘物种间至少 18 个直系同源群体。
抗体筛查(实验方法)
血液收集在肝素钠中，并在收集后 24 小时内进行处理。将 8 至 10 毫升血液轻轻固定，并通过在室温下与 792 µl 16% 多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，宾夕法尼亚州哈特菲尔德；最终浓度约为 0.3%）和 29.6 ml VersaLyse（Beckman Coulter，加利福尼亚州布雷亚）孵育 10 分钟来裂解，然后用 PBS 中的 0.01% BSA（“染色缓冲液”）清洗一次。将细胞悬浮在 6.5 ml 染色缓冲液中，然后与 0.5 ml 人类 TruStain FcX Fc 受体阻断溶液（Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥）孵育 10 分钟。
然后加入五种复染抗体：500 µl CD3 (SP34.2)-Brilliant Violet 421 (BD Biosciences, San Jose, CA)、500 µl CD20 (2H7)-Brilliant Violet 605 (Biolegend)、1000 µl CD66 (TET2)-APC-Vio770 (Miltenyi, San Diego, CA)、500 µl CD11b (ICRF44)-PerCP/ Cy5.5 (Biolegend) 和 500 µl CD7 (M-T701)-APC (BD Biosciences)，最终体积为 10 ml。
后续步骤在自动化平台上进行，包括 Agilent Bravo 96 通道移液机器人、离心机、BioTek ELx405 96 通道抽吸器/分配器和 Thermo Scientific MultiDrop 分配器。使用 MultiDrop 将抗体混合物中的 20 微升细胞分配到 384 孔板的每个孔中。使用制造商推荐的 25 µl 水对 LegendScreen 人 PE 抗体筛选板 (Bioleg-end) 进行再水化。
筛选板由四个 96 孔板组成；从每个孔中将 5 µl 以四分之一的方式转移到单个 384 孔板中。将染色反应在室温下黑暗中孵育 30 分钟，以 2.0 mm 半径的轨道振荡，然后用染色缓冲液清洗三次，并使用 HTS 自动进样器在具有 405、488 和 633 nm 激光器的 BD LSR II 上采集。
使用我们实验室开发的基于网络的高通量细胞计数分析平台对文件进行门控并导出细胞群。每个孔都按时间手动门控以排除由气泡或碎片引起的异常：排除 PE 通道信号随时间不一致的时间区域。然后按照结果部分所述对细胞群进行门控。细胞群门控针对每个物种量身定制；无需针对物种内的单个供体进行定制。其余分析（统计计算、不一致重复分辨率、验证和报告）使用 Mathematica（Wolfram Research，伊利诺伊州香槟市）进行。
CyTOF 质谱流式细胞术
使用市售的聚合物螯合剂（“X8”，Fluidigim，加拿大安大略省万锦市）将纯化的抗体（BioLegend，BD，Beckman Coulter）与稳定的金属同位素结合。使用 Chow 和 Hedley 的方法裂解和制备全血，该方法比前面描述的 Versalyse 方法更适合高通量、基于板的检测。简而言之，我们将 330 µl 血液与 55 µl 16% PFA 混合，孵育 10 分钟，然后加入 1,615 µl 0.127% Triton-X100（Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）的 PBS（最终浓度为 0.1% Triton）并孵育 30 分钟。然后我们洗涤，用金属标记抗体染色 30 分钟，然后再次洗涤。用 1.5% 多聚甲醛对细胞进行第二次固定，并用铱嵌入剂 (Fluidigm) 进行 DNA 染色，然后在 CyTOF 2 质谱流式细胞仪 (Fluidigm) 上获取。
