https://doi.org/10.1111/j.1939-165X.2003.tb00323.x
传统上，骨骼对疾病和损伤反应的常规评估包括平片放射线照相术，辅以先进的成像技术，例如计算机断层扫描、磁共振成像、核闪烁显像和骨密度测定。虽然这些技术与放射线照相术相比具有更高的灵敏度，但它们仍然受到以下事实的限制：它们只能记录过去骨骼活动的净结果。相比之下，血清和尿液中的骨形成和骨吸收生物标志物可提供有关骨细胞活动的近乎实时的信息。在这篇综述中，我描述了在人类中使用这些标志物的科学原理，并详细介绍了为将该技术应用于兽医学和动物研究而做出的努力。描述了适用于不同动物物种的商业检测试剂盒，并讨论了该技术的潜在局限性。这篇综述的目的是为临床病理学家和研究人员提供所需的信息，以决定使用骨标志物是否有用，并选择最合适的标志物（或标志物组）来回答特定问题。
介绍
血清和尿液骨标志物检测是评估骨骼对疾病和损伤反应的非侵入性骨活检替代方法。放射线照相术和骨密度测定可随时提供身体净骨平衡的快照，而血清和尿液检测可近乎实时地量化骨细胞的形成和吸收活动。这些检测提供了一种简单、灵敏且准确的方法来评估疾病进展或对治疗的反应。与连续骨活检不同，重复测量血清和尿液标志物水平不会干扰骨代谢。
已经描述了多种生化检测方法，用于测量人类骨代谢标志物的血清和尿液浓度。该领域取得进展的动力来自我们对女性绝经后骨质疏松症的病理生理学和治疗的理解所取得的巨大进步。所有检测的基础是这些生物标志物的血清或尿液浓度与形成骨骼的细胞（成骨细胞）和吸收骨骼的细胞（破骨细胞）的代谢活动的相关性。
正常骨代谢的细胞基础
动物的骨转换过程通过两个根本不同的过程进行，即建模和重塑。在建模过程中，骨形成和骨吸收在空间和时间上彼此独立，而重塑则涉及通过组成骨多细胞单元的破骨细胞和成骨细胞的协同作用在离散位置连续去除和替换骨骼。
造型是骨骼生长和达到其最终几何形状的主要机制。纵向生长是通过软骨内骨化过程实现的，在此过程中，成骨细胞被募集并随后将矿化基质沉积在软骨小梁上，初级松质骨毗邻生长板（图 1A）。
大鼠胫骨近端的低倍显微照片，显示了负责纵向生长（A）和周向（或径向）生长（B）的区域。
由于生长板比骨干宽，因此在骨膜表面会发生选择性破骨细胞骨吸收，以去除骨骼并保持长骨的典型外展。周向生长是通过骨膜表面膜内骨化过程的直接骨形成实现的（图 2）。随着骨骼外径的增加，骨骼同时从内表面（骨内膜）去除，以维持皮质宽度和髓管直径之间的比率。骨骼两侧骨膜骨形成和骨内骨吸收的相对量的细微变化，导致了肋骨和肱骨等骨骼的典型弯曲。
( A ) 纵向骨生长通过软骨内矿化进行。在未成熟动物的近端胫骨中，软骨小梁 (C) 首先被血管侵入，然后被破骨细胞 (OC) 吸收，最后被由骨髓间充质细胞衍生的成骨细胞形成的矿化骨小梁 (B) 取代。( B ) 径向骨生长通过现有骨表面的直接膜内矿化进行。骨膜表面的成骨细胞活动 (箭头) 导致新骨沉积 (B) 和皮质壁增厚。甲苯胺蓝染色。
重塑是指在时间和空间上受约束的过程，在此过程中骨骼被依次移除，然后由新骨替换。在此过程中，因日常发生的微骨折而受损的骨骼被移除并由健康的新骨替换。虽然骨骼的外部尺寸和形状不受重塑的影响，但其内部结构（例如小梁方向）可能会发生细微改变，以提高骨骼抵抗所受力的能力。
骨重塑涉及在同一表面上依次移除和替换骨骼。在骨小梁的一侧可见多核破骨细胞 (OC)，而一排成骨细胞 (箭头) 已在另一侧表面形成类骨质。随着时间的推移，这种同时移除和添加骨骼的过程将改变骨小梁的形状（即重塑）。Goldner 三色染色的 Masson 变体。
在骨骼成熟的动物中，骨吸收和骨形成在重塑过程中保持平衡，因此骨量没有净变化。然而，随着动物年龄的增长，骨吸收和骨替换的相对效率可能会发生变化，从而导致骨量净紊乱。这种骨平衡丧失的最常见例子发生在绝经后，此时雌激素的流失导致骨吸收增加，从而导致骨量降低。
以骨量紊乱为特征的疾病可能同时影响骨形成和骨吸收；在这种情况下，成年动物骨重塑的平衡（或耦合）会丧失。例如，绝经后骨质疏松症中破骨细胞活性的增加可能伴随着成骨细胞活性的增加、减少或不变。因此，只有通过分别测量骨形成和骨吸收的技术，才能全面了解骨病理细胞基础的复杂性。直到最近，这些单独的测量都需要骨活检的组织形态学检查。然而，生化骨标志物提供了一种可行的活检替代方案，因为样本采集简单且无创，并且可以多次进行而不必担心引入连续偏差。最重要的是，血清和尿液标志物反映的是总骨代谢，而不是仅在样本采集部位（即髂嵴，这是骨活检的典型部位）的代谢。
骨细胞活性的生化标志物
由于骨吸收和骨形成依赖于破骨细胞和成骨细胞的活性，人们一直在努力确定是否有可能检测出骨细胞活性的循环标志物。为了在临床上有用，骨代谢的生化标志物应该对骨细胞活性的变化既敏感又有特异性，而不会受到非骨代谢变化的过度影响。已经提出了许多标志物作为骨形成和骨吸收的替代指标。一般来说，骨形成标志物只能在血清中检测到，而许多骨吸收标志物可以在血清和尿液中检测到。
骨形成标志物
碱性磷酸酶：碱性磷酸酶 (ALP) 是一种膜结合蛋白，由多种组织中的细胞合成。在人类中，已鉴定出 4 种 ALP 同工酶，其中 3 种在肠道、胎盘和生殖细胞中以组织特异性分布表达。第四种同工酶，组织非特异性 ALP，广泛分布于全身，但在肝脏、肾脏和骨骼中尤其丰富。在骨骼、肝脏和肾脏中表达的 ALP 分子都是同一基因的产物，仅在翻译后修饰的性质和程度上有所不同。骨特异性 ALP (BALP) 被认为是骨形成最准确的单一标记，因此是骨佩吉特病中成骨细胞活性增加的经典标记。
在家畜中已鉴定出四种 ALP 变体：BALP、肠道 ALP、肝脏 ALP (LALP) 以及狗的皮质类固醇诱导 ALP (CALP)。LALP 和 BALP 是同一基因的产物，仅在翻译后糖基化位点的数量和位置上有所不同，而 CALP 是不同 ALP 基因的产物，因此是真正的 ALP 同工酶。
ALP 的潜在来源众多，使得总 ALP 值的解释变得复杂。在骨骼未成熟的动物中，BALP 的活性往往占主导地位，因为生长动物的基础骨周转率较高。在老年动物中，疾病过程或药物可能会增加 LALP 和/或 CALP 的相对贡献。为了克服这些问题，人们努力开发能够区分 ALP 不同同工酶的分析技术。BALP 可以通过热变性、凝胶电泳或用小麦胚芽凝集素进行化学沉淀来分离。最近，已开发出用于人类的放射免疫分析 (RIA) 和 ELISA 试剂盒；这些试剂盒与来自许多动物物种的 BALP 表现出可接受的交叉反应性（表 1），因此可用于量化动物的 BALP 活性。
骨钙素：骨钙素又称血清骨-Gla 蛋白，是一种小分子（46-50 个氨基酸）、维生素 K 依赖性蛋白，仅在成骨细胞和巨核细胞中合成。尽管骨钙素是骨骼中最丰富的非胶原蛋白之一，但其在骨形成中的作用尚不清楚。骨钙素在骨吸收过程中不会从骨骼中释放出来，因此血清骨钙素水平准确反映了成骨细胞的合成活性。总体而言，血清骨钙素水平与骨组织形态学测量的骨形成率之间存在密切相关性，血清骨钙素浓度与其他血清骨形成标志物浓度之间也存在密切相关性。
已经开发出多种灵敏的 RIA 和 ELISA 试剂盒用于测量人类骨钙素。虽然这些检测方法可用于某些动物物种，但它们不适用于狗、大鼠或小鼠。不过，目前市场上已有针对狗、大鼠和小鼠骨钙素的灵敏且特异的 RIA。
胶原蛋白 I 型前肽：成骨细胞合成胶原蛋白 I 型代表新骨形成的后期阶段。胶原蛋白 I 型合成为较大的前体胶原蛋白 I 型分子，分泌到细胞外空间，然后受到细胞外蛋白酶的攻击，从胶原蛋白 I 型分子的氨基和羧基末端释放出游离肽序列（前肽）。氨基末端和羧基末端前肽（分别为 PINP 和 PICP）的血清浓度反映了健康和疾病状态下胶原蛋白 I 型合成的水平，这两种标记物已被用作骨质疏松症和佩吉特病等代谢性骨病中骨形成的替代指标。市售RIA 和 ELISA 试剂盒可用于检测人类的 PINP 和 PICP；其中一些检测试剂盒还显示出与动物血清中的前肽具有可接受的交叉反应性。
骨吸收标志物
I 型胶原蛋白占骨有机基质的 90% 以上。I 型胶原蛋白由连接的 I 型胶原蛋白分子组成，I 型胶原蛋白分子的氨基和羧基末端区域通过吡啶交联、脱氧吡啶啉 (Dpd) 和吡啶啉 (Pyd) 与相邻胶原蛋白分子的螺旋区域相连。
I 型胶原的端肽：由破骨细胞衍生的酸性蛋白酶介导的 I 型胶原的分解导致 I 型胶原分子的游离和肽结合代谢物的释放（图 4）。从 I 型胶原的氨基和羧基末端区域释放的片段分别称为 N 端肽 (NTX) 和 C 端肽 (CTX)。这些端肽由来自 I 型分子的螺旋结构域和相邻分子的端肽区域的短肽序列组成，通过吡啶交联（Pyd 或 Dpd）连接。从骨中释放的一部分端肽以原形随尿液排出，其余部分由肝脏和肾脏代谢。
胶原蛋白 I 型的分解。单个胶原蛋白分子由 2 条胶原蛋白 α1(I) 链和 1 条 α2(I) 链组成，呈三重螺旋结构，通过吡啶 (P) 交联（吡啶啉或脱氧吡啶啉）连接在一起，将 1 条链的螺旋区域与相邻链的 C 端或 N 端区域连接起来。血清和尿液中均发现了游离（即吡啶啉或脱氧吡啶啉）和肽结合（即 N 端肽 [NTX] 和 C 端肽 [CTX]）形式的胶原蛋白交联，但 NTX 和 CTX 占主导地位。第三种端肽 ICTP 是 CTX 的轻微变体，仅存在于血清中。
已经开发出针对 3 种 I 型胶原蛋白端肽的商业化检测方法：NTX、CTX 和 ICTP（CTX 的轻微变体）（表 2）。NTX 和 CTX 可在血清或尿液中测量，而 ICTP 则在血清中测量。对于尿液检测，标志物排泄对肾脏清除率很敏感，因此尿液中的 NTX 和 CTX 浓度应根据尿液肌酐排泄量进行校正。健康个体的血清 ICTP 水平不受肾脏清除率的显著影响。
在绝经后女性中，血清 ICTP 水平与骨吸收相关，这是通过骨活检的组织形态学分析确定的。尿液NTX 和 CTX 似乎也是骨吸收的敏感指标，高水平表明破骨细胞活性过高。NTX、CTX 和 ICTP 通常用于监测双膦酸盐治疗骨质疏松症的骨骼影响。所有3 种标记物均已在动物中使用，尽管物种交叉反应性各不相同。CTX 和 ICTP 表位的释放取决于作用于骨胶原的胶原蛋白酶类型，因此它们的相对丰度提供了有关潜在骨病理学可能性质的信息。
吡啶啉和脱氧吡啶啉：N 端和 C 端肽代谢的最终产物是氨基酸和游离或肽结合的 Pyd 或 Dpd 交联（图 4）。在这两种类型中，Dpd 被认为更具骨特异性，因为它不存在于皮肤的 I 型胶原蛋白中。
早期对尿液 Pyd 排泄的研究采用了高效液相色谱法，但灵敏且特异的 ELISA 现已取代了这项技术。游离 Dpd 的检测仅适用于尿液样本，但 Pyd 可在血清和尿液中检测（使用不同的试剂盒）。所有商用试剂盒都与动物样本有广泛的交叉反应（表 2）。与 NTX 和 CTX 一样，标记物浓度会根据尿液肌酐进行校正，以解释肾脏清除率的差异。
羟脯氨酸和羟赖氨酸：目前已有测定尿羟脯氨酸和羟赖氨酸糖苷的检测方法。随着 ELISA 的引入，这些检测方法已基本不再受欢迎。
样本采集和保存
血清是所有骨形成检测的首选样本。对于骨吸收标志物，血清或尿液可能更合适，具体取决于所使用的试剂盒。
静脉血样本应收集到不含防腐剂的试管中并凝固。在 2000g 离心后，应将血清样本倒出并在 -20°C 或以下的温度下分批冷冻。骨钙素相对不稳定，血清样本应在收集后 1 小时内处理并冷冻。尿液样本（排尿或通过膀胱穿刺术获取）应收集在干净、不含防腐剂的容器中，然后在 -20°C 下冷冻。尿液中的吡啶啉对光敏感，因此样本应存放在黑暗中或铝箔包装的容器中。
骨标志物的长期稳定性尚未在动物身上进行过详细评估。在人类中，现有证据表明，如果在-20°C 或以下的温度下储存，大多数样本至少可以稳定 6 个月。当要对一个样本进行多项检测时，应将血清（或尿液）分批冷冻，以避免反复冷冻和解冻。
骨标志物的生物变异性
尽管上述每种生物标记物都已在人类研究中得到验证，但它们作为骨骼健康和疾病的诊断和预后指标的实用性在很大程度上取决于检测方法检测出与正常（健康）状态有显著差异的能力。单个检测方法的鉴别能力取决于检测技术固有的变异性（分析变异性）和研究人群固有的变异性（生物变异性）。如果标记物的生物变异性很高，则检测方法的分析变异性并不像生物变异性低时那么重要。一般来说，对于临床实用性，检测方法的分析变异性应小于或等于标记物生物变异性的一半。
影响生物变异性的因素包括年龄、性别、营养、运动和全身性疾病。此外，人类使用的许多骨标记物都存在明显的昼夜、日常和季节变化，包括骨钙素、胶原前肽、BALP 和吡啶交联。这些时间节律的潜在基础仍存在争议，尽管与活动、食物和水摄入量、肾功能和内分泌变化有关。
已在许多动物物种中记录了骨转换标志物的昼夜变化，包括大鼠、小鼠、兔子和马。在最近对骨骼成熟狗的骨生物标志物的昼夜和长期变化进行的详细分析中，Ladlow 等人每 4 小时采集一次血清和尿液样本，共 28 小时，然后每周一早上采集一次，共 12 周。狗的骨重塑活动具有明显的昼夜模式，早上的骨钙素、ICTP 和 Dpd 水平高于下午。BALP 活动也显示出昼夜节律，高峰活动出现在午后（图 5 ）。这些数据与早期研究中获得的数据相似，该研究报告了骨钙素、ICTP 和总（非骨特异性）ALP 的变化。对 Ladlow 等人研究的长期数据的分析表明，血清和尿液标志物浓度在动物体内和动物间存在显著差异。与人类的情况一样，血清检测的动物体内差异小于尿液检测，后者标志物排泄差异与肌酐排泄差异有关。由于这些检测的分析差异较小（约 3-7%），因此它们似乎符合临床实用性标准，至少对狗而言如此。
骨标记物的实际应用
人类医学经验
骨生物标志物在人类医学中的主要应用是作为监测代谢性骨病的非侵入性工具。尽管有报道称尿液/血清标志物浓度与骨重塑的组织形态学指标之间存在很强的相关性，但骨质疏松症和佩吉特病等代谢性骨病的确诊取决于骨密度测定和/或骨活检数据。生物标志物的真正价值在于监测对治疗的反应。由于这些标志物反映了实际的细胞活动，因此它们可以快速、几乎实时地提供有关抗吸收或合成代谢疗法效果的信息。前瞻性研究表明，生物标志物的变化还可以提供药物治疗后骨密度后续长期变化的早期预测。
在动物中的潜在应用
人类疾病的动物模型：目前，这些检测方法的主要非医疗市场是研究人类疾病的动物模型。血清和尿液检测方法是一种简单、经济有效的方法，可以替代骨质疏松症、骨转移和炎性关节炎的成像和组织形态学检测方法。由于这些检测方法为非侵入性，因此可以纵向收集同一动物的数据，从而减少动物数量并最大限度地降低研究成本。此外，由于数据是从同一动物反复收集的，因此可以使用重复测量设计来增强统计分析的能力。
骨生物学基础研究：据报道，狗的骨形成和吸收指数呈现与年龄相关的趋势。标志物浓度在幼年动物中最高，随着动物达到骨骼成熟，标志物排泄急剧下降（表 4 ）。
运动的影响。Price等人使用一组标记物 (BALP、PICP 和 ICTP) 来评估运动对马的骨骼影响，而 Puustjarvi 等人报告了耐力训练对狗血清标记物变化的影响。
骨折愈合。最近，Francis 和 Millis 报道了桡骨切除术后血清 BALP、骨钙素和 Pyd 的变化趋势，并提出这些标志物的早期变化可能为后续骨折愈合的可能性提供早期指标。血清标志物也可用于评估狗的牵张成骨。
骨骼肿瘤。受人类领域有希望的数据的启发，Ehrhart 等人和 Garzotto 等人研究了 BALP 在犬骨肉瘤中的预后价值。这些研究的共识是，BALP 可用于预测生存时间，在出现症状时 BALP 显著升高的狗的中位生存时间较短。
骨关节炎。血清标志物已用于评估人类类风湿性关节炎患者对治疗的反应，但在伴侣动物中开展的研究很少。大多数关于马和狗关节炎的研究都集中在软骨（而不是骨骼）降解产物上。然而，血清或滑液中骨唾液蛋白等标志物的浓度可能有助于评估与骨关节炎和炎性关节炎相关的软骨下骨变化。
牙科疾病。关于使用骨标记物监测动物牙科病理的报道数量有限。在研究环境中，最容易通过直接测量从单个牙齿周围收集的龈沟液中的骨标记物来实现这种评估。在临床环境中，血清和尿液标记物已用于研究牙科病理对猫胶原蛋白吸收的影响。
对饮食和药物配方的影响进行临床前安全性研究。制药行业已表示有兴趣将这些检测方法作为评估骨骼安全性的非侵入性方法。然而，如果没有用已知的阳性和阴性对照（即具有可接受和不可接受的骨骼安全性的药物）对这些标记物的灵敏度和准确性进行初步验证，将这些标记物广泛引入常规毒性筛选方案似乎还有一段距离。
我们应该使用哪些标记？
哪种生物标志物适合于某项研究的问题很难解决。直观地说，给定标志物的效用取决于测定中的分析变异性、所研究人群中标志物固有的生物变异性以及标志物对所研究“刺激”的敏感性（即标志物值可能因疾病、药物或手术治疗等而发生多大变化）。作为骨骼疾病指标，各个标志物的可靠性似乎存在真正的差异。例如，PICP 和 BALP 被认为是佩吉特病治疗反应的最可靠指标，而 NTX 被认为是骨质疏松症抗吸收治疗反应的最合适标志物。
在动物中，尚无关于衰老、运动、疾病、手术或医学治疗导致的标志物表达趋势的等效数据。在这种情况改变之前，最合适的方法是尽可能使用一组形成和吸收的生物标志物。对于狗，目前的建议是使用 BALP、骨钙素、ICTP 和尿液检测（Dpd 或 NTX）。
血清和尿液哪个更好？
样本类型是否合适也存在争议，没有一种适用于所有情况的正确答案。最合适的检测应该与骨转换有最强的相关性，骨转换由骨活检确定，但目前动物中还没有关于这些相关性的数据。目前，决定使用哪种标记物更多地取决于便利性而非科学性，没有一种适用于所有情况的解决方案。对于血清检测来说，生物变异性不是问题，血清检测避免了同时测量尿肌酐排泄量的需要。相反，排尿收集通常对主人来说更容易，对动物的侵入性也更小。大多数商业尿液代谢物检测在各种动物物种中都显示出可接受的交叉反应性，而血清检测则具有高度的物种特异性。由于形成标记物（BALP、骨钙素和胶原前肽）只能在血清中测量，因此血清将成为大多数骨标记物临床和临床前研究的首选样本。如果还有尿液样本，则可以用它来确认血清吸收检测结果中观察到的任何趋势。
骨标志物的当前局限性
临床意义
骨活检和随后的组织形态学分析仍然是量化骨重塑的黄金标准。人类研究表明，骨形成和骨吸收的组织形态学指标与成骨细胞和破骨细胞活性的血清/尿液标志物之间存在相关性。
交叉反应和分析性能
已发布的分析性能数据来自人类血清和尿液。尽管兽医部门永远不会成为这些检测试剂盒的主要市场，但许多商业制造商越来越意识到这些检测试剂盒正在用于动物。他们的几个网站包含有关与一系列物种的交叉反应的有用信息，通常可以通过直接与技术支持部门的科学家交谈来获取更多信息。对于列出的所有动物物种，至少 1 个骨形成标志物和 1 个骨吸收标志物可以实现可接受的交叉反应。建议计划使用骨标志物进行临床或临床前研究的研究人员（或临床医生）利用这些数据，并仅使用已在目标物种中得到验证的商业检测试剂盒。如果要使用“新”检测试剂盒，则必须先获得交叉反应和分析性能（检测间和检测内变异性）的数据，然后才能认为该检测有效。
生物变异性
目前不建议将骨生物测定用作一般筛查工具。鉴于对骨骼生长和重塑的品种间和品种内变异性的了解有限，无法以任何程度的可信度解释从单个动物的单组骨标志物测定中获得的数据。因此，这些测定的唯一实际应用是纵向研究，最好是涉及足够大的队列，以使任何真正的差异变得显着。即使在这些限制范围内，样本收集程序也必须标准化，以减少昼夜节律对标志物水平的可能影响。
敏感度
尽管骨标志物具有足够的灵敏度，可用于检测代谢性骨病等全身性疾病，但它们作为局部甚至多灶性骨病的指标的效用仍存在争议。尽管标志物水平升高可能与严重的破坏性病变有关，例如溶骨性骨转移或骨髓炎，但较良性的骨骼病变，例如骨关节炎或植入物松动，可能不会导致循环骨标志物浓度明显升高。
结论
血清和尿液骨标志物检测有可能提供有关动物骨转换的宝贵非侵入性信息。现在需要更多信息来验证这些标志物的血清和/或尿液浓度与体内骨细胞活动之间的关系。与人类一样，动物标志物排泄的昼夜变化仍然存在问题，但只要精心设计和采集样本，这种变化就不会限制血清和尿液检测的效用。鉴于动物之间骨标志物固有的生物变异性，这些测试不太可能对诊断单个动物的肌肉骨骼疾病有很大价值。然而，这些标志物似乎在临床前和临床研究中都具有巨大的潜力，可以作为评估骨骼对医疗或外科手术干预反应的快速而灵敏的方法。
