VCP50-2 Sysmex XT-2000iV 在未经治疗的 Wistar 大鼠中产生的定量骨髓分化计数的验证

https://doi.org/10.1111/vcp.12132

介绍

多年来，自动血液分析仪一直用于常规外周血细胞计数和白细胞分化。在过去的大约 10 年里，各种各样的研究人员尝试使用自动血液分析仪对人类骨髓进行细胞学分析，并取得了不同程度的成功。在同一时期，我们已经验证并实施了一种用于大鼠骨髓分析的流式细胞术方法。骨髓评估是药物开发中了解新药潜在血液毒性作用的重要步骤。虽然个体动物数据始终很重要，但新化合物血液毒性作用的确定受到分组数据的强烈影响，尤其是治疗组与对照组进行比较。在这些条件下，确保大量动物的定量可重复性就显得更加重要。此外，由于几乎所有啮齿动物都要接受终末尸检，因此对骨髓细胞悬浮液进行骨髓评估成为一种合理的选择。

市场上销售的各种自动血液分析仪均能对外周血进行准确且可重复的细胞计数和白细胞分类计数。然而，当使用这些分析仪分析骨髓悬液时，总有核细胞计数 (TNCC) 通常会因样本中的脂肪滴、微纤维或细胞聚集体等污染因素而受到影响。分析性能的局限性以及对众多细胞类型和前体细胞分离不充分，限制了自动骨髓分类计数取代骨髓载玻片的细胞学检查。相反，在临床环境中，使用血液分析仪进行骨髓分析可作为显微镜评估之前的初步评估。它能快速评估诸如整体细胞构成、原始细胞比例过高以及髓系与红系比率 (M:E) 等特征。

使用 Cell Dyn 4000 和 Sysmex XE-2100 在两台血液学分析仪上进行的人类骨髓分析与人工评估相比存在偏差。这两种分析仪都显示出对 TNCC 和髓系细胞的良好相关性。然而，与显微镜下的骨髓造影图相比，这两种方法也显示出对淋巴细胞和 M：E 的低估，以及对红系前体细胞的估计过高。这表明，仅通过前向和侧向散射分析无法充分区分晚期红系有核细胞和淋巴细胞。具体而言，特定成熟阶段的骨髓淋巴细胞和有核红细胞在大小和形态细节上可能相似。使用细胞分选技术，我们之前已确定，当通过流式细胞术评估时，啮齿动物的骨髓淋巴细胞和有核红细胞占据相同的细胞图位置。如果能够通过制定和验证 Sysmex 细胞图内特定骨髓群体的门控标准来区分混合淋巴细胞-有核红细胞群体，那么使用 Sysmex XT-2000iV 血液学分析仪进行可靠、自动化的骨髓分化似乎是可行的。

由于 Sysmex XT-2100iV 血液分析仪无法进行谱系特异性荧光标记，因此无法通过细胞分选识别髓系、红系或淋巴系细胞。然而，Sysmex XT-2000iV 具有独特的可自定义门控选项，从而允许操作员选择和分析离散群体。我们随后利用磁珠分离髓系细胞和淋巴细胞，准确识别未治疗大鼠 Sysmex 骨髓细胞图上的髓系、红系和淋巴系细胞类型的位置。本文描述了在未治疗对照大鼠中对 XT-2000iV 骨髓分类计数的验证过程。

材料和方法

动物

本次评估使用了随机繁殖的 Charles River Wistar Han IGS (CRL: WI [Han]) 大鼠（Charles River Breeding Laboratories，美国北卡罗来纳州罗利）。所有动物均单独饲养在 75°F ± 5°F 和 50 ± 10% 相对湿度下。进行这些研究的动物设施获得了 AAALAC 国际认证。所有动物饲养和实验程序均符合美国农业部《动物福利法》规定、《实验室动物护理和使用指南》，并获得了机构动物护理和使用委员会的批准。本研究各部分使用的动物数量如表1所示 。

骨髓样本采集、处理和分析

用异氟烷气体麻醉大鼠，然后放血处死。每只动物死后立即切除一根股骨，用 5 毫升注射器和 20 号针头将骨髓冲洗到装有约 5 毫升胎牛血清的 15 毫升锥形管中（1:1）。用移液器混合内容物，并立即将试管放在湿冰上。倒置混合样品内容物，在 2–8°C 下以约 300 g离心 5 分钟。倒出上清液，不要扰动骨髓沉淀。向每个收集管中加入 2 毫升 1x PBS。使用 19 号针头将沉淀吸入 1 mL 注射器，然后将悬浮液排回管中。重复此过程数次以分离骨髓聚集物。然后用 1x PBS 将样品稀释至 10 mL 体积。骨髓样品储存在湿冰上，直到收集后 8 小时内处理完成。这包括骨髓细胞悬浮液的细胞离心制备。

在配备兽医软件的 Sysmex XT-2000iV上进行 TNCC。该仪器使用基于半导体激光的流式细胞术方法的光学检测器块对 WBC 进行分析。在分析骨髓样本时，将在 Sysmex XT-2000iV 上获得的 WBC 值乘以 10（清洗后的骨髓样本中的稀释倍数）以表示 TNCC。在所有实验过程中，Sysmex 分析仪的光学系统均未发生任何变化。在 Sysmex 分析仪上选择了大鼠特定曲线来确定 TNCC 值。此外，建立的骨髓门控也是大鼠特定的。

淋巴系、髓系和红系门控的验证

为了验证大鼠骨髓淋巴系、髓系和红系在 Sysmex 细胞图内的真实位置，进行了抗体特异性磁捕获和淋巴系和髓系分离。如上所述，从 10 只未经治疗的雄性 Wistar 大鼠中采集骨髓，以验证谱系位置并为每个定义的种群设置适当的门控。将清洗后的细胞与生物素化的抗大鼠 CD11b 一起孵育，以分选髓系细胞（554981；BD Bioscience，美国加利福尼亚州圣何塞），或与磁分离试剂如 OctoMacs 磁分离装置（130-042-108；Miltenyi Biotec，美国加利福尼亚州奥本）、MS 柱（130-042-201）、抗大鼠 CD45RA 微珠（130-090-494）或大鼠抗 T 细胞微珠（130-090-320）和抗生物素微珠（130-090-485）一起孵育。

髓系和淋巴细胞的捕获和评估

将 1 mL 处理过的骨髓制剂加入 1 mL BD Pharm Lyse 裂解缓冲液 (555899; BD Biosciences) 中，并在室温下混合 10 分钟。将试管离心，将细胞沉淀物清洗一次，并将最终的沉淀物悬浮在 80 μL BD Pharmingen 染色缓冲液 (555899; BD Biosciences) 中。对于骨髓细胞捕获，将总共 15 μL 大鼠特异性抗 CD11b 添加到每个沉淀物中，混合，并在 4°C 下孵育 10-15 分钟，然后再与抗生物素微珠一起孵育 10 至 15 分钟。将 1 至 2 mL 染色缓冲液添加到每个试管中，旋转试管，清洗细胞沉淀物，然后重新离心试管。将细胞沉淀悬浮在 500 μL 染色缓冲液中，并在磁场下流过准备好的 MACSMS 分离柱 (Miltenyi Biotec Inc.)。用染色缓冲液清洗柱子一次。将柱子从磁场中移出，并在每个柱子上涂抹 1.5 mL 染色缓冲液。使用提供的柱塞冲洗掉所有剩余的样品。收集流通液，旋转并悬浮在 500 μL PBS 中。然后在 Sysmex 平台上直接分析该样品。对于淋巴细胞捕获，样品的处理和加工与骨髓捕获相同，但使用了 15 μL 大鼠特异性抗 CD45RA 和抗 T CD3 淋巴细胞微珠。在骨髓和淋巴捕获实验中，从 10 个流通样品中分别制备一个细胞离心载玻片，以在显微镜下确认相应样品中不存在骨髓或淋巴细胞。

Sysmex 门控增殖和成熟的髓系和红系细胞群

大鼠骨髓中的细胞群在所有实验中都占据着一致的位置。磁珠介导的纯化细胞群允许对不同的骨髓细胞系进行自定义门控。为了进一步评估和调整我们的门控，对在骨髓磁珠纯化过程中准备的 10 个全骨髓细胞离心载玻片进行了微观差异计数。调整了 Sysmex 门控，以获得与增殖（成髓细胞、早幼粒细胞和中幼粒细胞）与成熟髓系细胞（晚幼粒细胞、带状中性粒细胞和分叶中性粒细胞）的微观差异相当的结果。在磁珠淋巴细胞纯化过程中，对 10 个全骨髓样本采用类似方法，确定增殖期（红细胞、原红细胞和嗜碱性红细胞）和成熟期红细胞（嗜多染红细胞和后红细胞）以及淋巴细胞群的 Sysmex 门限。在抗体标记的样本上直接测定淋巴细胞数量，并通过计算得出成熟期红细胞群（总混合淋巴细胞-红细胞群 - 淋巴细胞群 = 成熟期红细胞群）。

整体门控

通过对细胞图进行整形并与微观分化计数进行比较，构建了 5 部分分化的门控图。一旦确认，门控就被证明是稳定的，并且在任何剩余的实验中都没有改变。重要的是，这个基本的门控程序是一个通用过程，需要在每个实验室重新建立并用每台新仪器进行确认。

样本内精度

为了评估单个样本的运行间重现性（精度），我们收集了 10 个大鼠股骨骨髓样本，并按照之前描述的方法进行处理。7、8 10个骨髓样本中的每一个都在 Sysmex 分析仪上连续运行 10 次。使用磁珠分离实验中的门控预设确定增殖髓系、成熟髓系、增殖红系、成熟红系、淋巴系（5 部分差异）和 M:E 比率。

左右股骨可比性

为了进一步评估该检测的可重复性，收集了 5 只雄性大鼠的左右股骨并进行相应处理。在 Sysmex 上对样本进行 5 部分微分分析，并从 10 个样本中计算出 M:E 比率。

Sysmex XT-2000iV 与 5 个月大未治疗大鼠的微观 5 部分骨髓分化比较

为了评估 Sysmex XT-2000iV 生成的 5 部分和微观分化计数之间的可比性和一致性，使用两种方法分析了从 50 只未经治疗的 Wistar 大鼠（25 只雄性和 25 只雌性）采集的骨髓。比较以盲法进行，显微镜师无法访问 Sysmex 数据。大鼠年龄约为 2-5 个月。对于每个微观骨髓分化，经验丰富的血液学家至少对 500 个细胞进行分类。冲洗过的股骨骨髓样本按照之前描述的方式进行处理，然后使用我们从初始磁珠分离实验中确认的门控直接在 Sysmex 平台上进行分析。

统计评估

所有统计数据均使用 SAS R 版本 3.0.1 生成。对于样本内精密度实验，计算了作为组代表的第一只大鼠的单个数据点、平均值 ± 标准差 (SD) 和动物内变异系数 (CV)。还计算了 10 只大鼠组内的动物间百分比变异以及 5 部分微分和 M:E 比率的最大差异。准备了箱线图和晶须图，以显示对 10 只大鼠进行 10 次重复分析的样本内最小值、中位数以及 25% 和 75% 四分位数。

还确定了 5 个右股骨样本和 5 个左股骨样本的 M:E 和 5 部分微分的平均值和 SD，并计算了相关系数，用于比较雄性大鼠的左股骨组和右股骨组。记录了任何相应的右/左股骨对的 M:E 和 5 部分微分之间的最大差异。

还计算了两性的 Sysmex 和微观分类计数的平均值 ± SD 和相应变量之间的最大差异。使用公开的绘图代码生成 Bland-Altman 图，并构建该图来评估 Sysmex 和微观分类计数结果之间的系统一致性水平。两种方法评估的 5 部分差异变量之间的平均差异是估计偏差，差异的标准差提供了围绕平均值的波动量度。计算了 95% 一致性限度（平均差异 ± 1.96 个差异标准差）。

结果

大鼠骨髓细胞图区域的鉴定

尽管骨髓是一种更为复杂的细胞类型混合物，这主要归因于其多种成熟阶段，但外周血细胞图可以合理估计各种骨髓群体的位置。如图 1所示，x轴表示通过流式细胞术原理评估的侧向散射光，y轴表示人类血液中的 RNA 和 DNA 荧光。随着造血细胞的成熟，它们的体积也会变小。较小、较成熟的细胞位于 Sysmex 细胞图的底部附近，而较大、较不成熟的细胞（包括原始细胞）则位于Sysmex 散点图y轴的较高位置。外周血中性粒细胞 (N) 位于淋巴细胞 (L) 群的右侧，嗜酸性粒细胞 (E) 位于 Sysmex 细胞图的最右侧。外周血单核细胞 (M) 位于淋巴细胞和未成熟粒细胞 (IG) 群之间。有核红细胞 (NRBC) 在外周血中通常是晚期 (多色或正色) 幼红细胞。这些小 NRBC 通常位于外周血淋巴细胞群下方和成熟中性粒细胞左侧。血影细胞、血小板团块和其他外周血碎片通常在细胞图底部分离（图 1 C 和 D）。

根据通过磁珠分离髓系和淋巴系细胞纯化的细胞群，将大鼠全骨髓的门控分为 4 个区域（图 1B，区域 A、B、C 和 D），这与大鼠外周血中主要细胞类型的门控一致。重要的是，各种群体的分离模式在未经治疗的大鼠中是一致的。用 CD11b 分选的大鼠骨髓髓系细胞位于 Sysmex 散点图的区域 A（成熟髓系）和 B（增殖髓系）（图 1C）。髓系细胞的细胞和细胞核尺寸随着成熟程度的增加而减小。因此，在散点图中，成髓细胞、早幼粒细胞和中幼粒细胞位于成熟髓系细胞上方（图 1C，区域 B）；它们代表增殖髓系区域。通过与未经治疗的大鼠的微观分类计数进行比较，设定了增殖和成熟髓系细胞（例如成熟中性粒细胞、带状中性粒细胞和晚幼粒细胞）之间的鉴别线。

CD11b 抗体还可与骨髓嗜酸性粒细胞（图 1 C、E，黄色圆圈）和巨噬细胞（图 1 C、M，白色圆圈）结合。未捕获或流通细胞群由非髓系细胞组成，主要包括淋巴细胞和红细胞，位于细胞图的 C 和 D 区域（图 1 D）。磁捕获和流通等分试样的细胞图底部附近还有一小群额外的细胞（不到整个细胞群的 2%），可能代表死细胞和细胞碎片（图 1 C、D，红色圆圈）。

相反，>99% 的纯化淋巴细胞位于区域 C（图 2 B），大量淋巴细胞与未纯化的全骨髓中的红细胞群共存（图 2 A）。显微镜检查证实了这一点，其中与区域 C 中的群体相对应的细胞由多染性红细胞、后红细胞和淋巴细胞的混合群体组成。因此，它被定义为包含成熟红细胞和淋巴细胞的混合区域。相反，增殖的红细胞，如原红细胞和嗜碱性红细胞，位于区域 D（图 2 A）。区域 A 中也存在少量红细胞，被认为代表 < 2% 的幽灵细胞（图 2 B）。

样本内精度

5分类骨髓计数和计算出的 M：E 比率的样本内精度非常好，单个代表性动物的 CV 范围为 1.1-4.0%（表 2 ）。10 只大鼠的 5 部分分类计数所有成分的动物间 CV 范围为 1.6-17.1%，反映了 10 只不同动物的预期生物学变异范围。图3显示了在 10 只大鼠中每只获得的 10 次重复分析的最小值、中位数（中心线）、最大值、25% 和 75% 四分位数。10 只大鼠 中任何 5 部分分类成分的最大差异范围为 0.8-1.8%，而同一样本内 M：E 比率的最大差异为 0.11 个单位。

左右股骨可比性

5 根左股骨的组均值 M:E 为 1.18，而 5 根右股骨的组均值 M:E 为 1.17，表明雄性对照大鼠的两组股骨之间的均值基本相同（表 3）。增殖髓系细胞的相关系数为 0.671，成熟髓系细胞的相关系数为 0.976，增殖红系细胞的相关系数为 0.916，成熟红系细胞的相关系数为 0.996，淋巴细胞的相关系数为 0.881，M:E 比为 0.983。任何一对左右股骨之间的最大差异为增殖髓系细胞 2.0%，成熟髓系细胞 2.1%，增殖红系细胞 1.4%，成熟红系细胞 1.7%，淋巴细胞 1.0%，M:E 比为 0.08 单位。

雄性和雌性 M:E 比率的一致性水平非常好（图 4 A 和 B，表 4）。在所测试的 50 只大鼠中，M:E 值范围为 0.8 至 2.0，该范围与通过流式细胞术或显微镜分类计数获得的先前历史范围一致。Bland-Altman 图中所示的雄性（图 4 A）和雌性（图 4 B）的 M:E 比率差异很小（< 0.3），进一步证明了使用 Sysmex XT-2000iV 自动化方法或通过显微镜评估生成的 M:E 比率的可比性。Sysmex XT-2000iV 生成的 5 部分分类也与流式细胞术生成的历史参考值一致。在对照大鼠测试队列中，成熟的髓系细胞比例范围为 30% 到 55%，不同方法的平均差异为 ± 5%，表明两种方法之间具有良好的可比性（图 S1）。不同方法之间以及与之前确定的历史值相比，增殖的髓系细胞数量也相似（图 S1）。对于成熟的红系细胞，雄性方法之间的变异性高于雌性，但对于两性的成熟红系细胞，方法比较被认为是可以接受的，平均差异 <6%（图 S2）。增殖的红系细胞比例是等效的，并且两种方法之间对于这些变量具有良好的一致性，这从两种方法之间的百分比差异很小可以看出（图 S2）。在使用 Sysmex XT-2000iV 分析仪分析的磁分离样本和显微镜评估中，骨髓淋巴细胞比例的差异相似。此外，没有证据表明两种方法之间存在偏差，因为在真实一致性线上方和下方的值数量相似。由于方法之间的百分比差异仍然很小，因此方法也被认为是可以互换的淋巴细胞测定方法（图 5、表 4）。

讨论

尽管 Sysmex XT-2000iV 已得到广泛验证可用于评估大鼠外周血血液学，但这是第一份报告证明 Sysmex XT-2000iV 与磁珠分离、纯化和隔离骨髓淋巴细胞相结合时能够对未经治疗的Wistar 大鼠进行可靠、可重复和高质量的骨髓分析。尽管磁分离需要额外的时间来完成整个过程，但该应用仍然比我们之前的流式细胞术应用更有效。具体而言，使用本研究中提出的方案，骨髓群体是不同的，一旦为 5 部分骨髓差异成分（增殖和成熟的髓系、增殖和成熟的红系和淋巴系）定义了门控，就无需进一步调整。这消除了操作员在分析过程中设置门控的偏见。与作为黄金标准的显微镜骨髓分类计数相比，该方法的精确度、可重复性和准确度使它成为真正的替代方法，可用于在良好实验室规范条件下进行的研究。到目前为止，一天内已经处理了多达 80 个大鼠骨髓样本。虽然显微镜骨髓分类计数可以产生类似的结果，但它们需要更多时间，这可能会导致几天或几周的延迟，具体取决于动物数量和训练有素的工作人员的数量。Sysmex XT-2000iV 自动骨髓评估的潜在缺点是无法存档样本（除非有细胞离心机制剂），以及该仪器定制的通用门控程序，这需要一定的处理和加工细胞悬浮液的专业知识。

在啮齿类动物非临床研究中，需要进行骨髓评估以确定新化合物的潜在原发性血液毒性。在许多情况下，组织学评估加上外周血血液学终点可能就足够了。早期报告表明，是否需要对骨髓涂片进行细胞学评估应根据具体情况决定，并列举了多种需要更深入骨髓评估的治疗相关变化。例子包括骨髓细胞相对于外周血细胞计数的变化特征、所涉及细胞系列的分化，特别是红细胞和淋巴细胞群之间的区别（因为仅通过组织病理学很难辨别）、红细胞指数异常、血液中性粒细胞计数显著下降而没有证据表明对急性组织炎症有潜在反应，以及化合物的已知抗增殖作用、外周嗜酸性粒细胞计数显著增加或红细胞计数显著增加（但不是由于脱水或血液浓缩引起的）。这还包括对外周血中异常或非典型细胞的评估，但根据变化的程度，可能需要进行显微镜评估或流式细胞术表型分析。同一报告还指出，“流式细胞术在操作得当的情况下，可以代替骨髓造血细胞的手动分类计数，因此可以应用于上述许多细胞学评估情况。” 这也适用于自动化 Sysmex 定量骨髓测定；然而，无论是在流式细胞术还是 Sysmex 应用中，都应始终收集骨髓涂片或骨髓细胞悬浮液的细胞离心制剂，以备需要进行细胞形态学评估。

在过去 10 年中，我们一直使用流式细胞术骨髓鉴别程序来评估非临床研究中的血液毒性，并发现该方法可省去 90% 以上的大鼠显微镜骨髓评估（未发表的观察结果）。此外，在过去的一年里，我们已用 Sysmex 应用程序取代流式细胞术程序进行骨髓评估。重要的是，我们并不建议单独执行流式细胞术或 Sysmex 方法。相反，定量骨髓结果应始终与组织病理学检查结合进行。这使临床病理学家能够将定量结果与组织学发现进行比较，并确定是否需要进一步进行细胞学检查。Sysmex 和流式细胞术方法均未提供细胞形态学特征。重要的是，当需要对所有细胞类型或谱系成熟进行完整分类时，细胞学检查仍然至关重要，例如，为了评估任何谱系的形态学变化、确认可疑的巨幼细胞变化或评估巨核细胞相关影响。彻底了解血液学、细胞学和组织学对于正确评估治疗相关的造血生理学紊乱以及将定量结果置于适当的背景下至关重要。

Sysmex XT-2000iV 方法与我们之前的流式细胞术方法相比是一个进步，因为骨髓细胞图在整个分析过程中保持稳定。因此，在样本分析时即可获得结果。这与我们之前的流式细胞术方法形成了对比，在之前的流式细胞术方法中，每个样本的最终结果都需要耗时的手动门控。与我们之前的流式细胞术方法相比，Sysmex 方法的另一个主要优势是可以评估分化/成熟过程。Sysmex XT-2000iV 平台的 DIFF 通道在 y 轴上测量 DNA/RNA 与染料多甲炔的染色强度，在x轴上测量侧向散射光（细胞含量）。相反，我们的流式细胞术程序依赖于过氧化物酶染色。重要的是，过氧化物酶活性水平取决于物种。因此，尽管我们之前的流式细胞术应用在大鼠中效果很好，但由于骨髓细胞过氧化物酶活性的物种特异性差异（未发表的观察结果），它在小鼠和兔子中可能会出现问题。为了完整起见，应该指出，不依赖过氧化物酶的流式细胞术骨髓分析方法可能没有相同的局限性。尽管如此，由于 Sysmex 系统中的门控依赖于 DNA 染色，因此骨髓评估可以更容易地应用于多个物种。最近的研究表明，Sysmex 生成的 5 部分差异也适用于小鼠、狗和食蟹猴（未发表的观察结果）。

此外，Sysmex XT-2000iV 的多功能门控功能可以准确评估大鼠骨髓中的 TNCC、成熟和增殖的髓系细胞群、成熟和增殖的红系细胞群、淋巴细胞和 M:E 比率。由于骨髓淋巴细胞与红系前体细胞位于同一门控区域内，因此纯化的红系和淋巴细胞群的分析可以验证自动化 Sysmex 方法产生的淋巴细胞结果与微观分类计数相当。此外，本研究中获得的总体相对大鼠骨髓分类计数与过去 10 年使用抗体特异性流式细胞术确定的范围相当。此外，骨髓 5 部分分类计数中原始细胞的门控与之前使用 Sysmex 平台在患有白血病的狗的外周血中进行原始细胞识别的报告一致。15最重要的是，一旦建立，门控就可以持续使用而无需进一步调整，尽管需要对 Sysmex 仪器有一定的专业知识和培训。

Bland-Altman 图已广泛用于评估两种测量技术的一致性。Sysmex XT-2000iV 与显微镜骨髓造影数据之间的 Bland-Altman 比较表明，两种方法之间没有随机或系统误差。具体而言， Bland -Altman 上限和下限表明Sysmex 与显微镜骨髓分类计数之间存在可接受的一致性，并表明这两种检测方法可以互换使用。

此外，Sysmex XT-2000iV大鼠骨髓范围与已公布的参考范围几乎相同。根据多位研究人员的报告，成熟健康大鼠的平均 M:E 比率范围为 1.07 至 1.93，这些值与Sysmex方法在成熟大鼠中生成的 M:E 比率一致。哺乳动物中增殖与成熟骨髓细胞的比例通常约为 1: 4，如人类21和大鼠中定义的。22

骨髓淋巴细胞的鉴定在很大程度上取决于显微镜操作人员的培训以及涂片的质量，而涂片的质量又取决于染色质量和细胞自溶程度。淋巴细胞具有一些与嗜多染红细胞和后红细胞相似的形态学特征，这可能解释了报告的大鼠淋巴细胞范围（4-63%）的部分广泛差异，尽管品系差异也可能导致大鼠骨髓淋巴细胞计数不同。在一篇较新的出版物中，健康大鼠骨髓中的淋巴细胞范围为 7.34 至 21.0%，Sysmex 生成的数据满足该范围。使用淋巴细胞特异性抗体进行门控的主要优势是多个操作员之间的数据一致性更好，而无需形态学培训。

与显微镜分析相比，在啮齿动物安全性研究中实施自动化骨髓分析可以大大提高数据生成的一致性和及时性。由于分析的细胞数量更多，自动化定量骨髓分化计数具有提高通量和精度的明显优势。Sysmex 定量骨髓分化分析不依赖于显微镜操作人员的培训，也不依赖于载玻片的质量。但是，为了安全可靠地进行骨髓分析，Sysmex 操作员仍然需要接受足够的培训以识别异常细胞图，并且需要对所有动物进行组织病理学检查，以便在报告之前确定需要临床病理学家进一步进行细胞学审查的样本。临床病理学家应与定量骨髓数据的解释和药物开发项目密切相关，以便满足任何其他额外需求，包括用于形态学评估的显微镜载玻片审查。尽管非临床研究中的定量骨髓分化计数可能不是所有新化合物评估所必需的，但 Sysmex XT-2000iV 骨髓分化计数的灵敏度和精确度可能是选择正确的目标或化合物进行进一步开发的有价值的工具。