VCP50-3犬 EDTA 和柠檬酸盐抗凝血液中血小板参数的比较

血小板计数（浓度）是常规血液学检测的重要组成部分。它用于诊断出血性素质、作为隐匿性疾病（例如肿瘤）的实验室标志物，以及监测化疗患者是否出现治疗相关的骨髓毒性。因此，获得准确的血小板计数对于诊断和治疗至关重要。血小板聚集（凝结）会显著影响血小板计数的准确性，血小板聚集通常会降低血小板计数。在某些情况下，聚集严重到足以导致明显的血小板减少症。无意中报告错误的低血小板计数可能会对患者护理产生直接而重要的影响。可能会进行额外的诊断测试（例如凝血试验），可能会改变鉴别诊断，并且可能会开始不必要的昂贵药物治疗。

血小板聚集被认为是样本采集过程中血小板活化的结果，并且会影响所有物种的血小板计数。猫血样尤其容易形成血小板聚集物，估计多达 50% 至 67% 的样本有聚集物。犬没有类似的估计值。据报道，血小板聚集的另一个原因是抗体介导的 EDTA 依赖性假性血小板减少症，这种病在人类中发生，在马中发生（罕见）。EDTA是血液学检测的首选抗凝剂，因为它能最佳地保存细胞形态。然而，EDTA 诱导的钙螯合和在低于37 °C 的温度下体外储存会诱导血小板上糖蛋白 IIb 的构象变化；这会暴露隐秘抗原，随后发生抗血小板抗体结合和血小板聚集。这可能发生在健康和患病患者身上，并导致血小板计数极低（<30 × 10 9 /L），带来严重的临床和经济后果。人类和马患者均接受了免疫抑制药物治疗，以治疗推测的免疫介导性血小板减少症，并延长了住院时间。将血液采集到柠檬酸盐抗凝剂中可防止血小板聚集，并为这些患者提供准确的计数。虽然据我们所知，尚未有犬出现 EDTA 依赖性假性血小板减少症的报道，但在我们医院，临床医生通常会提交 EDTA 样本中血小板计数低的犬患者的柠檬酸盐抗凝血液样本，特别是如果在血涂片中观察到血小板凝块并随血象结果报告。然而，根据我们的经验，使用柠檬酸盐抗凝血液样本并不能获得更高的血小板计数。因此，本研究的目的是比较犬的 EDTA 和柠檬酸盐抗凝血样中的血小板计数和其他血小板参数的结果。我们假设柠檬酸盐既不能防止血小板凝结，也不能提供比 EDTA 更准确的血小板计数。

材料和方法

受试者和样本采集

为方便起见，我们选取了在正常时间内入住康奈尔大学动物医院肿瘤科的犬，以对各种肿瘤进行诊断评估和化疗监测，并将它们纳入研究。使用 20 至 22 号针头和 6 毫升注射器从颈静脉采集血液样本，然后以随机顺序（通过掷硬币决定）转移到（使用真空压力）含有 EDTA 钾或 3.2% 柠檬酸钠（美国新泽西州富兰克林湖 Becton-Dickinson 公司）的真空采血管中。小心确保采血管中装有适量的血液，并在采血后立即通过倒置将血液与抗凝剂轻轻混合。本研究已获得康奈尔大学动物护理和使用委员会的批准。

血小板参数测量

在采集后 1 小时内，使用自动血液分析仪（ADVIA 120；拜耳公司，美国新泽西州塔里敦）测定以下血小板参数：血小板计数、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、平均血小板成分浓度（MPC）、血小板成分分布宽度（PCDW）和自动血小板团块计数（APCC）。目视检查每只狗的血小板细胞图。还获得了白细胞和红细胞计数以及血红蛋白（Hgb）浓度。分析之前，检查是否有凝块。为了补偿柠檬酸盐的稀释作用，将柠檬酸盐抗凝血液中的所有细胞计数（血小板、白细胞、红细胞）和 Hgb 浓度乘以 1.1。从每个样本制备血涂片并用瑞氏染色剂（Hematek，拜耳医疗集团，美国新泽西州塔里敦）染色。一名不知道患者身份证号码和抗凝剂类型的观察员 (TS) 检查了每张涂片的边缘 (×100 放大倍数) 和单层 (×1000 放大倍数下 20 个视野)，并对血小板聚集体的数量进行评分，具体如下：0，无聚集体；1，≤5 个小聚集体 (每个≤20 个血小板) 和/或 1 个大聚集体 (每个>20 个血小板)；2，> 5 个小聚集体或> 1 个大聚集体。

统计分析

数据分布明显偏态，因此采用非参数统计。使用 Wilcoxon 符号秩检验比较抗凝剂之间的中位数结果。通过计算结果之间的绝对差异（柠檬酸盐 − EDTA）、EDTA 抗凝样品的百分比差异（[柠檬酸盐 − EDTA]/EDTA) × 100）和 Bland-Altman 图的视觉比较（差异与平均值），评估使用柠檬酸盐抗凝剂后血小板参数结果、白细胞和红细胞计数以及血红蛋白浓度的变化。通过计算 Spearman 等级相关系数（R sp）确定抗凝剂与所有血小板参数、白细胞和红细胞计数以及血红蛋白浓度之间的相关性。使用三次 Wilcoxon 符号秩检验比较白细胞和红细胞计数以及血红蛋白浓度与血小板计数的百分比差异。

使用 McNemar χ 2检验比较了 EDTA 抗凝血和柠檬酸盐抗凝血中 PCDW ≤55 g/ L的狗的比例。选择该临界值是因为人们认为这是血小板充分球化的点。需要球化才能获得 MPV 和 MPC 的准确值。Wilcoxon 秩和检验用于2次事后分析，其中我们比较了 PCDW >55 g/L 的 EDTA 样品与 PCDW ≤55 g/L 的 EDTA 样品中的中位 MPV 和 MPC。McNemar χ 2检验用于测试聚集体存在下的偏差，既针对所有 50 只狗，也针对先放入 EDTA 然后放入第二个的狗（总共 3 次测试）。

当 APCC > 300 时，自动分析仪会标记样本中的血小板聚集物。为了确定自动标记与目测聚集物相比如何，我们分别比较了每种抗凝剂中 APCC 高于或低于 300 的样本比例以及涂片中有或没有可见聚集物的样本比例。为了进行这种比较，血小板评分被分为无聚集物（分数 = 0）和聚集物（分数 = 1 或 2）。对于每种抗凝剂，使用 2 个单独的 Fisher 精确检验法比较 APCC ≤ 300 和 APCC > 300 之间是否存在可见聚集物（是/否）。P < .05（双侧）被认为是显著的。

结果

采集了 60 只狗的血液样本，但 10 只狗的结果不可用，因为 1 个或两个样本在分析前凝结，或者是因为它们是来自同一患者的重复样本。在剩余的 50 只狗中，72% (36/50) 的 EDTA 抗凝血小板计数在实验室设定的参考范围内 (179–483 × 10 9 /L)，10% (5/50) 为血小板减少，18% (9/50) 为血小板增多。EDTA 和柠檬酸盐抗凝血小板计数之间有很好的相关性，然而，柠檬酸盐样本的血小板计数中位数明显较低 ( P < .0001)（图 1和2，表 1）。82% (41/50) 的柠檬酸盐样本的血小板计数较低（与 EDTA 样本相比）。两只狗在使用 EDTA 后血小板计数正常值较低，但在使用柠檬酸盐后出现轻度血小板减少。另外两只狗在使用 EDTA 后出现轻度血小板增多，但在使用柠檬酸盐后血小板计数正常值较高。所有在使用 EDTA 后出现血小板减少的狗在使用柠檬酸盐后也出现血小板减少。

图 1.患有肿瘤的狗（n=50）的 EDTA 和柠檬酸盐抗凝血样中的血小板计数箱线图。箱线表示中位数（中心线）和 50% 四分位距；晶须表示 10% 和 90% 百分位数；单个点表示异常值。EDTA 和柠檬酸盐之间的血小板计数中位数存在显著差异（P < .0001）

图 2.抗凝剂（柠檬酸盐 - EDTA）与抗凝剂（柠檬酸盐 + EDTA）的平均血小板计数在犬血样（n=50）中的差异偏差图。虚线表示 0 偏差；虚线表示中值偏差；实线表示 95% 一致性界限

如果稀释效应大于预期是造成柠檬酸盐抗凝剂血小板计数下降的原因，我们推断白细胞和红细胞计数以及血红蛋白浓度的百分比差异将与血小板计数的百分比差异相似。柠檬酸盐抗凝样品的所有这些结果都显著低于 EDTA 抗凝样品；但是，白细胞和红细胞计数以及血红蛋白浓度的百分比下降明显小于血小板计数（表 1，白细胞计数、红细胞计数和血红蛋白浓度的P = .008、P < .0001、P < .0001）。

与 EDTA 相比，柠檬酸盐的 MPV 和 PCDW 明显较高，而 MPC 较低。抗凝剂之间的 PDW 或 APCC 结果没有显著差异。抗凝剂之间对这些剩余结果的相关性为中等（MPV）到较差（PDW、MPC、PCDW、APCC）（表 1）。EDTA 抗凝血液中 PCDW 低于临界值 ≤ 55 g/L 的狗（38%，19/50）明显多于柠檬酸盐抗凝血液中 PCDW 低于临界值 ≤ 55 g/L 的狗（0%，0/50）（P < .0001）。检查血小板细胞图时，只有在 EDTA 抗凝样本中，血小板才会捆绑成“聚宝盆”形状。此外，这是在 PCDW ≤ 55 g/L 的 19 个 EDTA 样本中（所有）看到的唯一模式。相比之下，所有柠檬酸盐抗凝样品和 90% (28/31) 的 PCDW > 55 g/L 的 EDTA 抗凝样品均具有弥漫性血小板细胞图（图 3）。后者的一个 EDTA 抗凝样品具有聚宝盆形细胞图和 56 g/L 的 PCDW。其余 2 个 EDTA 抗凝样品的细胞图上血小板形状不明确；这些样品中的血小板 PCDW 分别为 57 和 58 g/L。为确定球形化不足是否影响 MPV 和 MPC 值，EDTA 抗凝样品根据 PCDW cutoff浓度 55 g/L 分为 2 组。柠檬酸盐抗凝样品没有这样做，因为它们都没有低于此cutoff的 PCDW。与 PCDW ≤ 55 g/L 的 EDTA 抗凝样品相比，PCDW > 55 g/L 的 EDTA 抗凝样品的 MPV 中位数较高（尽管差异不显著），而 MPC 中位数明显较低（表 2）。

血小板聚集评分（通过目视检查涂片确定）在柠檬酸盐（中位数评分，1）样本中显著高于 EDTA（中位数评分，0）（P < .0001）样本。事实上，在柠檬酸盐抗凝血的涂片中（70%，35/50）见到聚集体的样本明显多于 EDTA 抗凝血（28%，14/50）（表 3，P < .0001）。

无论先装满哪个试管，都会发生这种情况，但在装满柠檬酸盐试管时，这种差异非常显著（分层 McNemar χ2 检验中 P < .0001 ）。此外，在柠檬酸盐抗凝血的涂片中，血小板始终较大且染色较浅（图 4）。

分析仪在 14 份（14%）EDTA 抗凝样本中标记了凝块（APCC > 300），其中有 2 份（14%），36 份（3%）EDTA 抗凝样本中有（评分 = 1 或 2）和没有（评分 = 0）。同样，在 35 份（9%）柠檬酸盐抗凝样本中标记了凝块（APCC > 300），其中有 3 份（9%），15 份（13%）柠檬酸盐抗凝样本中有（评分 = 1 或 2）和没有（评分 = 0）。这两种抗凝剂的比例没有显著差异（EDTA，P = .19；柠檬酸盐，P = 1.00）。

讨论

我们的结果表明，与 EDTA 抗凝血相比，柠檬酸盐抗凝血中的血小板计数始终显著较低。这种差异与试管填充顺序和血小板计数无关。柠檬酸盐抗凝血样中血小板计数较低归因于血小板聚集，这种聚集在柠檬酸盐样品中更频繁、程度更大。在采集到柠檬酸盐抗凝剂中的人类患者血液样本中，血小板计数较低且凝集增加。同样，在 57 只健康猫的柠檬酸盐抗凝血样中也观察到血小板计数较低（使用本研究中使用的相同分析仪获得），尽管这些猫的柠檬酸盐和 EDTA 抗凝血之间的血小板凝块计数没有显著差异。相比之下，另一项研究发现，柠檬酸盐抗凝猫血的血小板计数（通过血细胞计数器和阻抗分析仪获得）更高，凝集评分更低，但总数较低（12 只猫）。本研究中，柠檬酸盐抗凝血的狗血小板计数出现轻微的负偏差，这不太可能具有临床意义。只有 2 只狗（4%）在 EDTA 中血小板计数正常，但在柠檬酸盐中血小板减少症会被视为轻度血小板减少症。这种轻度血小板减少症不太可能引发额外的诊断检测或改变化疗药物的剂量。

柠檬酸抗凝血液中血小板计数减少的另一种解释是由于真空压力变化导致真空采血管填充不足。这会将血液稀释得比本研究中使用的 1:10 比例还要多。但是，由于两个原因，这种情况被认为不太可能发生。首先，所有试管都经过目视检查以确保填充适当（尽管可能会忽略样本体积的细微差异）。其次，这种过度稀释应该对样本中的白细胞和红细胞计数以及血红蛋白浓度产生同等程度的影响。但是，这种情况并没有发生（反对稀释效应）。

柠檬酸盐抗凝血样中的 MPV 明显较高，这可以部分解释为柠檬酸盐中血小板聚集的频率和程度较高。同样，先前的一项研究表明，聚集猫血样中的 MPV 高于非聚集猫血样。然而，聚集不太可能是柠檬酸盐中 MPV 较高的唯一原因，因为分析仪在两种抗凝剂中都无法持续检测到血小板凝块。与 EDTA 抗凝血相比，柠檬酸盐中 MPV 较高和 MPC 较低的其他解释是 1) 血小板活化和 2) 柠檬酸盐抗凝剂中血小板非球形化引起的伪影。

在活化过程中，血小板从盘状变为刺状球体，由于吸水而肿胀，并脱颗粒。这会增加 MPV，降低 MPC 并使血小板在涂片中显得更苍白。MPC 相当于血小板折射率，与血小板密度呈线性关系。因此，活化过程中脱颗粒或液体吸收会使 MPC 降低。事实上，无论是在EDTA还是柠檬酸盐中取样，在凝血酶活化的人血小板上，MPC 降低与 P-选择素表达（公认的血小板活化标志物 ）增加之间存在高度相关。在最近对患有炎症的狗的研究中，在 EDTA 抗凝血小板中也发现了类似的相关性（r = 0.62）；这一发现被解释为表明血小板活化。在本研究中，用柠檬酸盐制备的血小板涂片比用 EDTA 抗凝血制备的血小板更大、更苍白，表明用柠檬酸盐发生了激活（肿胀和脱粒）。这得到了之前对人类和犬类血小板的研究结果的支持，这些研究显示，在柠檬酸盐中收获的未刺激血小板中 P-选择素表达增加。血小板被柠檬酸盐抗凝剂快速激活的原因尚不清楚。激活可能会影响血小板功能研究的结果，而血小板功能研究通常针对柠檬酸盐抗凝血进行。

本研究中的光学分析仪使用 2 角度激光散射和米氏散射理论，根据大小和折射率区分血小板。精确测量假设颗粒是球形的，EDTA 比柠檬酸盐更符合这一规律。如果血小板在分析仪中保持其盘状形状，就像在柠檬酸盐中一样，它们会以不同的方式散射光。与 EDTA 相比，这会导致收集到柠檬酸盐中的血小板的 MPV 人为增加，MPC 降低，如各种人类血小板研究所示。因此，这些血小板参数在柠檬酸盐抗凝血样中被认为是不准确的。血小板细胞图和 PCDW（血小板密度变化的量度）可用于区分活化和非球形化引起的 MPV 和 MPC 变化（Zelmanovic D，个人通信）。血小板在细胞图上保持其经典的聚宝盆形状，并且 PCDW 随着血小板活化而降低。PCDW降低被认为代表激活过程中血小板形状从盘状变为球形。相反，当血小板不完全球形时，它们会弥散地散布在细胞图上，PCDW 会增加。此外，PCDW ≤55 g/L 支持分析仪中血小板充分球形化。在本研究中，柠檬酸盐中的 PCDW 显著且持续高于 EDTA，所有柠檬酸盐抗凝样品均具有弥散的血小板细胞图。值得注意的是，后者样品中没有一个 PCDW ≤55 g/L。这表明 MPV 和 MPC 的大部分变化是由于柠檬酸盐中血小板球形化不足，而不是柠檬酸盐诱导的激活。类似地，与 EDTA 抗凝人类患者样本相比，柠檬酸盐抗凝未刺激血小板的 MPC 较低，PCDW 较高。这些结果证实了之前关于柠檬酸盐抗凝血液中这些参数不准确的陈述。然而，在我们的研究中，多达 62% 的 EDTA 抗凝样本的 PCDW > 55 g/dL，这表明血小板在这种抗凝剂中也不完全球形。EDTA 不会诱导血小板完全球形化，但会诱导形状变化，使血小板足够球形以用于米氏散射分析。这种形状变化并非在所有 EDTA 抗凝样本中都一致发生。当本研究中根据 PCDW 分离 EDTA 抗凝样品时，发现 PCDW ≥ 55 g/L 的血小板的 MPC 中位数明显低于 PCDW < 55 g/L 的血小板。此外，大多数 PCDW > 55 g/L 的 EDTA 抗凝样品具有弥漫性血小板细胞图，而所有 PCDW 低于此截止值的样品均具有聚宝盆形细胞图。这表明 EDTA 抗凝样品中的低 MPC 值可能是由活化或不完全球形化引起的，而 PCDW 和血小板细胞图可能有助于区分这些可能性。尽管有这些发现，但应该注意的是，凝血酶活化柠檬酸盐和 EDTA 抗凝的人血小板会导致 MPC 进一步下降，这与 P 选择素表达有很好的相关性。11, 13, 16这表明，只要获得适当的基线对照，MPC 在研究环境中可能仍然有用。显然，需要进一步研究来确定 MPV 和 MPC 测量在检测狗的活化血小板和验证 PCDW 方面的有效性。

本研究中，柠檬酸盐抗凝血液的 MPV 中位数高于 EDTA 抗凝血液，这与以前关于狗和猫的报道相反，而狗和猫的 MPV 中位数正好相反（即柠檬酸盐中的 MPV 低于 EDTA 中的 MPV）。这种差异主要可以通过分析血小板所用仪器的差异（如上所述具有非球形化效应）以及可能与评估的物种不同来解释。在其中两项研究中，使用基于阻抗的分析仪对猫和狗的样本进行了细胞计数和 MPV 测量。使用较旧的基于阻抗的分析仪（Coulter S+IV；Coulter Electronics，美国佛罗里达州海厄利亚）测得的狗的 EDTA 抗凝血液样本中 MPV 的参考区间的上限和下限都低于本研究中使用的基于光学的分析仪（个人观察）。在第三项研究中，我们采用了与本研究相同的光学分析仪，在 57 只猫中，EDTA 抗凝血的 MPV 和 MPC 分别显著高于柠檬酸盐抗凝血和低于柠檬酸盐抗凝血。这可能是由于血小板活化和/或聚集，但是，没有描述对血小板聚集物的涂片目测评估。这些数据表明，与狗（例如我们研究中患有肿瘤的狗）不同，猫的血小板在 EDTA 抗凝血中比在柠檬酸盐抗凝血中更容易被活化。

血小板聚集可能是由于样本采集和处理过程中血小板的激活或固有的血小板聚集性所致。当从小外周静脉、血流缓慢或因真空压力而塌陷的静脉、使用小口径针头或注射器压力过大或混合过程中样品过度搅动时，可能会发生激活。血小板也可能因潜在疾病或药物治疗而在体内被激活。血液储存后聚集也会增加。本研究通过样本采集方法（大号针头、颈静脉穿刺、轻柔倒置）和快速处理样本，将采集引起的激活降到最低。然而，本研究中的所有狗都患有潜在的肿瘤，有些狗正在接受化疗药物治疗。这可能导致血小板高聚集性（可能因柠檬酸盐而加剧），也可能解释为什么一些样本凝结以及 EDTA 抗凝样本中聚集体的发生率相对较高（28％）。

本研究可能低估了血小板聚集的目测评分，因为小的或松散的聚集体可能会被忽略，而且每个抗凝样本仅检查了 1 个涂片。事实上，在涂片上检测到聚集体的样本中（血小板聚集评分 = 1 或 2），71% (10/14) 的 EDTA 抗凝样本和 49% (17/35) 的柠檬酸盐抗凝样本只有少量或小的聚集体（评分 = 1）（表 3）。先前对狗的一项研究表明，在从同一样本制备的多张涂片中血小板聚集体的数量和大小存在异质性，尽管在之前确定有聚集体的样本的所有检查涂片中都检测到了聚集体。1然而，涂片中血小板分布不均匀应该对 EDTA 和柠檬酸盐的目测聚集体评分产生同等影响，一致的目测检查方法不太可能导致评分偏差。

据我们所知，尚无研究评估 APCC 在检测狗样本中的血小板聚集体的有效性。分析仪通过计算从噪声簇延伸到过氧化物酶通道中淋巴细胞区域右侧的门控内的事件数来检测血块。 在我们的研究中，分析仪标记了在涂片中未通过视觉检测到的血块。3个EDTA 抗凝样本中的 1 个和 5 个柠檬酸盐抗凝样本中的 2 个出现了这种情况。这可能是因为存在脂质滴和/或细胞碎片，这些干扰颗粒也落入血小板凝块区域并可能被错误地标记为血小板。我们的结果还显示，在涂片中可以通过视觉检测到血块，但自动分析仪并未标记。这可能归因于分析仪仅检测到大的血小板聚集体（本研究中的许多样本只有几个或小的聚集体，可能不会延伸到血小板凝块区域）或者聚集体在分析过程中分散在分析仪内。但是，大多数涂片中具有大或许多可见聚集体的样本并未被分析仪标记为 APCC > 300（4 个 EDTA 抗凝样本中均无一例，18 个柠檬酸盐抗凝样本中只有 2 个（聚集评分为 2）的 APCC > 300）。因此，我们的结果表明，凝集标记或 APCC 可能提醒实验室技术人员样本中可能存在血小板凝块，但不应单独使用它来验证是否存在血小板聚集体。在我们的实验室中，所有自动计数都通过如前所述的从涂片进行的血小板估计来验证。如果估算计数与自动计数相符，则后者将被报告为最低计数，如之前所建议的那样。

总之，我们的结果表明，在患有肿瘤的狗中，EDTA 抗凝样本的血小板计数比柠檬酸盐抗凝样本更准确，血小板聚集更少。根据涂片中血小板的外观，柠檬酸盐中的聚集归因于血小板活化。因此，除非使用柠檬酸盐特定的参考区间来解释结果，否则不建议将柠檬酸盐作为患有肿瘤的狗的血小板计数的抗凝剂。即使这项研究只在患有肿瘤的狗身上进行，结果也可能适用于没有肿瘤的狗。本研究中使用光学分析仪 (ADVIA 120) 获得的 MPV 增加和 MPC 降低的结果不能仅仅作为激活的标志，因为如果血小板没有充分球形化，这些参数的结果是不准确的。在患有肿瘤的狗的 EDTA 和柠檬酸盐抗凝血液中，血小板似乎都球形化不足。需要进一步研究以确定是否可以通过将血液收集到含有血小板活化抑制剂（例如柠檬酸盐、茶碱、腺苷和双嘧达莫）的抗凝剂中来预防血小板聚集。后一种抗凝剂可减少猫的血小板聚集并增加血小板计数。