T 细胞癌症治疗需要 CD40-CD40L 激活TNF和诱导型NOS2产生树突状细胞

Highlights

有效的癌症免疫疗法需要克服免疫抑制性肿瘤微环境。我们发现，肿瘤浸润性髓系细胞局部产生一氧化氮 (NO) 对于过继转移的 CD8(+) 细胞毒性 T 细胞破坏肿瘤非常重要。这些髓系细胞在表型上类似于诱导型一氧化氮合酶 (NOS2) 和肿瘤坏死因子 (TNF) 产生的树突状细胞 (DC) 或 Tip-DC。免疫抑制性集落刺激因子 1 受体 (CSF-1R) 依赖性精氨酸酶 1(+) 髓系细胞的消耗增强了 NO 依赖性肿瘤杀伤力。通过 NOS2 消除肿瘤需要 CD40-CD40L 通路。我们还发现结直肠癌患者的生存率与其肿瘤中的 NOS2、CD40 和 TNF 表达之间存在很强的相关性。我们的研究结果确定了一个促肿瘤因子网络，可以针对这些因子来增强癌症免疫疗法。

使用选定的抗体来阻断免疫检查点信号分子（如 CTLA-4、PD-1 或 PD-L1 或它们的组合）的免疫疗法可激活肿瘤基质内的肿瘤特异性 CD8 + T 淋巴细胞，在某些情况下可导致癌症根除（ Page 等，2014；Topalian 等，2015）。使用针对肿瘤抗原的 CD4 +或 CD8 + T 淋巴细胞的过继细胞疗法 (ACT) 也是一种治疗癌症患者的新兴方法 ( Rosenberg and Restifo, 2015 )。由于对肿瘤微环境中细胞和分子相互作用的理解不完全，阻碍了 ACT 后实现最佳疗效的进展。例如，虽然 T 细胞受体 (TCR) 对靶抗原的亲和力有助于 ACT 疗效，但靶肽对呈递的 MHC I 类 (MHCI) 分子的亲和力更为重要 ( Arina and Bronte, 2015 )。相对较高的 MHCI-肽复合物结合亲和力（小于 10 nM）是 ACT 后肿瘤根除的必要条件（Engels 等人，2013 年；Robbins 等人，2013 年）。以具有最高 MHCI 亲和力的肿瘤特异性新抗原为靶点可能是实现最佳 ACT 的基本要求。

大多数患者的免疫抑制肿瘤环境限制了有效的免疫疗法。具有抗肿瘤潜力的 T 细胞的局部免疫抑制由单核吞噬细胞系统的细胞（如髓系抑制细胞 (MDSC) 和肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)）调控（Gabrilovich 等人，2012 年；Ugel 等人，2015 年）。了解免疫抑制环境如何发展和持续是利用免疫治疗策略的关键。

肿瘤相关髓系细胞通过重叠和冗余途径抑制抗肿瘤 T 细胞反应。肿瘤微环境中的一个关键抑制途径涉及通过两种酶的调节表达来代谢精氨酸：精氨酸酶 1（ARG1，由ARG1编码）水解精氨酸，而一氧化氮合酶 2（NOS2，也称为诱导型 NOS 或 iNOS，由NOS2编码）从精氨酸和氧气中生成一氧化氮 (NO)（Colegio 等人，2014 年；Gabrilovich 等人，2012 年；Ginhoux 等人，2015 年；Marigo 等人，2010 年；Ugel 等人，2015 年）。在癌症中，ARG1、NOS2 及其反应产物在促进或控制癌症方面的确切作用仍存在争议。例如，在人类乳腺癌中，NOS2 增多与不良临床结果相关 ( Glynn et al., 2010 )。相比之下，局部低剂量伽马射线照射会“重新编程”巨噬细胞以释放 NO，支持 Th1 反应和 CD8 + T 淋巴细胞 ( Klug et al., 2013 )。人类癌症的照射也会导致局部 NOS2 +巨噬细胞积聚以及 CD4 +和 CD8 + T 细胞浸润增加( Klug et al., 2013 )。NOS2 对促进或抑制肿瘤的净贡献可能取决于上调 NOS2 的细胞类型和组织微环境中达到的 NO 浓度。ARG1 在一定程度上通过局部消耗精氨酸发挥免疫抑制作用，限制其在 Th2 和 Th1 主导感染中对生长中的 T 细胞的利用 ( Duque-Correa 等人，2014 年；Pesce 等人，2009 年)。ARG1 还可以与 NOS2 竞争 L-精氨酸，从而限制活化髓系细胞产生 NO 的整体能力 ( Bronte 和 Zanovello，2005 年；El Kasmi 等人，2008 年)。总体而言，ARG1、NOS2 和 NO 的确切作用仍不清楚。

尽管 MDSC 和 TAM 创造了免疫抑制环境，但某些 ACT 方案确实可以诱导肿瘤根除。在对 ACT 有反应的肿瘤中，肿瘤浸润性髓系细胞有三种可能的结果：消除；转变为更具促炎性和抑制性更低的表型；或没有消除或可检测到的表型变化（Arina and Bronte，2015 年）。产生抗癌免疫反应的关键步骤是肿瘤抗原在引流淋巴结中被吸收并呈递给 T 细胞，从而引发效应 CD8 +和 CD4 + T 细胞的启动和激活（Chen and Mellman，2013 年）。在这里，我们研究了靶向具有高 MHCI 亲和力的肿瘤特异性抗原的 CD8 + T 细胞的过继转移如何在免疫抑制肿瘤微环境中促进这一过程。

尽管人们对 ARG1 和 NOS2 在癌症中的作用进行了大量的猜测，但似乎还没有研究使用遗传方法来区分它们在相同环境中的相对作用。为了测量 NOS2 和 ARG1 的潜在促肿瘤和抗肿瘤作用，我们专注于单基因和双基因敲除 (KO) 小鼠，其中单独使用整个动物Nos2突变或与巨噬细胞特异性Arg1缺陷结合使用（ El Kasmi 等人，2008 年）。我们使用了一种系统，其中肿瘤在针对Nos2、Arg1或两者进行遗传操作的宿主背景下表达确定的抗原（卵清蛋白，以下简称 OVA） 。当我们将 OVA 特异性 T 细胞转移到 EG7 肿瘤小鼠体内时，我们发现肿瘤浸润 CD11b +细胞对抗原刺激的 CD8 + T 细胞的免疫抑制能力在癌症进展过程中增加，并且这种影响几乎完全被 NOS2 的缺失所消除（图 1D ARG1 部分与 NOS2 协同抑制 T 细胞增殖和细胞毒性，但仅在后期肿瘤较大时才起作用（图 1D和图 S1C）。

为了测试宿主骨髓 ARG1 和 NOS2 对细胞免疫治疗结果的影响，我们将体外激活的、同源标记的 OVA 特异性 CD8 + T 细胞过继转移到缺乏 NOS2、ARG1 或两者的 EG7 肿瘤小鼠中（图 S1D）。OVA 具有高亲和力，可用作重现针对非自身突变表位的治疗性抗肿瘤免疫反应的模型（Gubin 等人，2014 年；Kreiter 等人，2015 年）。与 WT 小鼠相比，在Nos2 −/−小鼠中回收的OVA 特异性 CD8 + CD45.1 + T 细胞百分比更高（图 1E, F) 与结果一致图 1D其中 NOS2 是抑制 T 细胞增殖所必需的。与 WT 对照组相比，转移的 T 细胞在Nos2 −/−小鼠中也产生了干扰素 (IFN)-γ（图 1E, F)。尽管与对照组相比， Nos2 −/−小鼠中抗原特异性 CD8 + T 细胞有所扩增，但宿主 NOS2 消融降低了转移 T 细胞的治疗效果（无论是否同时进行 ARG1 消融）（图 1G）因此，NOS2 的髓系表达会抑制 T 细胞增殖和 IFN-γ 的产生，但对于这些 T 细胞的抗肿瘤功效仍然很重要。

在与上文相同的环境下 (图 S1D )，消除 ARG1 可提高 ACT 的疗效并增加生存率。鉴于 ARG1 与 NOS2 竞争精氨酸，而 ARG1 的缺失会导致髓系细胞产生更多的 NO ( El Kasmi 等人，2008 )，这些数据最直接的解释是，NOS2 和 NO 是治疗性 CD8 + T 细胞疗效所必需的，而 ARG1 则会缓和 NO 依赖性反应。与此解释一致的是，在 WT 小鼠中，在肿瘤特异性 CD8 + T 细胞转移后， ARG1 的缺乏有利于肿瘤内 NOS2 +细胞的扩增 (图 S1E )。ARG1 缺失导致 NO 产生细胞增加 27%，这可能对肿瘤细胞杀死的动态相互作用产生相关影响，如下文所示。

ACT 诱导肿瘤内NOS2 +髓系细胞扩增

由于数据图 1提示局部肿瘤 NOS2 +髓系细胞对 ACT 疗效至关重要，我们接下来研究了 ACT 后肿瘤内髓系细胞数量和类型的变化。遵循图 3 中所示的门控策略图 2A，我们观察到 ACT 诱导肿瘤内Ly6C + II 类 MHC (MHCII + ) CD11b +细胞的扩增（图 2B).此外，在 ACT 后扩增的 CD11b + NOS2 +细胞部分（包含整个 NOS2 +细胞群）中，Ly6C + MHCII +细胞的数量增加，而 F4/80高成熟巨噬细胞的数量减少（图 2C、D, S2A )，这表明 Ly6C + MHCII +细胞而非 F4/80 high巨噬细胞有助于消除癌症所需的 NOS2 活性。重要的是，与其他观察结果一致（Korrer 和 Routes，2014；Kratochvill 等人，2015 ），ARG1 表达与 F4/80 high成熟巨噬细胞有关，表明上述肿瘤内 ARG1 +细胞是巨噬细胞（图 S2B）。与对照小鼠相比，从带有肿瘤特异性 CD8 + T 细胞的荷瘤小鼠中分离出的 Ly6G − CD11b +细胞在与肿瘤细胞共培养时具有增强的细胞抑制活性（图 S2C）。这种抗肿瘤作用在从Nos2 −/−小鼠中分离的细胞中不存在（图 S2C），而在从 WT 小鼠中分离的细胞中则伴随着 NOS2 表达增加（图 S2D ），这表明 ACT 诱导的髓系细胞中的 NOS2 活性有助于抗肿瘤活性。ACT 还增强了 Ly6C + MHCII + CD11b + NOS2 +细胞而非 F4/80 hi巨噬细胞体外产生 TNF的能力，这是活化髓系细胞的另一个标志（图 2E）。

图2：肿瘤特异性 CD8 + T 细胞的过继转移诱导 Tip-DC 扩增

(A) 点图表示用于定义 EG7 肿瘤块中的髓系亚群的总体门控策略。(B) 用 ACT 治疗 (CD8) 或未治疗 (w/o CD8) 的小鼠中 CD11b +门中的肿瘤浸润性髓系亚群的量化，n=18，来自 3 次实验。(C、D) 未经治疗 (w/o CD8) 或用 (CD8) ACT 治疗的 WT 小鼠中 CD11b + NOS2 +门控 (红色框) 中的肿瘤浸润性髓系群体的频率 (C，n=18，来自 3 次实验) 和代表性流式细胞术图 ( D，每个象限中标明不同群体的百分比)。(E) CD11b +门控中用或不用 LPS 刺激的肿瘤细胞悬浮液中不同髓系亚群的频率，n=3 个代表性实验中的 6 个。(F) 将分选出的髓系亚群与幼稚 CD4 +淋巴细胞一起培养，以通过 ELISA 评估上清液中释放的 IFN-γ，代表性实验 3。

（B、C、E、F）平均值 ± sd，***p ≤ 0.001，**p ≤ 0.01，采用单因素方差分析。

除了杀死肿瘤之外，我们还发现 ACT 能够激活肿瘤内的 Ly6C + MHCII +细胞，从而刺激OT-II 转基因小鼠的幼稚 OVA 特异性 CD4 + T 细胞（图 2FTNF 和 NOS2 上调与抗原刺激细胞能力和细胞表面标志物谱相结合（图 2A–D和图 S2E）表明 ACT 与抗肿瘤髓系细胞群的积累有关，这些细胞与产生 TNF 和 NOS2 的炎性树突状细胞最相似，通常称为 Tip-DC（Aldridge 等人，2009 年；Serbina 等人，2003 年）。我们将这些细胞定义为NOS2 + Ly6C + MHCII +，并在下文中将其称为 Tip-DC。

Tip-DCs 可逆转 ACT 治疗效果

转录组表征表明，ACT 后从肿瘤块中分选出的 Tip-DC 细胞与组织树突状细胞 (DC) 的相似度高于与单核细胞髓系抑制细胞 (M-MDSC) 或组织巨噬细胞 (MF) 的相似度 (图 S3 A–B和表 S1 和 S2 )。当我们使用组织 MF、组织 DC、M-MDSC 和 Tip-DC 中变异最大的基因子集 (图 S3A ) 以及一组先前描述的针对 DC ( Miller 等人，2012 年)、巨噬细胞 ( Gautier 等人，2012 年) 和 M-MDSC (图 S3B ) ( Conde 等人，2015 年) 的特异基因特征时，发现了这种相似性。

为了证明 NO 生成与 Tip-DC 的抗肿瘤活性的相关性，并确认其治疗效果，我们将从WT 或之前用 ACT 治疗过的Nos2 −/ − EG7 肿瘤小鼠中分选出的 Tip-DC 注射到Nos2 −/−小鼠体内生长的 EG7 肿瘤中（图 3AACT 后，Nos2 −/−小鼠的存活率仅在肿瘤内转移来自 WT 小鼠的 Tip-DC 后才有所提高（图 3B）。

图3：Tip-DC 在肿瘤环境中具有功能活性（A）实验的示意图。(B) 用 ACT 和从 WT 或 NOS KO 小鼠中分选的 Tip-DC 治疗的携带 EG7 肿瘤的 NOS KO 小鼠的存活率；n=6。**p ≤ 0.01，对数秩检验。(C) 通过流式细胞术分析体外产生的人类 Tip-DC 中的指示分子。(D) NOG 小鼠皮下注射 MDA-MB-231 并肿瘤内注射 CD14 单核细胞、Tip-DC 或 PBS，静脉注射抗 hTERT 特异性 CD8 + T 细胞（治疗或未治疗）。报告了 n=15 的存活率，汇总自 3 次独立实验。***p ≤ 0.001，对数秩检验。

为了测试人类 Tip-DC 改善 ACT 的能力，我们通过将人类 CD14 +单核细胞与从人类 (h)TERT 特异性 CD8 + T 细胞与用 HLA-A2 限制性 hTERT 肽脉冲的外周血单核细胞 (PBMC)共培养中收集的上清液一起孵育来生成这些细胞。与体外分化的 Tip-DC 表型一致的人类细胞与其来源的单核细胞相比，表达高水平的 MHCI、MHCII、CD86 和 TNF 并上调 NOS2（图 3C)。携带MDA-MB-231乳腺癌的NOG小鼠接受ACT治疗，使用hTERT特异性CD8 + T细胞，同时注射人类单核细胞或hTip-DC（图S3C）。只有Tip-DC的供应才显著改善ACT（图 3D）。

Tip-DC 分化依赖于 TCR 和 MHC-肽复合物之间的亲和力，并且可以在体外产生

为了进一步评估活化的 CD8 + T 细胞诱导 Tip-DC 扩增和响应抗原表达的活性的能力，我们将 OVA 特异性 CD8 + T 细胞转移到患有 B16 黑色素瘤的小鼠体内（图 4A）。我们选择了两种表达高水平或低水平OVA抗原的黑色素瘤系，通过用识别MHCI分子和OVA肽复合物表面表达的mAb进行染色以及通过与肿瘤细胞系共孵育后OVA特异性T细胞释放的IFN-γ量进行评估（图S4A，B ）。我们发现NOS2 + Ly6C + MHCII +细胞的体内扩增和ACT介导的免疫疗法的疗效取决于肿瘤抗原性，仅在表达大量OVA的B16黑色素瘤中明显（图 4A）。

图4：TCR 和 MHC-肽复合物之间的亲和力调节 Tip-DC 的产生和 ACT 的有效性

(A) 对于使用或未使用 ACT 治疗的携带 B16-OVA 高 (n=7) 或 B16-OVA 低(n=6) 肿瘤的 WT 小鼠，生存百分比 (*p ≤ 0.05，对数秩检验) 和 CD11b + NOS2 + 门控中不同肿瘤浸润髓系亚群的百分比(平均值± sd，代表 3 个独立实验，**p ≤ 0.01，使用单因素方差分析) 。(B) 将脾脏 CD11b +细胞在抗原刺激的 OT-I、TRP2高或 TRP2低CD8 + T 细胞的细胞培养上清液和抗 CD40 抗体中培养48 小时，然后分析 Tip-DC 分化情况。图中显示了代表性点图。(C)显示在不同培养条件下脾 CD11b +细胞体外产生的CD11b + Ly6C + MHCII +细胞的百分比。(D) 如图 D 所示，显示 CD11b + Ly6C + MHCII +细胞的 NOS2 和 TNF 的 MFI。（C、D）平均值±sd；n = 4 代表性实验 3，***p ≤ 0.001，**p ≤ 0.01 和 *p ≤ 0.05，采用单因素方差分析。(E) 将来自表达对 TRP-2 抗原具有特异性的 TCR 的小鼠（TRP-2高或 TRP-2低）的 CD8 + T 细胞过继转移至携带 B16 肿瘤的小鼠。作为阴性对照，转移了抗 OVA CD8 + T 细胞。报告了未经治疗或经 ACT 治疗的小鼠的存活率；每组 n=10 只小鼠，3 次独立实验。**p ≤ 0.01，对数秩检验。

我们接下来评估了循环前体产生的 Tip-DC 是否会受到激活 T 细胞产生的因子的影响。为了测试这一点，将从幼稚小鼠脾脏中分离的 CD11b +细胞培养在体外刺激的 CD8 + T 细胞上清液中，添加或不添加 CD40 激动剂，以诱导体外 Tip-DC 的产生。我们使用来自 OT-I 转基因小鼠或带有识别黑色素瘤抗原酪氨酸酶相关蛋白 2 (TRP-2 180–188 ) 的 H-2K b限制性表位的 TCR 的转基因小鼠的 CD8 + T 细胞，这些 TCR 具有高或低亲和力 ( Zhu et al., 2013 )，以下分别表示为 TRP-2高和 TRP-2低。OT-I 和 TRP-2高（而非 TRP-2低）小鼠的抗原刺激 CD8 + T 细胞的上清液可诱导 Tip-DC 体外分化，而用抗 CD3 和抗 CD28 mAb 刺激则效果不佳（图 4B、C)。OT-I 上清液中 NOS2 表达明显增高，而 CD40 激动剂存在时，TNF 表达未受到明显影响（图 4D)类似地，用高亲和力hTERT特异性TCR工程化T细胞和HLA-A2限制性hTERT肽脉冲的PBMCs体外共培养的上清液刺激CD14 +单核细胞，体外诱导的人类Tip-DC表达了大量的NOS2和TNF(图S4C )。

总的来说，抗原表达程度、TCR亲和力和CD8 + T淋巴细胞对抗原的有效识别促进了Tip-DC的产生。与这些结果一致，携带B16黑色素瘤的小鼠，自然表达TRP-2 180–188表位，仅在转移对TRP-2抗原具有高亲和力的CD8 + T细胞后才显示出显着的生存优势（图 4E和图S4D）。

CD40 的连接可通过 IFN-γ 依赖性机制刺激巨噬细胞 ( Weiss et al., 2010 ) 和小胶质细胞 ( Jana et al., 2001 ) 中 NOS2 的表达，因此可能对激活肿瘤微环境中的 NOS2 很重要。Tip-DC 的体外生成依赖于抗 CD40 刺激 (图 4D、E) 但仅部分依赖于 IFN-γ，而 NOS2 和 TNF 的表达不受 IFN-γ 阻断的影响（图 S4E、F）。

CD40-CD40L 轴是 CD8 + T 细胞介导的肿瘤排斥所必需的

为了评估 CD40 的参与是否刺激了 CD8 + T 细胞识别肿瘤后迅速释放 NO ，我们对在 WT 或不同 KO 小鼠中生长的肿瘤活组织切片进行了染色，以评估 CD40 激活后的 NO（图 S5A、B）。OT-I 小鼠的肿瘤抗原特异性 (OVA) CD8 + T 细胞（而非识别无关抗原 (gp100) 的细胞）在 WT 肿瘤切片中诱导 NO 释放，而在Nos2 −/−组织中则被消除（图 5A)，证实 NOS2 产生 NO 的特异性，而非非免疫 NOS 亚型 (NOS1、NOS3)。CD40 或 CD40L KO 小鼠体内生长的肿瘤切片在与来自 OT-1 的肿瘤特异性 CD8 + T 细胞相互作用后 NO 释放减少，表明 CD40/CD40L 轴在组织浸润细胞中发挥作用，以维持 NOS2 活化 (图 5A）。

图5：CD40-CD40L 是 ACT 有效性的必要条件

(A) 将 CFSE 标记的 CD8 + T 细胞（对 OVA 或 gp100 抗原具有特异性）与来自 WT 或不同 KO 小鼠的 EG7 肿瘤切片一起孵育（如所示）。通过共聚焦显微镜对装有 DAR-4M AM 的切片进行检测。NO 释放水平以荧光平均值来测量，并以对照（无 CD8）的倍数诱导来表示。平均值 ± sem；n = 12 个切片，来自 3 个独立实验，***p ≤0.001，**p ≤0.01，使用单因素方差分析。(B) CFSE 标记的 OVA 特异性多克隆 CD8 + T 细胞来自免疫的 WT 或 E8I cre x Cd40lg flox/flox小鼠，并与 WT 或 CD40L KO 小鼠的 EG7 肿瘤切片一起孵育，如图所示。NO 检测结果与 A 中相同。误差线，平均值 ± sem；n=12 个切片，来自 3 个独立实验，***p ≤ 0.001，**p ≤ 0.01，使用单因素方差分析和 Holm–Sidak 校正法进行所有成对多重比较。(C) 未经治疗或用 ACT 治疗的 WT、CD40 KO 和 CD40L KO EG7 肿瘤小鼠的存活百分比 (n=10)。*p ≤ 0.05 *** p ≤ 0.001，对数秩检验。(D) EG7 肿瘤 RAG 缺陷小鼠用从 WT 和 CD40L KO（EG7 肿瘤或无肿瘤）小鼠的脾脏和淋巴结中分离的 CD8 + T 淋巴细胞重建。2 天后，用 OVA 特异性CD8 + CD45.1 + T 淋巴细胞进行 ACT。报告 ACT 后第 9 天和第 13 天的肿瘤面积。水平线代表 n=7 的平均值。**p ≤ 0.01，非配对学生t检验。

为了研究 CD8 + T 细胞表达 CD40L在 NO 爆发诱导中的作用，我们从之前接种过 OVA 肽的 WT 或 CD40L KO 小鼠的脾脏中分离出多克隆 CD8 + T 细胞，并测试了它们在与 WT 或 CD40L KO 小鼠中生长的肿瘤切片接触时诱导 NO 释放的能力。尽管 OVA 特异性 CD8 + T 细胞中缺乏 CD40L会降低 WT 肿瘤中的 NO 释放，但在 CD40L KO 小鼠中生长的肿瘤中观察到的减少幅度最大（图 5B), 这表明 CD40L 信号位于 ACT 后 NOS2 释放 NO 的“上游”。

为了测试 CD40/CD40L 轴在肿瘤排斥中的特异性，我们监测了 WT、CD40（由Tnfrsf5编码）KO 和 CD40L（由Cd40lg编码）KO 小鼠的存活率，这些小鼠携带 EG7 肿瘤并用肿瘤特异性 CD8 + T 细胞治疗。我们发现缺乏 CD40L 会消除治疗活性，而缺乏 CD40 则有部分影响（图 5C)。为了了解 CD40 如何参与 CD8 + T 细胞诱导的 NO 依赖性治疗活性，我们从 CD40 缺陷小鼠体内生长的肿瘤中分离了 Ly6G − CD11b +细胞。与 WT 小鼠不同（图 S2C ），ACT 不会增加 Ly6G − CD11b +细胞对 EG7 肿瘤细胞的细胞抑制作用（图 S5C ），也不会增加Tnfrsf5 −/−小鼠体内这些细胞中NOS2 的表达（图 S5D ） 。这些数据表明 NOS2 诱导的肿瘤杀伤需要激活肿瘤内髓系细胞内的 CD40。

为了确定受体细胞中哪些细胞提供了 ACT 治疗效果所必需的内源性 CD40L，我们对从接受 ACT 的野生小鼠肿瘤中分离出的不同细胞中的Cd40lg mRNA 进行了量化。除了转移的 CD8 + CD45.1 + T 淋巴细胞外，肿瘤浸润群体中表达Cd40lg mRNA的其他细胞是受体、宿主衍生的 CD4 +和 CD8 + T 细胞（图 S5E）。然而，OVA 特异性 CD8 + T 细胞不需要 CD4 + T 细胞的帮助来诱导肿瘤消退，因为 CD4 + T 细胞的消耗对 ACT 疗效没有影响（图 S5F）。

为了探究内源性 CD8 + T 细胞上 CD40L 表达如何促进肿瘤排斥的机制，我们将从EG7 荷瘤 WT 或Cd40lg −/−小鼠的次级淋巴器官中分离的 CD8 + T 细胞转移到免疫缺陷的 EG7 荷瘤 RAG 小鼠中。通过这种策略，我们在 ACT 前用正常或 CD40L 缺陷的 CD8 + T 淋巴细胞重建了内源性抗肿瘤 CD8 + T 细胞库。作为额外的对照，从无瘤小鼠中富集了CD8 + T 细胞。重建后，将小鼠过继转移给 OVA 特异性 CD8 + T 细胞并分析肿瘤生长情况（图 S5G）。ACT 后，来自荷瘤 WT 小鼠的 CD40L 能力内源性 CD8 + T 细胞比从无瘤或Cd40lg −/−小鼠中分离的CD8 + T 淋巴细胞更有效地控制了肿瘤生长（图 5D）这些数据证明，肿瘤激活的 CD8 + T 细胞库通过提供内源性 CD40L 帮助，有助于 ACT 后的肿瘤根除。

基于支持 Tip-DC 功能增强 ACT 疗效

F4/80高成熟巨噬细胞表达大量 ARG1 ( Kratochvill 等人，2015 ) 并且依赖于 CSF-1 ( Noy 和 Pollard，2014 )。与 Tip-DC 一样，这些细胞源自被募集到肿瘤的炎性单核细胞，并在肿瘤生长过程中随时间的推移而增加 ( Franklin 等人，2014；Kratochvill 等人，2015；Movahedi 等人，2010 )。因此，干扰 CSF-1 依赖性细胞可通过减少 ARG1+ 细胞的数量来增强 NO 依赖性 ACT。对患有 EG7 肿瘤的 WT 小鼠进行单剂量抗 CSF-1R mAb 急性治疗，然后注射肿瘤特异性 CD8 + T 细胞 (图 S6A )。虽然在使用抗 CSF-1R mAb 治疗 6 天后，ACT 维持并增强了 F4/80高巨噬细胞的减少，但巨噬细胞耗竭并没有改变 NOS2 + Ly6C + MHCII +细胞的扩增，这表明 ACT 后它们的累积或分化有一个不依赖于 CSF-1R 的步骤（图 6A）。

图6：通过促进肿瘤内髓系平衡以促进 Tip-DC 积累来提高 ACT 疗效

(A) EG7 肿瘤野生小鼠用抗 CSF-1R 或 Ctrl 抗体治疗，随后用 OVA 特异性 CD8 + CD45.1 + T 淋巴细胞进行 ACT 治疗或不进行治疗。图中显示了肿瘤块内 CD11b + NOS2 +门控中不同髓系亚群的百分比。n=12，来自 2 个独立实验。

(B–C) WT (B) 或 NOS KO (C) MCA203 肿瘤小鼠每周接受抗 CSF-1R 或 Ctrl 抗体治疗，并注射或不注射 mTERT 特异性 CD8 + T 淋巴细胞。所示日期的肿瘤体积显示为平均值 ± sd，（n = 15）。

(D) 用抗 CSF-1R 或 Ctrl 抗体治疗（联合或不联合 ACT）的小鼠的肿瘤中不同免疫亚群的百分比（n = 8）。

（A、D）误差线表示平均值±sd，***p ≤ 0.001，**p ≤ 0.01 和 *p ≤ 0.05，采用单因素方差分析。

考虑到抗 CSF-1R 对 F4/80高成熟巨噬细胞有活性，但对 Tip-DC 无活性，我们推测用抗 CSF-1R mAb 重新编程肿瘤微环境也可以提高 ACT 的疗效，而对肿瘤抗原的反应性有限。为了测试这一点，我们使用了一种模型，其中 CD8 + T 细胞对其同源抗原的反应性较弱，并且无法在正常小鼠中介导抗肿瘤作用。我们使用了小鼠端粒酶 (mTERT) 特异性 CD8 + T 细胞，单独使用时，这些细胞对 TERT + MCA203 纤维肉瘤缺乏抗肿瘤活性（Ugel 等人，2012 年；Ugel 等人，2010 年）。在 WT 小鼠上反复施用抗 CSF-1R mAb 和 mTERT 特异性 CD8 + T 细胞可诱导肿瘤生长的附加延迟（图 S6B和图 6B)。联合治疗对Nos2 −/−小鼠没有效果（图 6CACT 联合抗 CSF-1R 疗法导致肿瘤内巨噬细胞和单核细胞减少，而粒细胞、Tip-DC、总 CD8 + T 细胞，尤其是活化的 CD8 + T 细胞数量增加（图 6D）。

肿瘤内免疫网络中的 CD40L、NOS2 和 TNF 与结直肠癌患者的预后相关

人类癌症中免疫反应的最完整图景已在结直肠癌 (CRC) 中得到描述 ( Bindea et al., 2013b )。在 CRC 组织中，我们使用 ClueGO ( Bindea et al., 2009 ) 和 CluePedia ( Bindea et al., 2013a ) 将CD40LG、NOS2和TNF表达与免疫细胞亚群特异性标记物相关联。我们发现这些基因的肿瘤内表达与细胞毒性 CD8 + T 细胞、T 细胞、Th1 和活化 DC 的标记物之间存在关联 (图 7A)。B 细胞、Th2、Th17 和巨噬细胞包含在网络中，但与细胞毒性 CD8 + T 细胞、T 细胞、Th1 和活化 DC相比，它们与CD40LG、NOS2和TNF表达的相关性较弱。其他免疫细胞群与这三个靶基因无相关性（图 7A, S7A )。与异质性或低水平表达的肿瘤相比，在CD40LG、NOS2和TNF高表达的肿瘤中，细胞毒性 CD8 + T 细胞、T 细胞和 Th1 标志物的表达更高（图 S7B）。对于 MHCII 基因和与抗原呈递机制相关的基因也观察到了类似的结果（图 S7B）。通过免疫组织化学验证了基因表达谱比较获得的结果。在高CD40LG（图 S7C）和TNF（图 S7D ）的肿瘤中观察到明显更高的 CD3 + T 细胞密度，对于NOS2也观察到类似的趋势（图 S7E ）。CD40LG 、TNF或NOS2高表达的肿瘤显示 CD8 +、CD4 +、T-Bet + T 细胞浸润密度增加（图 S7C-E）。CD40LG、NOS2和TNF 这三种标志物均高表达（HiHiHi）的肿瘤患者的肿瘤内 CD3 + T 细胞、CD4 + T 细胞和 T-Bet +阳性 Th1 细胞的密度明显较高（图 7B此外，HiHiHi患者基质中CD8 + T细胞显著增加，而Th17细胞和巨噬细胞无差异（图 7B)。我们研究了CD40LG、NOS2和TNF对无病生存率 (DFS、图 7C)。三种标志物肿瘤内表达均较高的患者与三种标志物水平较低的患者相比，DFS 更长 [风险比=4.35，95%CI=1.66–11.75，对数秩 p=0.033]。

图7：CD40LG、NOS2 和 TNF 与人类 CRC 生存相关

(A)在 ClueGO-CluePedia 网络中可视化的CRC（n = 125 名患者）中CD40LG、NOS2和TNF表达（qPCR）与免疫组标记之间的相关性。与特定免疫细胞群相关的标记与节点共享颜色。节点之间的线（边）表示 Spearman 等级相关值，分别用红色（ CD40LG，ρ >0.5）、蓝色（NOS2，ρ >0.2）和绿色（TNF，ρ >0.5）表示。负相关用正弦线表示。下图显示与网络边缘相对应的成对相关图。(B) CD40LG、NOS2 和 TNF表达 (HiHiHi)、异质性 (Htg) 或低 (LoLoLo) 患者的肿瘤中心 (CT) 浸润免疫细胞密度（每平方毫米组织表面积的阳性细胞数）。应用参数或非参数检验。误差线，平均值 ± sem；n = 107。中位细胞数/平方毫米显示为蓝色，** p ≤0.01，* p ≤0.05。(C)显示了CD40LG、NOS2和TNF表达高、异质和低的患者的无病生存期 (DFS) 。

我们描述了抗肿瘤 CD8 + T 细胞和 Tip-DC之间的相互作用，该相互作用导致肿瘤生长控制依赖于 NO 的产生。基于 ACT 的治疗需要触发“良性循环”，其中 CD8 + T 细胞识别肿瘤抗原是募集和激活 Tip-DC 所必需的，而 Tip-DC 反过来又呈递肿瘤抗原，促进 T 细胞扩增，并通过 TNF 和 NO 产生杀伤肿瘤。我们发现 NO 释放是 ACT 抗肿瘤活性的主要因素，并受到 F4/80 hi巨噬细胞中 ARG1 表达的抑制。肿瘤环境中 NOS2 产生的 NO 可以抑制 T 细胞产生 IFN-γ 的能力。虽然我们没有研究免疫抑制 NO 的来源，但在某些情况下，肿瘤中的 F4/80 +细胞可能有所贡献（Vicetti Miguel 等人，2010 年）。该研究还强调，一些组织，例如眼前房，可以通过抑制 NO 的产生来负向调节 ACT 在肿瘤浸润性 F4/80 +细胞中诱导的 NOS2 活性（Vicetti Miguel 等人，2010 年）。

我们将 ACT 后扩增的髓系细胞群定义为 Tip-DC；这些细胞具有基于其转录组和免疫表型的炎症 DC 特征、作为抗原呈递细胞的功能活性以及分泌 NO 和 TNF 的能力。不同来源的小鼠肿瘤中 Tip-DC 的数量在 0.01% 到 0.15% 之间变化（数据未显示），ACT 后其数量增加 3.5 到 12 倍。在所有肿瘤中，NOS2 +巨噬细胞要么不变，要么减少。这些数据表明需要进一步研究以评估 TCR 或嵌合抗原受体 (CAR) 转导的 T 淋巴细胞的临床疗效是否与人类 Tip-DC 的肿瘤内扩增相关。

重要的是，Tip-DC 分化不需要 CSF-1R 信号传导。然而，CD8 + T 细胞与 Tip-DC 的 CD40 结合是 NO 生成和抗肿瘤作用的关键分子事件之一。无病生存期较长的 CRC 患者的肿瘤具有共同的特征，包括 CD8 + T 细胞、活化的 DC 以及CD40LG、TNF和NOS2表达，这表明 Tip-DC 的抗肿瘤功能及其活化和效应机制可能与小鼠中的同源事件重叠（Bindea 等人，2013b；Galon 等人，2006）。

T 细胞消灭肿瘤的一个基本要求是靶向肽对 MHC I 类分子具有高亲和力 ( Engels et al., 2013 )。我们发现当肿瘤细胞表达足量的 MHCI-肽复合物时，具有足够 TCR 亲和力的肿瘤特异性 CD8 + T 细胞会扩增并激活 Tip-DC。Tip-DC 源自骨髓单核细胞，其主要作用是快速和局部激活 T 细胞应答 ( Aldridge et al., 2009 ; Bosschaerts et al., 2010 ; Serbina et al., 2003 ) 和在患者皮肤的银屑病病变中发挥促炎作用 ( Chong et al., 2011 ; Lowes et al., 2005 )。Tip-DC 的一个关键特性是它们能够启动幼稚 T 细胞 ( Chong et al., 2011 )。我们的数据表明，Tip-DC 的免疫功能超出了对感染的控制，对于肿瘤生长控制是必需的，并且可能是组织稳态更广泛机制的一部分，通过局部将适应性免疫与细胞生长控制相结合。

Mok 及其同事报道，使用干扰 CSF-1R 信号传导的治疗方法，ACT 可改善免疫疗法 ( Mok et al., 2014 )。此外，抗 CSF-1R 阻断抗体目前正在临床前和早期临床试验中作为消耗促肿瘤巨噬细胞的手段进行测试 ( Ries et al., 2014 )。我们在此证明，通过平衡免疫抑制细胞（如巨噬细胞）和 Tip-DC，而不改变前体细胞产生 Tip-DC，有可能改善 ACT 对难以识别的肿瘤相关抗原的效果。可以修改 ACT 中抗 CSF-1R 抗体的使用，以在 Tip-DC 最活跃地杀死肿瘤时消耗 F4/80 +巨噬细胞。或者，可以体外制备 Tip-DC 并靶向肿瘤环境，以帮助局部分布和进入的抗肿瘤 T 淋巴细胞。因此，肿瘤内巨噬细胞和Tip-DC之间的对立关系是设计合理免疫疗法的另一个攻击点。

CD40-CD40L 相互作用控制着一系列途径，这些途径是细胞和体液适应性免疫的启动和进展的基础 ( Gommerman and Summers deLuca, 2011 )。此外，CD40 激动剂可在小鼠和胰腺癌患者中诱导 T 细胞依赖性和 T 细胞非依赖性的肿瘤消退 ( Beatty et al., 2011 )。与我们最初的模型相反，CD40L 不是由肿瘤浸润的 CD4 + T 淋巴细胞提供的，而是由 CD8 + T 淋巴细胞提供的。一定比例 (平均约 25%) 的中枢和效应记忆 CD8 + T 细胞表达 CD40L 并可显示辅助功能、诱导单核细胞衍生的树突状细胞成熟和体内抗原呈递细胞 (APC) 活化 ( Frentsch et al., 2013 )。本研究认为 CD40L 在内源性 CD8 + T 细胞上的表达起着重要作用。然而，在某些情况下，CD40L 可能由识别突变肿瘤表位的 CD4 + T 淋巴细胞提供，这在小鼠和人类肿瘤中经常检测到（Gubin et al., 2014 ; Kreiter et al., 2015 ; Linnemann et al., 2015）。

临床证据表明，通过化疗诱导的宿主淋巴细胞耗竭可提高 ACT 疗效（Restifo 等人，2012 年），但我们的数据表明还有其他选择。识别自身抗原 mTERT 的CD8 + T 细胞可以像来自 Pmel-1 TCR 转基因小鼠的 T 细胞一样有效地治疗已建立的黑色素瘤，后者识别 hgp-100 黑色素瘤抗原（ Ugel 等人，2010 年）。然而，仅在完全缺乏适应性免疫、通过非清髓性放射线耗竭淋巴细胞或用低剂量化疗药物 5-氟尿嘧啶预先处理的小鼠中，使用两种 CD8 + T 细胞进行 ACT 后黑色素瘤生长得到控制（Ugel 等人，2012 年；Ugel 等人，2010 年）。在正常宿主中，mTERT 特异性 CD8 + T 淋巴细胞缺乏治疗功效，并且不会诱导 Tip-DC 的出现，除非与 CSF-1R 阻断相结合。

总之，我们剖析了控制治疗性抗癌 T 细胞与局部免疫抑制微环境之间相互作用的机制。最重要的是，我们阐明了活化 T 细胞与髓系细胞之间相互作用的不同节点，这些节点可以通过外源操纵来增强癌症免疫疗法。