摘要
背景
关于非人类灵长类动物 (NHP) 外周血中心肌肌钙蛋白 (cTn) 浓度的信息很少。关于口服或静脉 (iv) 给药受限的猴子中 cTn 浓度的信息就更少了。
目标
这些研究的目的是：(1) 确定静息食蟹猴的心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度并研究 cTnI 浓度随时间的生物学变化，(2) 确定接受假口服给药的受限制猴子的 cTnI 变化，以及 (3) 确定接受假静脉给药的受限制 NHP 的 cTnI 变化。
方法
仅供研究使用 Erenna cTnI 超敏免疫测定法（基于单分子计数技术）用于在雄性食蟹猴静息状态下以及假口服和静脉注射后测定其血清 cTnI 浓度的纵向研究。在研究前给动物插管，并通过自动采样装置采集血液样本，以减少研究期间对动物的干扰。
结果
静息猴子的 cTnI 浓度相对较低且恒定，范围为 0.2 至 9.6 pg/mL（平均值 = 2.5 pg/mL），24 小时内变化很小。接受假口服给药的动物 cTnI 浓度也较低，与静息值变化不大。几只因静脉注射而受到限制的动物 cTnI 浓度短暂升高（~5–25 pg/mL），注射后 1 至 3 小时内迅速消退。
结论
这项纵向研究的结果提供的信息可能对于区分动物处理的影响和正在开发的药物的临床前毒理学研究中与化合物相关影响相关的影响很重要。
介绍
在药物安全性研究中，外周血中的心肌肌钙蛋白 (cTn) 浓度被用作大鼠、狗和非人类灵长类动物 (NHP) 心脏损伤的生物标志物。欧洲心脏病学会和美国心脏病学会均支持在人体临床试验中使用该标志物。此外， cTn 被认定为检测心肌细胞膜完整性破坏的最有效的转化安全性生物标志物。
尽管在药物安全性研究中，cTn 在大鼠和狗中被广泛使用，但人们对 NHP 中的静息 cTn 浓度以及 cTn 对各种刺激的变化了解甚少。美国食品药品管理局的生物标志物资格审查小组已批准使用心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 和心脏肌钙蛋白 T (cTnT) 血清或血浆浓度作为大鼠和狗某些类型毒性研究中的安全性生物标志物，但拒绝建议在 NHP 中使用 cTn，理由是“发表的数据很少，结果不一致”。因此，生物标志物资格审查小组无法定义在 NHP 中使用此生物标志物的适当环境。建议自愿收集涉及 NHP 的药物安全性研究中的 cTn 数据，以改进未来决策的数据库。本文描述的研究增加了有关在临床前药物安全性研究中可能出现的条件下 NHP 中 cTnI 行为的额外信息。
显然，参与评估在研药物安全性的科学家需要更多有关 NHP 中 cTn 浓度的信息。超灵敏 cTnI 测量的新方法使得每小时纵向跟踪动物以评估 cTnI 浓度的生物变异性成为可能。这些检测方法使科学家能够量化基线 cTn 浓度并记录对刺激反应的细微变化，这可能对于优化用于预测在研药物心脏毒性的研究中的研究设计和结果解释很重要。
这些纵向研究的目的是利用自动血液采集系统结合超灵敏的 cTnI 测量方法来 (1) 测定静息食蟹猴的 cTnI 浓度并研究猴 cTnI 浓度随时间的生物学变化，(2) 确定接受假口服给药的受限制猴的 cTnI 浓度变化，以及 (3) 确定接受假静脉注射的受限制猴的 cTnI 浓度变化。
材料和方法
机构合规声明
所有动物研究均符合美国农业部 (USDA) 的《动物福利法》；《实验动物护理和使用指南》；以及美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室。礼来公司将研究承包给 Covance Inc.（美国印第安纳州格林菲尔德）。Covance 格林菲尔德实验室的动物设施获得了国际实验室动物护理评估和认可协会 (AAALAC) 的认可。研究得到了礼来公司研究设计和批准委员会以及 Covance 动物护理和使用委员会的批准。所有程序都旨在避免或尽量减少动物的不适、痛苦和疼痛。
动物
这些研究使用了十只雄性毛里求斯猕猴灵长类动物，年龄在 4.1 至 6.4 岁之间，体重在 3.9 至 6.3 公斤之间。动物来自 Covance Research Products（美国德克萨斯州艾丽斯）和 Charles River Laboratories（美国德克萨斯州休斯顿）。动物在 Covance Greenfield 站点接收和饲养，并按照现行标准操作程序进行所有饲养和适应/检疫程序，这些非终点研究之前、期间和结束时均如此。
动物的选择
这些动物是从 Covance Greenfield 饲养的动物群中任意挑选出来的，通过手术插入导管，并在研究开始前至少恢复 14 天。在研究期间，动物以 Teklad #2055 饮食（Harlan Laboratories, Inc，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）喂养，并在印第安纳州 Greenfield 提供水，除了指定的禁食时间外，可随意饮用。动物单独饲养，光照周期为 12 小时光照，12 小时黑暗，温度设定为 72°F ± 8°F，相对湿度为 30–70%。所有动物都放置了血管接入端口，以最少的操作和约束获取血液。
动物健康
这些研究中使用的动物均由经过认证的实验室动物兽医进行身体检查，并每月进行全血细胞计数 (CBC)、血清化学小组和尿液分析。
研究细节
结果
研究#1：静息猴子的心脏肌钙蛋白 I 浓度
有 8 只动物的数据集可用。有两只动物被排除在研究之外，因为导管管线扭结或凝结阻碍了血液采集。在静息动物中，cTnI 浓度相对较低且恒定，范围为 0.2 至 9.6 pg/mL（平均值 = 2.5 pg/mL），动物之间的差异很小（图 1 A、B 和2）。本研究中使用的插管动物的 cTnI 浓度值与之前使用 Erenna 免疫测定系统测定的未插管雄性食蟹猴的 cTnI 浓度值相似。
( A ) 静息猴和接受口服管饲或静脉注射的猴的心肌肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度测量箱线图。静息猴 (Resting, n = 8)、接受口服管饲 (Oral Gavage, n = 10) 或静脉注射 (IV Dosing, n = 9) 的 猴的心肌肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度的队列内比较 。( B ) 静息猴和接受口服管饲或静脉注射的猴的心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度的箱线图（带对数刻度）。静息猴 (Resting, n = 8)、接受口服管饲 (Oral Gavage, n = 10) 或静脉注射 (IV Dosing, n = 9) 的猴的心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度的队列内比较。
图2 纵向测量静息猴和接受口服管饲或静脉注射的猴的心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度。静息猴和接受口服管饲或静脉注射的猕猴每小时测量一次 cTnI 浓度，共 24 小时。红线表示口服管饲或静脉注射的时间。每条彩色线代表来自单个非人类灵长类动物的 cTnI 数据。
研究 #2：接受假口服给药的猴子的心脏肌钙蛋白 I 浓度
数据集来自 10 只动物。10 只被束缚并接受口服假药的动物中有 8 只 cTnI 浓度较低，与静息动物的数值几乎没有变化（图 1 A、B）。2 只接受口服假药的猴子的 cTnI 浓度相对增加，短暂增加约 60 或 215 pg/mL，并在 24 小时内消退（图 2）。这些结果遵循与之前对接受口服假药的 Sprague-Dawley 大鼠 cTnI 浓度的研究相似的模式，其中大多数动物的 cTnI 浓度几乎没有变化或没有变化，而少数异常值的 cTnI 浓度增加。
研究#3：接受静脉推注的猴子的心脏肌钙蛋白I浓度
有 9 只动物的数据集可用。有 1 只动物因导管扭结或凝结阻碍血液采集而被排除在研究之外。在 9 只受到约束并接受静脉推注的动物中，有 5 只在监测期间 cTnI 浓度相对较低且恒定。这 5 只猴子的 cTnI 浓度值与休息动物的 cTnI 浓度相似（图 1 A、B）。在 9 只受到约束接受静脉注射的动物中，有 4 只的 cTnI 浓度出现小幅、短暂性升高（≤ 50 pg/mL），但在注射后 1-3 小时内迅速消退（图 2）。后者中有些猴子的 cTnI 浓度出现小幅升高，但在 24 小时监测期内稍后消退，并且与静脉推注无立即关联。
统计摘要
统计分析包括了每组所有可用动物的数据。重复测量协方差分析的结果表明，除第 13 小时外，与休息组相比，口服管饲和静脉注射给药组之间没有统计学上的显著差异。第 13 小时口服管饲和休息组之间的 未调整t检验P值为 0.041（图3 A）。这种影响可能是偶然的。经过多重调整后，影响并不显著。由于口服管饲和静脉注射给药组中各有 2 只动物的 cTnI 浓度异常高，因此还进行了敏感性分析，通过排除这些极值来评估口服管饲和静脉注射给药的影响。该分析的结果还显示，除第 20 小时外，没有统计学上的显著影响。巧合的是，比较口服管饲和休息猴子时，第 20 小时的未调整P值为 0.041（图 3 B）。这种统计学上显著的影响会随着多重性调整而消失。总之，分析结果表明，即使存在少数极高浓度，口服管饲和静脉给药对平均 cTnI 浓度没有影响。
( A ) 纵向表示所有休息猴和接受口服管饲或静脉注射的猴的平均心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度和标准误差。显示了每个治疗组在每个时间点的平均 cTnI 浓度。* = P < .05。( B ) 纵向表示所有休息猴和接受口服管饲或静脉注射的猴的平均心脏肌钙蛋白 I (cTnI) 浓度和标准误差的对数变换，排除极值。显示了每个治疗组的平均值和标准误差，排除了 2 只来自口服管饲的具有极值的猴子。* = P < .05。
讨论
有许多检测方法可以测量实验动物的 cTn，包括许多用于定量 cTnI 的市售检测方法，但只有少数方法可以测量 cTnT。我们在研究中选择了一种超灵敏的检测方法来测量 cTnI 浓度，因为它可以量化非常少量血清或血浆样本中的 cTnI 浓度，并且在人和实验动物中的分析阈值 < 1 ng/L，低于临床前研究中使用的许多自动化系统的定量下限。
这些研究中使用的自动采血装置使我们能够纵向采集静息猴子和接受假口服或静脉注射的猴子的血液样本，这些猴子的条件与药物安全性研究中可能发生的条件相似。所采用的超灵敏 cTnI 浓度测定方法以前曾用于测定健康人和心肌梗死后心脏损伤患者的 cTnI 浓度和生物学变异性。我们小组已使用这些技术评估健康大鼠的静息 cTnI 浓度，并确定大鼠对口服给药和模拟运输的反应。
随着有关 cTn 在人类和兽医学中的应用的文献数量不断增加，研究人员开发和利用了新的、更灵敏的诊断技术，关于我们对这种生物标志物在诊断医学和基础科学研究中的价值的理解，一些重要的概念也得到了发展。超灵敏或高灵敏 cTn 检测已用于显示健康人类和动物血液中 cTn 浓度较低。健康人和动物血液中 cTn 浓度较低可能反映的是生理状况而不是病理状况，这一概念相对较新。
有充分的证据表明，心肌肌钙蛋白可能在心脏损伤期间释放，从而导致患有心脏损伤的人和动物外周血心肌肌钙蛋白浓度升高。当使用高灵敏度心肌肌钙蛋白检测方法测量时，心肌肌钙蛋白浓度的轻微升高可能是由人类几种轻微的非心脏疾病引起的。最近，一项研究表明，心肌肌钙蛋白可能通过生理机制释放到人体血液中，而不仅仅是在病理疾病过程中。我们的数据还表明，生理机制，如与束缚和口服或静脉注射相关的压力或兴奋，也可能导致健康 NHP 中心肌肌钙蛋白 I 浓度轻微、短暂地增加。
本实验的研究结果首次提供了静息猕猴和口服管饲或静脉注射猕猴的纵向 cTnI 浓度报告——这些情况可能出现在临床前毒理学研究中。这些研究的结果表明，了解分析前变量对于准确解释涉及猕猴的临床前毒理学研究中的 cTnI 数据至关重要。
