OECD-啮齿动物90天重复剂量口服毒性研究指南

OECD化学品测试指南啮齿动物90天重复剂量口服毒性研究

引言

1.随着科学进步、监管需求的变化和动物福利考虑，OECD化学品测试指南定期进行审查。最初的408号指南于1981年采纳。1998年采纳了修订版本，以从研究中使用的动物获得更多信息，该修订基于1995年在罗马举行的OECD专家咨询会议关于亚慢性和慢性毒性测试的结果（1）。

2.本测试指南（TG）在2018年更新，增加了内分泌敏感终点，旨在提高检测测试化学品潜在内分泌活性的能力，并反映了对TG 407（啮齿动物28天重复剂量口服毒性研究）的更新。

初步考虑 

3. 在评估和评价化学品的毒性特性时，在从急性或重复剂量28天毒性测试中获得初步毒性信息后，可能会进行亚慢性口服毒性的确定。90天研究提供了可能因长时间反复暴露而产生的健康危害信息，涵盖了测试动物从断奶成熟到成年的生长期。该研究将提供有关主要毒性效应的信息，指示目标器官和测试化学品的积累可能性，并可以提供用于选择慢性研究剂量水平和建立人类暴露安全标准的无观察到不良效应水平（NOAEL）的估计。或者，这项研究产生的剂量相关响应数据可以用来估计危害评估的出发点，使用适当的建模方法（例如，基准剂量分析）。

4.修订后的指南更加强调内分泌终点，结合现有的对神经学、免疫学和生殖效应的敏感性。还强调了对动物进行仔细的临床观察的必要性，以获得尽可能多的信息。所需的终点包括测量甲状腺素（T4）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、促甲状腺激素（TSH）和甲状腺重量，这些对甲状腺途径的干扰有反应（2）。此外，还应确定血清总胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），因为这些参数的水平直接受甲状腺激素作用的控制，并有助于（与其他甲状腺终点一起）证明甲状腺效应（3）。可选终点包括其他激素测量以及精子参数的评估。附录B中列出了可能受内分泌效应影响的必需和可选措施。如果现有信息表明测试化学品或类似化学品有影响这些的潜力，或者可以通过作为本指南一部分收集的必需措施的观察结果触发，可以考虑评估可选措施。这项研究应该能够识别具有引起神经毒性、内分泌、免疫学或生殖器官效应潜力的化学品，这些可能需要进一步深入研究。

5.获得的与内分泌相关的参数结果应在“OECD内分泌干扰化学品测试和评估概念框架”（4）的背景下进行评估。在这个概念框架中，TG 408被包括在第4级作为一个体内测定，提供有关内分泌相关终点的不利影响的数据。

6.所有基于动物的程序应符合动物护理标准；下面描述的护理和待遇是最低性能标准，并将被更严格的当地法规所取代。关于动物人道待遇的进一步指导提供在OECD测试和评估系列19（19）中。

7.本测试指南中使用的定义在附录A中提供。

测试原则 

8. 测试化学品以递增剂量每天口服给几组实验动物，每组一个剂量水平，至少持续90天。在给药期间，根据OECD的建议密切观察动物的毒性迹象（19）。在测试期间死亡或被安乐死的动物将进行尸检，测试结束时，剩余的动物也将在完整的给药期后被安乐死并进行尸检。

方法描述 

动物种类的选择 

9. 首选物种是大鼠，尽管也可以使用其他啮齿动物物种（例如，小鼠）。如果在另一种啮齿动物物种中研究了本TG 408中指定的参数，应提供选择物种的详细理由，包括对参数测量的调整。虽然从生物学上讲，其他物种应对毒物的反应与大鼠相似，但使用更小的物种可能会导致由于解剖更小器官的技术挑战而导致终点测量的变异性增加。应使用常用的健康年轻成年动物实验室品系。雌性应为未生育且未怀孕。给药应尽快在断奶后开始，且无论如何在动物九周龄之前。在研究开始时，使用的动物的体重变化应最小，不超过每性别平均体重的±20%。如果该研究是在长期慢性毒性研究之前进行的，则应在两项研究中使用相同品系和来源的动物。

饲养和饲养条件 

10. 所有程序应符合当地实验室动物护理标准。实验动物室的温度应为22°C（±3°C）。虽然相对湿度应至少为30%，最好不超过70%，除了在房间清洁期间，目标应为50-60%。照明应为人工照明，顺序为12小时光照，12小时黑暗。对于饲养，可以使用常规实验室饮食，无限量供应饮水。饮食的选择可能受到确保测试化学品以这种方式给药时的适当混合需求的影响。应注意避免可能含有可能干扰研究结果解释的高浓度激素活性物质的饮食或动物床铺（例如，植物雌激素）。已知高水平的植物雌激素在实验室饮食中会增加啮齿动物的子宫重量。作为指导，植物雌激素的饮食水平不应超过350微克/克啮齿动物实验室饮食的大豆苷当量。

11.动物应按性别分组饲养。如果科学上有理由，并且单笼饲养的持续时间限制在必要的最低期限，动物可以单独饲养。（5），（6），（7）。

动物的准备

12. 应使用已经适应实验室条件至少5天且未经过先前实验程序的健康动物。测试动物应按物种、品系、来源、性别、体重和/或年龄进行特征描述。动物应随机分配到对照组和处理组。笼子的排列方式应最小化可能由于笼子放置引起的效应。每个动物应分配一个独特的识别号码。应使用最不侵入性的动物唯一识别方法。适当的方法包括环状标记、标记、微芯片和生物识别。

剂量的准备

13. 测试化合物通过口服灌胃、掺入饮食或溶解在饮水中给药。口服给药的方法取决于研究的目的和测试材料的物理/化学性质。

14.如有必要，测试化学品应溶解或悬浮在适当的载体中。建议尽可能首先考虑使用水溶液/悬浮液，其次是油溶液/乳液（例如，玉米油），然后是可能的其他载体中的溶液。对于除水以外的载体，必须了解载体的毒性特性。应在给药条件下确定测试化学品的均匀性和稳定性。

程序 

动物数量和性别 

15. 每个剂量水平至少应使用20只动物（10只雌性和10只雄性）。如果计划进行中期死亡，数量应增加计划在研究结束前死亡的动物数量。根据对化学品或类似化合物的先前知识，应考虑包括至少10只动物（每性别5只）的额外卫星组在对照组和最高剂量组中，以观察治疗期后的潜在可逆性或持续性毒性效应。该后处理期的持续时间应根据观察到的效应适当确定。

剂量 

16. 至少应使用三个剂量水平和一个对照组，除非进行限制性测试（见第18段）。剂量水平可根据重复剂量或范围发现研究的结果确定，并应考虑对测试化合物或相关材料现有的毒理学和毒代动力学数据。除非受到测试化学品的物理化学性质或生物效应的限制，否则应选择最高剂量水平以引起毒性但不引起死亡或严重痛苦（见OECD测试和评估系列19号文件）。应选择递减的剂量水平序列，以展示任何剂量相关的响应和最低剂量水平的NOAEL。通常，2到4倍的间隔是设置递减剂量水平的最佳选择，并且通常更倾向于增加第四个测试组而不是使用非常大的间隔（例如，超过约6-10倍）。

17.对照组应为未处理组或如果使用载体给药则为载体对照组。除了用测试化学品处理外，对照组中的动物应与测试组中的动物以相同的方式处理。如果使用载体，对照组应接受使用的最高体积的载体。如果测试化学品通过饮食给药，并导致饮食摄入量减少，则可能有助于区分由于饮食的适口性或测试动物的毒理学改变而导致的食物摄入量减少的配对喂养对照组。

18.应考虑以下载体特征，视情况而定：对测试化学品的吸收、分布、代谢或保留的影响；可能改变其毒理特性的测试化学品的化学性质的影响；以及对动物的食物或水消耗或营养状况的影响。

限制性测试 

19. 使用本研究描述的方法，如果一个剂量水平的测试至少相当于每天1000毫克/千克体重，并且没有观察到不良影响，并且如果根据结构相关化合物的数据不预期毒性，则可能不需要进行使用三个剂量水平的完整研究。限制性测试适用，除非人类暴露表明需要使用更高的剂量水平。

剂量的给药 

20. 动物每周七天，每天至少90天用测试化学品给药。如果需要其他给药方案（例如，每周五天），需要有理由。当通过灌胃给药时，应使用胃管或适当的插管套管一次性给动物给药。一次可以给药的最大液体体积取决于测试动物的大小。体积不应超过1毫升/100克体重，除非在水溶液的情况下，可以使用2毫升/100克体重。除了通常随着浓度的增加而表现出更严重效应的刺激或腐蚀性物质外，应通过调整浓度以确保所有剂量水平的恒定体积，以最小化测试体积的变化。

21.对于通过饮食或饮水给药的化学品，重要的是要确保测试化学品的适口性不会干扰正常营养或水平衡。当通过饮食给药时，可以使用恒定的饮食浓度（ppm）或根据需要调整以保持恒定的剂量水平（例如，每天每千克体重毫克数）；必须指定使用的替代方法。对于通过灌胃给药的化学品，剂量应在每天的相似时间给药，并根据需要调整以保持动物体重的恒定剂量水平。

观察

 22. 观察期应至少为90天。如果研究中包括卫星组，则应将计划进行后续观察的卫星恢复组动物保持适当的时间，以检测毒性效应的持续性或恢复。

23.应至少每天进行一次一般临床观察，最好每天在同一时间进行，考虑到给药后预期效应的高峰期。应记录动物的临床状况。至少每天两次，通常在每天的开始和结束时，检查所有动物是否有病态和死亡迹象（19）。

24.在第一次暴露前至少一次（以允许在主题内进行比较），并在之后每周一次，应对所有动物进行详细的临床观察。这些观察应在动物的家笼外进行，最好在标准场地上，并在每次场合的相似时间进行。应仔细记录，最好使用测试实验室明确定义的评分系统。应努力确保观察条件的变化最小。应注意的迹象包括但不限于皮肤、皮毛、眼睛、粘膜的变化，分泌物和排泄物的发生，以及自主活动（例如，流泪、毛发竖立、瞳孔大小和不寻常的呼吸模式）。还应记录步态、姿势和对处理的反应的变化，以及存在阵挛性或强直性运动、刻板行为（例如，过度梳理、重复旋转）或奇异行为（例如，自残、向后行走）（8, 19）。

25.应在测试化学品给药前和研究结束时，使用眼底镜或适当的设备进行眼科检查，最好在所有动物中进行，但至少在高剂量和对照组中进行。如果检测到眼睛的变化，应检查所有动物。

26.在暴露期结束时，但不早于第11周，应进行对不同类型的刺激的感官反应（5）（例如，听觉、视觉和本体感受刺激）（9），（10），（11），握力评估（12）和运动活性评估（13）。可以参考各自参考资料中提供的程序细节。然而，也可以使用与参考程序不同的程序。

27.如果其他研究中有功能观察数据，或者当日常临床观察没有发现任何功能缺陷时，可以省略研究结束时的功能观察。

28.作为例外，对于表现出毒性迹象的组，如果这些迹象会显著干扰功能测试表现，也可以省略功能观察。

体重和饮食/水消耗 

29. 所有动物应至少每周称重一次。应至少每周测量饮食消耗。如果测试化学品通过饮水给药，还应至少每周测量水消耗。对于饮食或灌胃研究，也可以考虑测量水消耗。

血液学和临床生物化学

 30. 应从指定地点采集血样，并在适用的情况下在适当的条件下储存。在测试期结束时，收集样本，最好在动物被杀死的过程中或作为杀死程序的一部分。

31.应在测试期结束时，以及在收集任何中期血液样本时进行以下血液学检查：红细胞压积、血红蛋白浓度、红细胞计数、网织红细胞计数、总和差异性白细胞计数、血小板计数和血液凝固时间/潜力的测量。

32.应在每只动物被杀死的过程中或作为杀死程序的一部分，从每只动物获得的血样中进行临床生物化学测定，以调查组织中的主要毒性效应，特别是对肾脏和肝脏的影响（除了那些被发现病态和/或中途被杀死的动物）。与血液学调查类似，可以进行中期抽样以进行临床生物化学测试。建议动物在采血前禁食过夜。在血浆或血清中的测定应包括钠、钾、葡萄糖、总胆固醇、HDL、LDL、尿素、血尿素氮、肌酐、总蛋白和白蛋白，以及超过两种表明肝细胞效应的酶（例如，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶和山梨醇脱氢酶）。在某些情况下，可能提供有用信息的额外酶（肝脏或其他来源）和胆汁酸的测量，以及胆红素也可以包括在内。

33.应将临床生物化学评估作为一般组织损伤的潜在标记。如果测试化学品的已知特性可能或被怀疑影响相关的代谢剖面，应进行其他测定，包括钙、磷、禁食甘油三酯、特定激素、高铁血红蛋白和胆碱酯酶。这些测定可能针对某些类别的化学品或逐个案例确定。

1 对于血清和血浆中的许多测量，尤其是对于葡萄糖，最好进行过夜禁食。这种偏好的主要原因是，如果不进行禁食，不可避免地会导致变异性增加，这将倾向于掩盖更微妙的效应并使解释变得困难。另一方面，过夜禁食可能会干扰动物的一般代谢，特别是在饲养研究中，可能会扰乱对测试化学品的日常暴露。如果采用过夜禁食，应在进行功能观察后进行临床生化测定。

34.应在主要组和卫星和/或恢复组中的每只动物的研究结束时测量血清总T4、T3和TSH。其他激素，如睾酮、雌二醇、促卵泡激素（FSH）、黄体生成激素（LH）应根据情况考虑。血清可以冷冻保存，以便根据其他终点观察到的结果（例如，器官重量和组织学）确定最具信息量的激素分析。

35.如果适当验证和历史对照数据可用，也可以在血浆中测量激素。

• 以下因素可能影响激素测定的变异性和绝对浓度：

• 人道杀死的时间，因为激素浓度有昼夜变化

• 动情周期的阶段

• 人道杀死的方法，以避免对动物造成不必要的压力，这可能会影响激素浓度

• 激素测定的测试套件可能因其标准曲线而不同。

36.专门用于激素测定的血样应在一天中可比的时间获得。分析激素浓度时获得的数值因各种商业测定套件而异。因此，可能无法根据统一的历史数据提供性能标准。应考虑在同一实验室、同一啮齿动物品系、使用相同方法测量的对照激素水平，以区分偶然和治疗相关的变化。应尽可能使用血液样本收集、处理和分析的最佳实践（23）。实验室应尽可能保持控制变异系数在T3和T4低于25，TSH低于35。所有浓度都应记录为纳克/毫升。在选定的储存条件下，T3、T4和TSH的稳定性应作为激素测定验证的一部分进行测试。

37.可选地，在研究的最后一周，可以在定时尿液体积收集期间进行以下尿液分析测定：外观、体积、渗透压或比重、pH值、蛋白质、葡萄糖和血液/血细胞。

38.如果历史基线数据不充分，应考虑是否需要在给药开始前确定血液学和临床生化变量；然而，通常不建议在治疗前生成这些数据（14）。

病理学 

39. 在终止时，记录所有男性的睾丸和附睾重量。至少应保留每个男性的一个附睾进行组织病理学检查。剩余的附睾可用于可选的附睾精子储备、精子形态或精子活力的计数（15）。

40.对于精子形态的可选评估，应作为固定或湿准备检查附睾（或输精管）精子样本，并至少对每个样本分类200个精子，作为正常（头部和中段/尾部都正常）或异常。精子形态异常的例子包括融合、孤立的头部和畸形的头部和/或尾部。畸形或大的精子头部可能表明精子形成缺陷。精子活力可以立即在人道杀死后评估或记录以供以后分析。可以通过视觉或计算机辅助运动分析确定具有前向运动的精子的百分比。

41.精子参数分析可以限制在对照和高剂量男性。然而，如果观察到与治疗相关的效果，还应评估低剂量组。

42.在尸检时，应通过阴道涂片确定所有女性的动情周期。这些观察将提供有关人道杀死时动情周期阶段的信息，并协助组织学评估雌激素敏感组织（见OECD指南文件106，第3部分（17））。

大体解剖 

43. 研究中的所有动物都应接受全面、详细的大体解剖，包括仔细检查身体的外部表面、所有孔口以及颅腔、胸腔和腹腔及其内容物。所有动物的肝脏、肾脏、肾上腺、睾丸、附睾、前列腺+精囊与凝固腺作为一个整体（或者，首先称重整个前列腺与精囊/凝固腺，然后解剖并单独称重前列腺），子宫、卵巢、胸腺、脾脏、大脑和心脏（应适当去除任何附着的组织，并在解剖后尽快称重，以避免干燥。垂体腺可以新鲜称重，也可以在固定后立即称重。在修剪前列腺复合体时要非常小心，以避免刺破充满液体的精囊。或者，精囊和前列腺可以在固定后修剪和称重。

44.必须非常小心地称重甲状腺，因为这种组织容易受损（有关指导，见参考20）。组织损伤可能会影响组织病理学分析。因此，甲状腺修剪和称重应该非常小心地进行，并且最好在固定后进行，以避免组织损伤。

45.应将以下组织保存在最适合的固定液中，以适应组织的类型和预期的随后组织病理学检查（16, 17）：所有毛、大体损伤、大脑（包括大脑、小脑和延髓/脑桥的代表性区域）、脊髓（三个水平：颈部、中胸和腰部）、垂体、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠（包括Peyer's patches）、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、脾脏、心脏、气管和肺（通过充气固定液然后浸泡保存）、主动脉、卵巢、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、附睾、前列腺、精囊、凝固腺、乳腺（雄性和雌性）、膀胱、胆囊（小鼠）、淋巴结（最好一个淋巴结覆盖给药途径，另一个淋巴结远离给药途径以覆盖系统效应）、周围神经（最好靠近肌肉的坐骨或胫神经）、骨骼肌和骨骼，以及骨骼（切片或者，或者新鲜的骨髓抽吸）、皮肤和眼睛（如果在眼科检查期间观察到变化）。建议将睾丸保存在Bouin's或改良的Davidson's固定液中，并且组织病理学评估应考虑精曲小管横截面的分期，如描述（16）。另见OECD GD 106（17）关于内分泌器官的固定和组织学评估。临床和其他发现可能表明需要检查额外的组织。此外，任何根据测试化学品的已知特性可能被视为目标器官的组织都应进行评估。

46.应对所有动物的控制和高剂量组的保存器官和组织进行全面的组织病理学检查。如果高剂量组观察到与治疗相关的变化，这些检查应扩展到所有其他剂量组的动物。

48.应对所有大体损伤进行检查。

49.当使用卫星组时，应对在处理组中发现效果的组织和器官进行组织病理学检查。

数据和报告 

数据 

50. 应提供个体数据。此外，所有数据应以表格形式总结，显示每个测试组在测试开始时的动物数量；在测试期间发现死亡的动物数量或因人道原因被杀死的动物数量以及任何死亡或人道杀死的时间；显示毒性迹象的动物数量，观察到的毒性迹象的描述，包括任何毒性效应的开始时间、持续时间和严重程度；以及显示损伤的动物数量，损伤类型和显示每种损伤类型的动物百分比。

51.在适用的情况下，应通过适当且普遍接受的统计方法评估数值结果。选择统计方法和要分析的数据应在研究设计期间进行。

测试报告 

53. 测试报告必须包括以下信息： 

测试化学品：

 代码，如IUPAC或CAS名称、CAS注册号码、SMILES或InChI代码、结构公式和其他标识符 

 来源、批次号、使用期限（如果可用） 

 化学品的稳定性，如果已知 

 物理性质和，如果相关的话，相关的物理化学性质 

 识别，包括如果已知/建立的CAS号码； 

 纯度。 

单一组分物质： 

 物理外观、水溶性和相关的物理化学性质。多组分物质、UVBCs和混合物： 

 尽可能地通过化学身份（见上文）进行表征，包括组分的定量发生和相关的物理化学性质。

 如果适用的话，

载体： 

 选择载体的理由，如果除水以外。测试动物： 

 使用的物种和品系 

 动物的数量、年龄和性别 

 来源、饲养条件、饮食等。 

 测试开始时动物的个体重量； 

 如果不是大鼠，物种的理由。 

测试条件： 

 剂量水平选择的理由 

 测试化学品配方/饮食准备的详细信息，实现的浓度，制剂的稳定性和均匀性 

 测试化学品的给药详细信息 

 实际剂量（毫克/千克体重/天），如果适用的话，从饮食/饮水中测试化学品浓度（ppm）转换为实际剂量的转换因子； 

 饮食和水的质量详细信息。 

结果： 

 体重和体重变化 

 饮食消耗，如果适用的话，水消耗 

 按性别和剂量水平的毒性反应数据，包括毒性迹象 

 临床观察的性质、严重性和持续时间（是否可逆） 

 眼科检查结果 

 感官活动、握力和运动活性评估（如果可用） 

 血液学测试与相关基线值 

 临床生化测试与相关基线值 

 循环甲状腺激素（T4、T3、TSH；必需） 其他激素测量（可选） 

 确定激素值的方法（测定类型、供应商、协议等） 

 终点体重、器官重量和器官/体重比 

 尸检结果 

 终点阴道细胞学 

 所有组织病理学发现的详细描述 总附睾精子数量、前向运动精子百分比、形态正常精子百分比以及每种已识别异常精子的百分比（可选） 

 如果分析了吸收（例如，ADME或TK信息）数据

  结果的统计处理，如果适用 

 对于提前杀死的动物，应报告决定的理由；以及 

 对于研究期间发现死亡的动物，如果可能的话，应确定死亡原因。

讨论结果。 

结论。

参考文献

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