VCP50-9 健康犬血小板功能检测样本的延长保存时间

https://doi.org/10.1111/vcp.13226

尽管与劳动密集型光学聚集度测定法相比，上述检测是颇具吸引力的替代方法，但仍存在重大局限性。具体而言，由于血小板功能会随时间推移而下降，因此需要在采集后几分钟到几小时内对新鲜全血进行检测；这是临床检测的一大障碍，限制了只有拥有适当仪器、试剂供应和工作人员的专门中心才能进行检测。为了解决这一限制，开发了 AGGFix（英国诺丁汉的血小板服务公司 [以前称为血小板解决方案]）。它是一种专利解决方案，可在暴露于激动剂后固定和稳定全血中的血小板聚集体，从而允许使用流式细胞术通过单个血小板计数进行延迟和远程血小板功能检测。在人类中，血小板聚集体最多可稳定 9 天，但尚未报道 AGGFix 在兽医学中的使用，也没有评估其与标准血液学分析仪一起使用的情况，与流式细胞术相比，后者可以提高可用性。因此，本研究的一个目标是调查 AGGFix 是否可以与 PW 一起使用来保存单个和聚集的血小板，以便使用标准血液分析仪进行延迟测试。我们假设 AGGFix 可以稳定血小板聚集长达 7 天，并且适合使用标准血液分析仪对健康狗进行 PW 延迟血小板功能测试。

尽管血液样本中的血小板功能会随着时间的推移而下降，但在柠檬酸盐基防腐剂溶液中储存长达 7 天的富含犬血小板的血液制品中仍能保持一些血小板功能。因此，某些血小板功能测试的柠檬酸盐样本可以储存数小时至数天，以便于延迟和远程测试。因此，我们研究的另外两个目标是调查在柠檬酸盐中储存是否有助于使用 PW 和 PFA-200 进行测试，并调查冷藏和时间对这些测试结果的影响。我们假设储存在室温下的柠檬酸盐全血适合使用 PW 进行延迟的当天测试，而冷藏的柠檬酸盐全血适合使用 PW 在 24 和 48 小时进行延迟测试。最后，我们假设冷藏全血适合在采集后 24 和 48 小时进行 PFA-200 测试。零假设是新鲜样品和用各种方法储存的样品的 PW 和 PFA-200 结果之间没有差异。

血小板功能检测

除非另有说明，否则冷藏样品在分析前在室温下被动加热 15-30 分钟。并使用平均值对血小板功能随时间的变化进行统计分析。血小板计数使用相同的光学血液分析仪（ADVIA 2120i，西门子，德国慕尼黑）进行。

4 讨论

在本研究中，我们评估了不同储存方法对特定血小板功能测试的影响，以确定是否可以对犬血样进行延迟血小板功能测试。我们的假设是血小板功能在储存过程中不会下降，因此测试结果不会随着时间的推移而发生变化。

我们检查了按照制造商的指导使用时（即采集后立即将样品分配到激动剂管中并在 10 分钟内分析样品），将柠檬酸全血在室温下保存 3-4 小时并与 PW 一起使用是否会产生与天然 PW 相似的结果。天然 PW %Aggs 和 T0 CitPW %Aggs 之间没有差异。这与一项针对人类的研究一致，该研究使用阻抗聚集法显示在柠檬酸盐中长达 4 小时内的稳定聚集反应。因此，保存 4 小时并与 PW 一起使用的柠檬酸全血是时间敏感的天然 PW 的可靠替代品，并且可以在临床环境中轻松实施。当柠檬酸全血冷藏时，在 24 和 48 小时时发现 CitPW %Aggs 与天然 PW %Aggs 之间存在显著差异——除了 T1 时的一只狗和 T2 时的两只狗外，所有狗的 %Aggs 都有所下降。然而，大多数狗的 Agg 含量维持在 %≥70%，这在我们实验室中被视为正常。具体而言，在 T0 时，除一只狗外，其他狗的 Agg 含量均≥70%，而在 T1 时，两只狗的 Agg 含量略有下降，分别为 64% 和 65%，还有两只狗的 Agg 含量较低，分别为 20% 和 55%。后两只狗的 Native PW 结果最弱。有趣的是，所有四只 Aggs <70% 的狗的 Agg 含量在 T2 时都高于 T1 时，只有一只 Native Aggs <70% 的狗的 T2 值也 <70%。最重要的是，为了检测氯吡格雷效应，没有狗的 Aggs 含量 <20%。基于这些结果，使用储存的柠檬酸血液进行延迟 PW 值得进一步研究。

我们还检查了 AGGFix 溶液是否能保存单个未聚集的血小板和血小板聚集体，以便使用光学血液学分析仪进行可靠的血小板计数。与柠檬酸盐储存的结果类似，Native 和 T0 AGGFix PW %Aggs 之间没有差异。与柠檬酸盐的结果相反，与 Native PW 和 T0 AGGFix %Aggs 相比，存储在 AGGFix 溶液中的 T1 的 %Agg 有所增加，而 T7 样本的 %Agg 没有减少。在一只狗中，T7 AGGFix PW 的 %Agg 分别从 Native、AGGFix T0 和 AGGFix T1 PW 的 79%、73% 和 71% 下降到 0%，这可能是由于 AGGFix EDTA 溶液中 T7 时未聚集的血小板保存不足所致。然而，尚不清楚 AGGFix ADP 溶液中血小板计数低是由于激动剂诱导的血小板聚集体的保存还是由于 AGGFix EDTA 和 ADP 溶液中血小板保存不足。基于这些结果，AGGFix 可能适用于储存长达 7 天的 PW。

虽然本研究的结果与之前的储存研究的结果一致，但其中大多数使用 PRP 光学聚集度测定法或全血阻抗聚集度测定法来测量聚集。据作者所知，这些储存变量对 PW 的影响以前尚未评估过。此外，尚未有关于储存变量对 AGGFix 溶液中保存的犬血小板影响的研究报道。据称，在人类中使用 AGGFix 来稳定流式细胞术中的血小板聚集体可保存聚集体长达 9 天。在聚集体稳定性方面，狗的血小板生理可能与人类不同。

最后，我们检查了冷藏柠檬酸血液是否适合用 PFA-200 仪器进行延迟测量。PFA-200 CT 值在 T1 和 T2 时均有显著差异，所有狗的个体 P2Y CT 均增加，T1 时 12 只狗中的 7 只和 T2 时所有狗的个体 CADP CT 均增加。相应地，PFA-200 的反应分类变化名义上比 CitPW 和 AGGFix PW 的变化更大。虽然反应类别没有统计学上的显著变化，但这项研究可能没有足够的说服力。一小部分动物的反应类别发生变化仍可能对药物监测具有临床意义。P2Y 的流动阻塞和无闭合（CT > 300 秒）错误也有名义上的增加。这两种错误都可能是由于止血、溶血和气泡的激活而发生的。在正常犬中，它们通常是分析前错误的征兆，但在所有物种的正常受试者中偶尔也会遇到，而这些物种的血液采集没有明显的困难。如果发生任何错误，建议进行重复测定并将结果 CT 解释为准确的。无闭合是比血流阻塞更令人担忧的错误，因为无闭合也是氯吡格雷治疗的目标结果。在 T0 时两次 P2Y 重复均无闭合的一只狗（狗 9）有严重的血小板凝集，这可能是由于血小板衰竭导致无闭合。这强调了在进行 PFA-200 分析时获取血像图的重要性。这只狗在 T1 和 T2 时也出现血流阻塞、无闭合或血凝块。然而，在 T1 时只有一个无闭合 P2Y 结果的两只狗和在 T2 时两次重复均无闭合的两只狗没有血小板凝集的迹象。这些发现表明，样品不应储存 48 小时进行 P2Y 检测，如果储存 24 小时，则必须重复进行检测。在狗和人类中都已证明，P2Y 测试不仅对氯吡格雷的影响更敏感，但也有可能它对血小板生理学的所有变化更敏感，更适合用于新鲜检测。CADP 测试的结果更令人鼓舞，因为在一次 T2 重复中，第 9 条狗的血小板严重凝结，结果只出现了储存样本的无闭合结果。然而，由于 CT 的延长，应该为每天生成不同的 CT 参考间隔，以解释血小板生理学和反应的变化。根据我们的结果，考虑到建立参考间隔所需的成本和精力，在 24 小时（T1）为 CADP 测试建立参考间隔将是最有益的。CT 的 CV 和 ICC 仅为中等，但这些计算中包含了 300 秒的无闭合误差值，并且如果有大量没有无闭合结果的重复值，CV 和 ICC 会改善。

样本保存在柠檬酸盐中，因为这是制造商推荐的 PFA-200 抗凝剂，柠檬酸盐包含在 PW 激动剂混合物中，并且兽医诊所通常备有柠檬酸盐管。然而，将全血保存在柠檬酸盐中可能会加剧血小板功能的衰减，从而导致观察到 PW %Agg 下降和 PFA-200 CT 上升。多项血小板聚集研究发现，与其他抗凝剂相比，将血液保存在柠檬酸盐中时，聚集反应显著降低。此外，在一项使用PFA - 100检查闭合时间的研究中，与柠檬酸盐相比，使用水蛭素的灵敏度更高。在另一项研究中，与天然样本相比，柠檬酸全血中的血小板粘附率较低。柠檬酸盐样品中的钙结合被认为会钝化血小板活化途径。柠檬酸盐还可以减少扩增聚集反应所需因子的分泌。多项研究表明，柠檬酸盐储存的血液具有更高的血小板活化水平（以 P-选择素和膜联蛋白 V 结合来衡量），并且观察到自发性微聚集体形成增加。本研究中 7只狗随时间的推移出现自发性聚集增加的情况与先前的研究结果一致。血小板在柠檬酸盐中更容易被激活的原因尚不完全清楚。一个考虑因素是体内缺乏止血调节剂，导致血小板更容易被激活，并且血小板本身会分泌激动剂。反过来，这可能导致血小板耗竭，从而减弱对 ADP 的进一步反应，并导致 ADP 受体下调。

在我们的研究中，血小板活化的初始增加可能促进了T0 CitPW 反应，这与天然 PW 反应相同，但随后逐渐的血小板耗竭减弱了 CitPW %Agg 和 PFA-200 CT 的一些 T1 和 T2 反应。在柠檬酸血液中测量自发聚集，以帮助确定其在使用柠檬酸血液时对 PW 中聚集反应的贡献。在所有时间点的所有狗中，对 ADP 的反应导致 %Agg 高于单独的自发聚集，这是可以理解的，因为 ADP（PW 管中为 20 μM）是一种强效的血小板激动剂。

用于 T0 测试的柠檬酸盐样品在室温下保存，而用于 T1 和 T2 测试的样品则冷藏。储存温度和时间的影响可能导致血小板功能增强和减弱。全血冷藏通过诱导血小板活化和形成微聚集体降低了人体血小板聚集反应，类似于柠檬酸盐，这会导致血小板衰竭，并在最初增强止血作用后随着时间的推移而降低反应。储存时间似乎也对人体血小板聚集反应有类似的影响。研究研究了储存时间对 PFA-100 封闭时间的影响，发现无论使用何种抗凝剂，在室温下 24 小时后，封闭时间都会延长。使用全血也可能增加血小板活化，因为红细胞和其他血浆成分有助于体内血小板活化和聚集。这些发现可以解释本研究中最初稳定然后下降的 %Agg 和随着时间的推移 CT 增加的原因。然而，CitPW %Agg 比 PFA-200 CT 更稳定，这可能是因为 PW 仅测量血小板聚集，而 PFA-200 测量血小板聚集和粘附，后者受储存的影响更大。也可能是冷藏和时间增强了某些狗的自发聚集。

最后，我们观察到，与所有其他 PW %Agg 测量值相比，AGGFix 中的 %Agg 在 T1 时有所增加，其中三只狗的聚集率达到 100%。虽然冷藏可能像柠檬酸盐一样存在聚集效应，并且如下所述，测量偏差可能导致了这一发现，但 AGGFix 含有甲醛，甲醛可能充当血小板激动剂，可能对维持聚集有影响。

如前所述，AGGFix 旨在用于流式细胞术单血小板计数。为了使血小板功能测试得到广泛应用，我们选择使用经过验证的市售激动剂（即 PW）刺激血小板聚集，并使用血液学分析仪计数血小板。添加 AGGFix 溶液 A 可产生 1:3 的稀释度，然后用 AGGFix 溶液 B 进一步将该混合物稀释 1:9。这导致AGGFix EDTA 样品的血小板计数为 2-47 × 10 9 /L，AGGFix ADP 样品的血小板计数为 0-3 × 10 9 /L，低于 ADVIA 2021i 血小板计数的性能规格（5-3500 × 10 9 /L）。据报道，ADVIA 2120i 在血小板减少症患者的血小板计数方面具有很高的准确性和精确度。然而，一项研究发现，它倾向于高估较低值的血小板计数。但是，如果高估了 AGGFix A/B 样本中的血小板计数，则更有可能导致与 Native %Agg 相比 %Agg 错误地降低，而不是观察到的增加。AGGFix EDTA 和 AGGFix ADP 血小板计数的精度足以检测到激动剂作用，并且 Native 和 AGGFix PW 的 %Agg 之间没有差异。基于 ADVIA 2120 内部质量控制材料的血小板计数报告的 CV 分别为低、正常和高血小板浓度的 4.11%、2.17% 和 2.27%。没有适用于狗的等效数据。在一份使用第一代 ADVIA 120 在 25 天内对犬血小板计数进行重复分析的报告中，总体 CV 为 12.23%。我们研究中计算出的 CV 相似，柠檬酸盐 ADP 和 AGGFix ADP 除外。柠檬酸盐 ADP 血小板计数的 CV 较高可能反映了柠檬酸盐血小板计数与 EDTA 相比精度较低，并且可能反映了重复运行之间血小板聚集的快速变化，因为在优化研究期间，注意到血小板解聚非常快（数据未显示）。AGGFix ADP 血小板计数的 CV 较高反映了非常低的数值，并不反映 0 到 3 × 10 9 /L 之间始终严格的测量值，除一例外，计数相差从未超过 1 × 10 9 /L。

这项研究有几个局限性。首先，尽管所有狗在临床上都是正常的，并且都进行了无损伤性静脉穿刺并不间断地采集样本，但 13 只狗中有 7 只出现了 EDTA 样本中不同程度的血小板凝集和/或在柠檬酸盐样本的某个时间点出现凝血。虽然这并没有完全排除任何狗，但它强调了无损伤性静脉穿刺的重要性，特别是对于要冷藏以进行 PFA-200 分析的柠檬酸盐样本。狗 9 的血小板凝集严重，这可能是导致 Native PW 结果为 55%Agg 的低结果，并且在所有时间点均出现 PFA-200 流阻塞和/或 CT > 300 s 的原因。这只狗随后的静脉穿刺也产生了血小板凝集的样本，尽管这只狗 3 年来一直保持临床正常。狗 2 的血小板视觉上较小，血小板压积低；这只狗的 Native %Agg 是第二低的，为 79%，所有后续 %Aggs 都较低，而 T7 AGGFix %Agg 为 0%。在第一次测量 3 年后重复了 AGGFix PW，T7 AGGFix %Agg 为 20%，再次出现低值是因为 AGGFix EDTA 血小板计数下降。因此，2 号和 9 号狗虽然临床上正常，但可能具有天生不同的血小板聚集反应。

其次，全血的储存和血小板功能测试不能完全复制体内条件，这些测试的结果可能与体内反应不相同，这是体外血小板功能测试普遍存在的一个公认问题。大多数建议进行血小板功能测试的动物同时患有疾病，正在接受其他药物治疗，在许多情况下，还要接受抗血小板治疗。健康狗的结果可能不适用于其他变量可能影响血小板功能的临床病例。第三，由于需要的血液量过多，因此无法包括用于研究各种储存温度和抗凝剂选择的额外样本；然而，这将有助于更好地了解每个变量对血小板功能测试结果的影响。第四，没有进行阻抗或光透射聚集度测定等血小板功能参考方法。最后，这项研究包括了少数狗，可能对某些影响没有足够的动力。众所周知，狗的血小板功能测试存在高度的生物变异性（可能在狗 2 和 9 中看到过）。对大量狗进行测试可能会导致与本地测试结果在统计上存在差异的结果。

将血液样本储存在柠檬酸盐中，可使用 PW 和 PFA-200 CADP 试剂盒分别在采集后 48 小时和 24 小时内对狗进行延迟血小板功能测试，而将血液样本储存在 AGGFix 中，可使用 PW 进行延迟血小板功能测试长达 7 天。尽管血小板功能在储存过程中会减弱，但血小板功能仍得到充分保留，值得进一步研究以用于临床。