NONCLINICAL DRUG DEVELOPMENT GUIDE chapter10-药物开发中的免疫毒理学评估

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本篇是第十章-免疫毒性

免疫毒理学作为一个学科在1987年被正式定义，其起源可以追溯到20世纪70年代中期，当时工业和学术界的科学家们开始关注新化学实体的免疫调节活性，并努力识别方法和标准化评估。免疫毒理学的早期工作定义主要涉及无意的免疫抑制、潜在的超敏性和过敏反应，但国际协调会议S8指南中当前的定义，即适用于新的人类药物（ICH S8），将免疫毒性定义为“无意的免疫抑制或增强”。ICH S8指南特别排除了对过敏性和药物特异性自身免疫的评估。实际上，免疫毒理学是一个需要综合免疫学、免疫药理学和毒理学来评估药物对免疫系统潜在不良影响的学科。ICH S6指南明确了生物技术衍生药物的临床前评估，并没有明确要求对生物技术衍生药物进行免疫毒性测试，但承认可能需要进行免疫毒理学测试，当与ICH S8指南结合时，表明如果证据审查表明测试合适，生物技术衍生药物应进行免疫毒性测试。本章将主要关注根据ICH S8指南衍生的免疫毒性测试，该指南由欧盟、日本和美国的监管机构适用于新的人类药物测试。确定是否需要进行免疫毒性测试的关键因素包括药物的药理特性、药物分布、与现有免疫调节剂的结构相似性、预期的适应症和患者群体、表明免疫调节的初步毒理学发现以及如果药物目前正在临床试验中的临床观察。此外，可能需要对目前已获批准的药物进行免疫毒理学测试，特别是用于次要适应症治疗的药物，具体是免疫或炎症性疾病的治疗。鉴于打算引入市场的生物制药数量迅速增加，包括基因修饰细胞疗法、越来越多的腺相关和慢病毒基因治疗载体，以及RNA疫苗技术的发布，需要额外考虑。这些额外考虑可能包括对病毒载体的预先存在的免疫和病毒载体的嗜性，是发现的普遍性和每个发现的权重决定药物是否需要进行免疫毒性测试，如果需要，哪些评估最合适。此外，如果需要对新药物进行免疫毒性评估，应在III期临床试验之前完成。免疫毒性评估通常采用分层方法进行，部分基于表明潜在免疫毒性的临床前研究结果，这些结果必须仔细权衡药物的作用机制、种间效力的潜在差异、物种的生理应激反应、淋巴器官解剖学、可以改变免疫系统功能的间接药理学或病理过程，以及物种的免疫储备。

通常表明免疫毒性的发现包括①感染或重复感染的增加发生率或与通常共生微生物的重复感染、②在没有直接因果病理的情况下异常的白细胞计数、③炎症生物标志物的显著变化、④球蛋白或白蛋白/球蛋白比例的显著变化，⑤以及一级和二级淋巴器官的组织病理学变化，例如正常组织中不寻常的白细胞浸润模式。

目前监管机构支持的小型动物毒理学模型中针对抗原特异性体液免疫的一线毒理学评估是T细胞依赖性抗体反应（TDAR）测定。该测定需要成功的蛋白抗原通过T细胞受体、T细胞、抗原呈递细胞（APC）细胞因子产生和细胞接触依赖的共刺激信号来产生抗原特异性抗体。要产生反应，体液免疫系统的每个组成部分必须在解剖学上完整且功能正常，因此TDAR测定被认为是免疫力的一线主要功能评估。

TDAR测定最初由Jerne和Nordin开发，是一种改良的溶血斑测定，通过对小鼠进行绵羊红细胞（SRBC）免疫，然后在IgM产生高峰时，通常是免疫后四到五天，进行脾切除，并制备单细胞悬浮液，随后悬浮在含有补体的SRBC灌注琼脂中。单个B细胞群产生足够量的抗SRBC IgM通过经典途径诱导IgM介导的补体溶解SRBC，形成清晰或不透明的斑块，并且计算斑块的总数。SRBC斑块形成测定通常被纳入小鼠或大鼠28天重复剂量毒理学研究中，在研究结束前四到五天通过静脉注射SRBCs，在给予供试品后。标准的TDAR研究设计包括五个处理组，每组8-10只动物/性别，第一组是SRBC对照组，其目的是在没有供试品的情况下计算抗SRBC反应的幅度。第二组通常是免疫抑制剂对照组，通常是环磷酰胺、环孢素A或地塞米松，其剂量已在测定验证期间确定，以产生在斑块形成上统计学上显著的减少。SRBC和免疫抑制剂对照组是供试品处理组的比较组，免疫抑制剂组被认为是阳性对照。供试品处理组的剂量水平选择应包括基于先前设计良好的毒理学研究数据选择的低、中、高剂量，这些研究具有足够的统计能力，以确定产生可测量毒性的无观察到不良效应水平（NOAEL），例如外周血白细胞减少、淋巴组织形态改变或全身毒性的一般指示，如体重减少10%或食物消耗减少。中剂量与低剂量结合使用是必要的，以确定剂量-反应关系，剂量途径和给药方案应与毒理学研究相匹配。怀疑或已知具有免疫调节活性的载体应作为TDAR测定中的单独组进行测试。SRBC TDAR斑块测定已被证明与常规毒理学终点（包括血液学、淋巴器官重量和组织病理学）相比，是啮齿动物免疫毒性的更敏感指标。SRBC TDAR斑块测定的局限性在于它是一个终点，耗时且劳动密集，对SRBC之间的抗原变异性敏感，以及补体活性的变化，并且主要代表脾脏驻留的免疫细胞群的反应。

大多数实验室已经采用了配体结合的SRBC TDAR酶联免疫吸附测定（ELISA）测试血清样本。这种方法提供了与斑块测定相似的灵敏度、连续采样和样本批处理的优势，更大的潜在实验室间标准化，以及测量包括IgG在内的总血清抗原特异性抗体。SRBC TDAR ELISA的进行与斑块测定类似，包括SRBC免疫、所需实验组数和样本收集时间。SRBC ELISA测定是使用涂有SRBC膜的高结合ELISA板进行的，这些板捕获血清样本中的抗SRBC抗体。抗SRBC抗体被检测为针对研究中物种或品系的特异性抗异构型或多克隆抗体，这些抗体与产生颜色的发展试剂添加后产生颜色的酶共轭。未知样本的颜色强度与跨越多个抗SRBC抗体浓度的标准曲线进行比较，并通过回归分析为测试样本生成浓度结果。SRBC ELISA性能的关键变量包括来自供体的SRBC抗原的变异性、SRBC膜的制备一致性以及板涂层。此外，检测抗体的浓度、纯度和亲和力以及标准曲线模型将影响测定的稳健性。SRBC斑块测定和ELISA已被证明在检测啮齿动物免疫毒性方面具有可比的灵敏度。

钥匙孔扇贝血蓝蛋白（KLH）ELISA是最近使用的一种方法，越来越多地用于啮齿动物和大型动物模型的TDAR评估，但该方法尚未被监管机构纳入。KLH是一种从巨扇贝（Megathura crenulata）中分离出的高分子量、重度糖基化的氧载体金属蛋白，由于其结构和与哺乳动物蛋白的系统发育距离，具有高度的免疫原性。KLH抗原因其在多个物种中的强免疫原性、在典型免疫剂量下的最小毒性证据以及能够标准化KLH制剂，便于实验室间测定验证，而被采用作为TDAR测定中的免疫原。KLH TDAR测定可以提供在适当验证的情况下，啮齿动物和NHP（猕猴）中单次免疫后抗KLH IgM和IgG的可靠定量评估。任何TDAR测定中需要评估的关键因素可以分为两个功能领域：测定和统计。对于半定量测定的严格TDAR测定验证应包括标准曲线模型、测定范围、定量的上限和下限、稀释线性、测定间和测定内精密度和准确性、板稳定性、关键试剂稳定性，并应在关键试剂批次变化时定期重新评估，以检测由于测定性能变化或被测试动物群体变化导致的测定漂移。此外，应将预先定义的统计标准应用于TDAR验证的体内和测定阶段，以确保在生物学和测定变异性的背景下，对阳性反应率、定义和检测的严谨性。预先定义的统计学的应用可以减轻常见现象，包括未免疫动物中预先存在的抗体和同一物种内对免疫反应的变异性。对SRBC和KLH啮齿动物TDAR反应的元分析显示，尽管测定协议不同，但ELISA SRBC和KLH TDAR方法之间存在可接受的相关性，并且TDAR测定已显示出与人类免疫毒性相关，这证实了这项测试的实用性。

在评估NHP TDAR测定的关键出版物中，是健康和环境科学（HESI）免疫毒理学技术委员会系统评估NHP TDAR测定的合作工作。这项工作回顾性地评估了来自不同地理来源的178只NHP，包括雄性和雌性的TDAR数据。总之，研究表明性别或地理来源不是NHP TDAR测定中变化的重要来源，并且使用SRBC、破伤风类毒素或KLH抗原的响应者百分比相似。这项工作表明，在NHP中，平均峰值二次TDAR反应的幅度大于平均峰值初次反应。这篇论文的一个关键发现是，通常使用不到四只动物/性别/组的标准毒理学研究可能只能检测到大幅度的变化。作者建议使用两性的数据汇总，以提高TDAR测定在NHP中检测低幅度变化的能力。

犬模型通常用于生物制药的毒性评估，但由于缺乏该物种的基本免疫学知识，以及缺乏专门调查TDAR测定的出版物，显然需要更多的研究，然后才能在犬中进行常规TDAR评估。

酶联免疫斑点法或ELISPOT和荧光斑点测定用于评估抗原特异性细胞因子和免疫球蛋白产生，是具有大量文献支持这些测定在非临床毒理学和疫苗研究中使用的验证标准技术。技术的简要描述如下：收集以前接触过目标抗原的动物或受试者的外周血单个核细胞（PBMC）或脾细胞，处理成单细胞悬浮液，并在无菌板上进行铺板。根据执行的ELISPOT类型，平板的细胞数量各不相同。在96孔ELISPOT板上进行复制的细胞平板，然后在完整介质中孵化（阴性对照）、细胞类型特异性药理多克隆刺激剂如刀豆蛋白A（Con A）或植物血凝素（PHA）用于T细胞，B细胞的 pokeweed mitogen（PWM）。药理刺激剂作为阳性对照。然后，细胞与目标抗原的单浓度或多浓度一起孵化，通常为24-72小时。测定要求动物或受试者事先接触过T细胞依赖性抗原，然后进行二次体外刺激。孵化后，平板细胞被洗涤，添加细胞因子或抗体特异性酶共轭或荧光素标记的检测抗体，孵化，然后洗涤平板。通过ELISPOT或荧光斑点阅读器检测和计数抗原特异性细胞，该阅读器检测每个细胞的颜色或荧光信号。结果计算为斑点形成单位（SFUs），根据细胞浓度标准化，例如，每毫升1×10^6细胞的SFU。对于小鼠、大鼠、犬、NHP、猪、绵羊、牛、雪貂、兔子、仓鼠和人类，都有商业套件可用。ELISPOT和荧光斑点测定允许评估T辅助1、2、9和17细胞因子，包括但不限于干扰素-γ、干扰素-α、白细胞介素2、4、6、8、10、12、13和17A。还有额外的分析物可用于评估细胞毒性，包括穿孔素和颗粒酶B。ELISPOT和荧光斑点技术提供了关于诱导、幅度、记忆反应和抗原特异性细胞和体液免疫偏斜的有价值信息。

补体系统是进化上古老的系统，由脊椎动物产生的酶原形式的蛋白质组成，存在于血浆和其他体液中，它们在接触微生物表面结构、外来分子结构或特定免疫球蛋白的恒定区域时被激活。激活的补体结合到启动结构的表面，其功能是对目标进行调理或直接溶解目标。主要由肝脏产生的补体系统的不活化前体蛋白，以及单核细胞、巨噬细胞和脂肪细胞在较小程度上产生，可以通过三种不同的途径激活：经典途径、替代途径和甘露糖结合凝集素途径。

每个补体途径的起始事件不同，但所有途径都汇聚激活C3释放过敏毒素C3a。激活后，C3b与目标表面共价结合，并与其他因素结合形成C5转化酶。C5转化酶裂解C5产生第二个过敏毒素C5a。C5b组分保持在起始表面结合，它形成C6-C9组件组装的中心点。整个C5b-C9蛋白复合物被称为膜攻击复合物（MAC），它是MAC形成溶解目标。过敏毒素C3a和C5a扩散到补体激活的直接现场之外，与目标细胞表面的G蛋白偶联受体结合，发挥生理或病理效应。

检测经典和替代途径活性变化的标准筛查试验是总补体溶血测定法用于经典途径（CH50）和替代途径（AH50）。在CH50测定中，预先与抗体一起孵化的红细胞或敏感化的红细胞与测试受试者的血清稀释物一起孵化，其中抗体的存在通过经典补体途径诱导红细胞溶解。血清样本的活性表示为溶解50%红细胞的稀释物的倒数。AH50测定类似进行，但使用的是以前没有接触过抗体的红细胞。AH50测定依赖于动物血清中适当din、B因子和D因子的功能活性以启动替代途径。这些测定最初是为筛查人类患者的遗传性补体成分缺陷而开发的。这些测定在免疫毒理学研究中用于检测补体途径的有害激活或由于供试品导致的补体活性变化。在许多情况下，增加的补体激活会产生CH50和AH50活性的减少，因为激活的补体因子在体内比未激活的因子更快地被消耗。这种反应模式在急性期反应中可能不会被观察到，因为在急性期反应期间，肝细胞产生补体成分的上调掩盖了激活的补体成分消耗的增加。CH50和AH50测定不测量MBL补体活性。

最近的工作建立了一个ELISA，它通过使用预涂层测定孔，包含每个途径的特定抑制剂，提供对每个途径活性的定量测量。CH50和AH50测定的修改版本可以为大多数临床前模型执行，但测定资格程序和特定于被测试物种和执行测定的实验室的历史对照数据是关键要素，以获得质量数据。最近开发的商业化定量ELISA测试所有三个途径的活性，代表了免疫毒理学中补体活性筛查的重大改进，因为可以测量特定途径的活性，样本体积最小，测定间和实验室间变异性较小。通过径向免疫扩散（RID）、放射免疫测定（RIA）和均相时间分辨荧光（HTRF）可以执行特定补体成分的计数，但这些调查很少被指示，并且需要经常执行这些类型评估的经验丰富的研究者的专业技能。免疫毒理学家感兴趣的补体测试的另一个领域是检测和定量过敏毒素C3a和C5a。过敏毒素是前体C3和C5蛋白的片段，它们在补体激活现场和周围微环境中启动几种促炎症反应，包括中性粒细胞和巨噬细胞的招募、内皮激活、血小板激活、细胞因子释放和增加肽白三烯的产生。有几种不同的测定平台的商业化套件可用于评估血浆和血清中过敏毒素的浓度。过敏毒素测量在确定由供试品介导的补体激活或通过免疫复合物形成激活补体引起的补体介导的免疫毒性方面是有用的。总之，通过CH50、AH50或定量ELISA筛查评估补体活性，以及评估过敏毒素，是评估可能由供试品介导的补体活性变化引起的毒性的有用方法，结合临床观察和临床/组织病理学评估，为调查可能由补体途径活性变化引起的毒性提供了有价值的信息。

吞噬细胞，这些骨髓源性的髓系细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和单核细胞的成熟形式，在控制对感染的初始反应、启动和维持或解决炎症中起着关键作用，它们的反应必须紧密协调和高度调节，以防止感染的同时不损害宿主组织。专业吞噬细胞，中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，是免疫毒理学家历来研究的主要细胞群体，因为它们对感染的反应机制和在炎症过程中的作用在人类中得到了最密切的研究，并且在标准的临床前毒理学模型中。吞噬作用是由被调理的微生物或颗粒与吞噬细胞表面的调理受体结合启动的，这些受体包括免疫球蛋白恒定区的受体以及补体级联的受体。调理受体的参与激活吞噬细胞重新排列细胞骨架元素，改变质膜折叠，允许内陷，并且细胞质颗粒与内化目标融合形成吞噬体。在吞噬体内部，各种微生物和微生物静态蛋白通过pH和离子浓度的变化被激活。NADPH氧化酶的激活通过快速代谢氧气产生抗菌浓度的过氧化氢、超氧阴离子、次氯酸和其他活性物质，即呼吸爆发。

免疫毒理学调查吞噬细胞表型或功能主要涉及表型、吞噬作用和呼吸爆发的评估。可用的显微镜方法包括直接染色、免疫组化和共聚焦显微镜。此外，评估外周血吞噬细胞群体表型和数量以及脾脏驻留的吞噬细胞群体通常由流式细胞术执行。吞噬细胞群体的表型评估应伴随着功能评估，这取决于供试品的作用机制和证据的权重。

吞噬作用的评估可以通过流式细胞术执行，典型的流式细胞术测定吞噬作用将使用全血、PBMCs或分离的吞噬细胞与荧光标记的目标孵化一段时间，然后通过前向和侧向散射或使用组合门控分离单核细胞和中性粒细胞与淋巴细胞。通常结果将作为内化目标的荧光强度呈现，相对于未染色对照标准化，并用适当的染色对照补偿。另一个提供有用信息的测试方面是使用调理和未调理的目标，以确定吞噬作用发生的途径。呼吸爆发活性的评估可以通过多种方法评估，包括基于板的发光和比色方法，以及流式细胞术。

NK细胞是骨髓起源的淋巴细胞，具有独特的表型，其功能是识别和溶解显示激活和抑制细胞表面受体异常表达的宿主细胞，NK细胞识别这些受体作为表明活跃感染或细胞失调的信号。NK细胞功能的古典评估是铬释放测定，最初由Brunner开发。该测定通常使用铬51标记的肿瘤细胞进行，这些细胞以前被确定对溶解敏感（目标），它们与暴露于药物的动物的淋巴细胞（效应器）在96孔组织培养板中的不同效应器-目标比例在培养基中孵化。测定控制包括自发释放，由单独标记的目标细胞组成，以及总释放，由用洗涤剂处理的标记目标细胞组成，以引起最大铬51释放到培养基中。测定结果以每个效应器：目标比例的复制孔的平均计数每分钟（CPM）呈现，代表每个效应器：目标比例的溶解程度，校正自发释放与总释放相比。有适当的目标细胞系可用于在啮齿动物、犬和非人类灵长类物种中进行此测定。该测定的缺点包括使用放射性同位素、自发释放的变异性，以及在啮齿动物中通常是终点，因为需要使用脾细胞悬浮液以达到进行测定所需的细胞数量。测量NK细胞活性的最新发展包括使用丙啶碘化物或羧荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的几种流式细胞术方法。流式细胞术方法在灵敏度上似乎与铬51释放测定相当，但由于缺乏积累的数据和释放测定的历史接受度，这些方法尚未完全被采纳。

在过去十年中，流式细胞术评估临床前模型中的外周血和淋巴组织细胞群体，包括小鼠、大鼠、犬和灵长类动物，已经大大改善，因为目前有试剂可用于监测与人类细胞群体相关的成熟淋巴细胞和髓细胞群体。此外，人类免疫学基础科学研究所迅速发展，正在产生用于识别和计数特殊群体的试剂，包括T调节亚群、Th9、Th17、效应和记忆T细胞亚群、NK细胞亚群以及许多免疫细胞类型的祖细胞和前体群体。在临床前模型中评估相应的群体可能提供有价值的数据，这些数据可能直接表明人类患者中的群体特定效应。临床前测试的标准免疫表型分析panel通常包括总白细胞或淋巴细胞、成熟的CD4+和CD8+ T淋巴细胞、成熟的B细胞、成熟的NK细胞和单核细胞的计数。过去的工作表明，外周血免疫细胞群体的变化与啮齿动物中检测到的免疫毒性之间存在一致性，特别是免疫抑制，当免疫表型分析和NK细胞评估同时进行时，这种一致性从大约83%增加到大约90%。

免疫表型分析应使用已验证的测定进行，这些测定已评估了批间和批内精密度以及动物变异性、样本稳定性、试剂稳定性和样本稀释效应，并应包括每个群体的最小事件数量。此外，适当设计的验证应包括功效分析和对于测试群体的最小可检测差异统计。如果将在验证中包括淋巴组织免疫表型分析，这些细胞群体数量和相对百分比应通过重量标准化。此外，在验证之后，积累历史对照数据是有价值的，因为它跟踪随时间变化的群体变异性，并且可以按性别和年龄组织，以考虑由于这些因素而发生的群体变化。

（Immunophenotyping analysis should be conducted using validated assays that have assessed intra and interassay and animal variability, pre and postfixation sample stability, reagent stability, and sample dilution effect and should include a minimum number of events for each population. Additionally, properly designed validations should include power analysis and mini-mum detectable difference statistics for the tested popu-lations. If lymphoid tissue immunophenotyping will be included in the validation, these cell population numbers and relative percentages should be normalized by weight. Additionally, following validation, accrual of historical control data is valuable as it tracks population variability over time and can be organized by sex and age to account for population changes that occur due to these factors.）

将免疫表型分析纳入临床前研究的关键因素包括药物的作用机制、药代动力学、group size和number、研究期限，以及关于样本收集和稳定性的实际限制。理想情况下，免疫表型时间点的选择应考虑上述因素，以相关联外周或淋巴组织细胞群体的变化，并且应在多个剂量水平上进行评估，至少其中一个剂量水平引起可测量的全身毒性。免疫表型评估的数据包括每个群体的绝对数量和相对百分比，应使用适当的统计技术进行分析，以考虑治疗、时间和性别效应。如果正在评估恢复或返回基线，这些标准应在研究之前选择，基于验证研究。完整的免疫表型数据分析需要了解对骨髓和一级和二级淋巴器官的病理或毒理学效应，以区分直接或间接免疫毒性和由于非免疫毒性毒理学或病理学变化引起的次要变化。

淋巴细胞对适当刺激（包括抗原呈递、来自APCs的细胞接触依赖性信号和细胞因子）的增殖能力是成功免疫的基本要求。尽管细胞增殖不是特定免疫毒性的特定指标，也不如TDAR、免疫表型或NK细胞评估敏感，但它确实提供了对外来物质或药物抑制增殖所需代谢事件的能力的直接评估。评估体外或离体淋巴细胞增殖的原始方法使用了通过闪烁计数测量的三氚标记胸腺嘧啶的掺入，刺激的淋巴细胞的复制孔的平均计数代表分裂细胞与未刺激对照相比。现在可以使用多种技术执行淋巴细胞增殖测定，包括比色、发光和流式细胞术，这些技术使用从外周血、脾脏或淋巴器官分离的淋巴细胞，前提是可以获得足够数量的淋巴细胞。此外，可以使用上述群体全局评估药物对增殖的影响，或者在分离所需群体后测试特定群体的影响。这些技术在许多情况下与三氚标记胸腺嘧啶掺入一样敏感，但应注意确保该方法是特定于细胞增殖的，而不是一般增加的代谢活动，并且能够实现高于背景的足够增加，例如，依赖于氧化还原状态变化以引起颜色变化的试剂。淋巴细胞增殖测定需要良好的无菌技术、对培养条件和细胞生长动力学的了解，以及对常用于刺激淋巴细胞增殖的不同药物的药理特性的了解。诱导增殖的药物选择很重要，因为植物凝集素，包括PHA、Con A和PWM，可以结合多个细胞表面蛋白，并对T和B细胞分别表现出更强或更弱的有丝分裂效应。还有其他药理药物可用，如磷酸肉豆蔻酸，当与离子霉素一起使用时，可以绕过细胞表面受体诱导的信号传导。分离的T淋巴细胞可以用抗CD3和抗CD28抗体刺激。

细胞因子是由免疫系统的细胞产生的蛋白质，它们通过内分泌、旁分泌、自分泌，有时系统地作用以协调、调节和解决免疫反应。细胞因子不应被视为具有单一作用的独立实体，而应被视为具有补偿能力和固有冗余作用的集成生物网络。由细胞因子产生的毒性是这些网络改变的结果，通常是由于药物或毒性对目标细胞或器官的过度或不足产生。实施包括电化学发光和基于珠子的Luminex技术的多重平台，允许在同一样本中测量多种细胞因子，通常在血清、血浆和细胞上清中。评估细胞因子依赖于对供试品的作用机制、目标效应的潜力、药代动力学的了解，以及对基本细胞因子生物学的深入了解。通常，评估来自经过处理的动物的血清和血浆中细胞因子浓度的时间过程不会与系统性毒性很好地相关。更有可能产生与或预测细胞因子相关毒性相关的结果的方法是评估整个血液、分离的PBMC或分离的免疫细胞群体暴露于供试品并与适当的药理对照进行比较。实施细胞因子评估应该旨在回答与药物毒性相关的特定问题，应该测量与预测或观察到的毒性最相关的细胞因子，并且数据应被视为对其他免疫毒理学调查的补充。解释细胞因子数据时需要考虑的关键问题包括测定的灵敏度、范围和变异性，混杂的生理条件和生物学变异性，因为对于大多数细胞因子来说，参考范围和历史对照数据不可用或不实用。

在临床前免疫毒理学测试中评估抗原特异性细胞介导免疫是使用细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定或迟发型超敏反应（DTH）测定进行的。这两种测定都测量抗原特异性CD8+ T淋巴细胞识别以前遇到的T细胞依赖性外来抗原在目标细胞表面通过主要组织相容性复合体蛋白呈递并溶解该目标细胞的能力，如CTL测定测量的，或在DTH测定中，抗原重新暴露产生特定抗原的T细胞介导的皮肤红斑或硬结。通过CTL或DTH测定测量的细胞介导免疫需要成功的抗原呈递，随之而来的细胞因子和细胞接触依赖性信号产生T细胞记忆，导致功能性T细胞反应。这些方法之间的关键区别是，有效的CTL反应需要MCH类I和II蛋白的抗原呈递，结果是由体外测量CD8+ T细胞溶解活性产生的。DTH方法涉及通常通过皮肤暴露对抗原进行致敏，然后在解剖上遥远的部位进行挑战或重新暴露，发展红斑、硬结或炎症。可以说DTH测定是细胞介导免疫的更广泛评估，因为可测量的反应不仅需要抗原呈递和CD8+ T细胞记忆，还需要炎症介质的产生，完整的细胞 trafficking，涉及炎症级联的其他组成部分。历史上，CTL和DTH测定都在小鼠或大鼠中进行，这些模型将找到最大量的数据和出版物。也有在大型动物模型中进行CTL和DTH测定，尽管尚未采纳临床前测试的标准协议。

在小鼠或大鼠中进行CTL分析的首选方法使用不同株的活流感病毒。成熟的动物通过鼻内感染选定的病毒株。MCH类I匹配的目标细胞与已知数量的病毒培养过夜或预定时间，然后标记铬51。感染和病毒复制通常几天到一周后，收集脾脏、肺、淋巴结或骨髓并处理成单细胞悬浮液。来自淋巴组织的效应细胞与MHC类I匹配的目标以不同比例或先前确定的单一比例培养。通过比较复制孔的CPM减去自发释放控制除以总释放控制减去自发释放控制，计算每个比例或单一比例的溶解百分比。总释放控制是铬51标记的目标暴露于洗涤剂以获得最大释放到培养介质中。

DTH测定通常通过皮下注射SRBC到小鼠或KLH到大鼠进行，不使用佐剂，尽管可以使用其他抗原，例如卵清蛋白。致敏后，动物通常在一到两周后通过在后脚垫注射SRBC或KLH进行挑战。在相反的脚垫中给予假注射对照，通常是无菌盐水。通常，在挑战后24-72小时，使用弹簧加载或电子卡尺比较接受抗原的脚垫的厚度与假注射对照的厚度。显然，进行DTH测定需要建立最佳的致敏和挑战抗原浓度和反应的时间。此外，执行测定的人员必须有经验，能够执行致敏和挑战注射以及使用卡尺，以确保一致的测量并减少由于技术错误或分析间变异性引起的人为因素。对于NHP的DTH反应评估有很大兴趣，因为许多生物制药只在这些物种中活跃，但目前尚无关于方法的共识，并且不同实验室之间可能存在显著差异。

这一部分专门写给一般毒理学家，提供从单一研究或小型研究系列的角度解释免疫毒性数据的概述，并在安全调查过程中最有可能遇到解释的顺序提出建议。解释免疫毒理学数据应视为供试品作用机制、药代动力学、模型中供试品的生物等效效力和方法使用的基本假设的背景下，因为历史上免疫毒理学测定严重偏向于检测免疫抑制。此外，了解免疫系统的补偿机制和物种特异性免疫差异对于评估免疫毒理学数据是必要的。通常，框架解释的第一步是审查毒理学发现，特别强调骨髓细胞计数的变化、临床病理变化，包括白细胞计数、急性期蛋白、球蛋白水平，以及如果可用，与研究病理学家协商，详细审查一级和二级淋巴器官的组织病理学发现。审查临床发现和相关的兽医记录也可以是有益的，因为需要兽医咨询的全身症状和体征，包括反复感染的迹象、超敏反应、慢性腹泻和反复皮肤病变，特别是化脓性病变，可以是指示免疫力改变的线索。

评估TDAR数据 一级评估是TDAR，评估TDAR数据是通过将高、中、低剂量组与免疫抑制对照组进行比较进行的。配体结合TDAR测定产生定量浓度值，例如，ng/mL或U/mL。阳性TDAR结果是与供试品相关的治疗组中抗原特异性IgM或IgG抗体与免疫抑制对照组相比在预定义的统计显著性水平上的减少。阳性TDAR结果表明抗原特异性体液免疫受损，并表明需要根据本节开头提到的因素进行进一步的免疫学评估。在许多情况下，二级评估，包括免疫表型分析和NK细胞测定，是接下来要进行的测试，是否伴有补体、脾细胞增殖、CTL或DTH的评估。

评估ELISPOT和荧光斑点数据 有多种ELISPOT和荧光斑点测定数据评估方法。这里提出的方法是首先评估测定性能，然后评估与体内研究设计相关的数据。一个建立的ELISPOT或荧光斑点测定应该具有上限和下限定量、定义的线性、复制精密度标准、阴性和阳性对照限制或范围，以及一个统计定义的截止值或平均SFU值，在该值或以上，样本被定义为阳性。这些类型的大多数测定将定义上限定量为在不失单个斑点分辨率的情况下可以检测到的最大SFU，通常为几百SFU。下限定义为无刺激的介质唯一阴性对照的基线SFU，通常范围从单个数字SFU到25 SFU。通常对样本应用统计计算的截止值，在95%或99%百分位数，以设定一个SFU值，超过该值的样本被认为是阳性，使用阴性对照SFU和测定标准差，例如，NC（20 SFU）+ 1.645 × (7 SFU SD) = SFU阳性截止：31.52，四舍五入到32。测定接受标准包括阳性和阴性对照SFU值或范围和样本复制SFU方差标准，通常是变异系数或标准差。通过测定的数据可以通过标准毒理学研究的统计技术进行评估，而不同的技术可能需要用于推断性评估或与疫苗效力相关性。

免疫表型数据分析使用标准参数或非参数统计进行，这些统计赋予值统计显著性，但赋予生物学显著性则稍微复杂一些。解释的主要焦点应该是赋予绝对细胞数量变化的意义，而不是百分比。评估绝对细胞数量的变化最相关，因为每个物种都有一系列免疫细胞数量，需要这些数量才能进行足够的防御，超过或低于这些数量无法启动有效的反应。此时，没有公式化的方法来解释免疫表型数据。解释依赖于将统计显著值与建立的历史正常范围进行比较，同时考虑时间、剂量依赖性和时间-治疗相互作用。在免疫表型分析中纳入恢复间隔特别有用，因为大多数研究设计使用有限数量的收集间隔，可能会提供有限时间范围内发生的群体变化的偏斜视图。此外，通过解释将细胞数量的变化与骨髓细胞计数、血液学值和一级和二级淋巴器官的组织学变化综合起来。尽管免疫表型提供了许多有用信息，但它是一种最好用于检查特定细胞群体、补充TDAR等广泛评估或指向特定群体效应的技术。

评估增殖、NK细胞和细胞介导免疫数据

解释脾细胞增殖、NK细胞测定和CTL是直接的，并且使用标准统计技术来比较处理和未处理动物在增殖、NK或CTL测定中的增殖指数或溶解指数，无论使用的具体方法如何。重要的是采用的方法在刺激或总溶解对照细胞的平均值与未刺激背景或自发释放控制之间有一个大的刺激或溶解指数，以检测增殖或溶解反应的显著损害。免疫抑制由增殖指数或目标细胞溶解的减少表示。DTH测定数据通过比较假注射脚垫的卡尺读数与接受挑战的脚垫进行分析，当使用蛋白质抗原时。可以使用标准统计技术比较处理和对照组的平均值。与假注射对照相比，处理动物组平均卡尺读数的减少或增加表明抑制或增强抗原特异性细胞介导的免疫反应。此外，红斑和硬结可以分配数值等级，以进行半定量评估。

对CH50或AH50测定产生的补体数据的解释完全取决于特定的测定程序、收到的样本质量、使用的阳性血清对照（如果使用）以及在进行测试的实验室产生的参考范围。在CH50和AH50测定中，测试和对照血清的连续稀释与敏感或不敏感的红细胞一起孵化一段时间，然后添加试剂以停止溶解反应。还包括自发和总溶解控制，如果可用，校准的阳性对照血清可能用于构建稀释活性曲线，并在运行之间标准化数据。通过分光光度计计算测定结果，总溶解控制的光密度作为没有阳性对照血清的情况下的最大值。增加的光密度反射增加的溶血。结果报告为溶解每毫升血清中50%的RBC的稀释物的倒数（CH50 U/mL或AH50 U/mL），从概率图、线性回归或KabateMayer图中计算得出。落在建立的参考范围内的动物被认为是正常活性，而那些低于范围的可能有补体合成减少或体内消耗补体介导的免疫复合物激活或固定在起始表面。相反，CH50或AH50的增加可能表明系统性炎症，无激活。评估药物作为载体、佐剂、辅料或直接供试品活性时，比较两个途径很重要，因为它们可能优先激活特定途径。评估由较新的EIA板基方法产生的补体活性数据类似于样本与试剂阳性和阴性对照相比产生百分比活性值，但其优点是同时测试所有三个补体途径，劳动强度较小，并且与常规CH50和AH50测定相比不需要技术水平。与补体筛查测定同时进行的测定C3a和C5a浓度的板基方法提供了可以用于将改变的途径活性与毒性联系起来的数量数据，因为C3a和C5a是由于补体激活而导致毒性的中心介质。只有在收到筛查结果并与经验丰富的补体科学家协商后，才应追求通过RID测定或ELISA方法评估特定补体成分的浓度，因为在没有特定的基于机制的假设的情况下，将生物学意义归因于特定因子浓度的变化可能是困难的。

在临床前测试的背景下解释细胞因子数据可能具有挑战性，因为大多数临床前物种的细胞因子没有可用的参考范围，临床前研究中固有的局限性限制了时间过程研究，并且对细胞因子网络的物种特异性差异了解不足。用于生成细胞因子数据的大多数方法提供从标准曲线外推的浓度数据。细胞因子数据最好用于探索在物种间具有最高一致性的现象，例如，急性期反应、急性和慢性炎症、T和B细胞激活，以及在所有物种中发生的诸如IL-2等关键调节细胞因子的变化。作为一般规则，最好将细胞因子分析限制在与手头的毒理学问题最相关的细胞因子数量最少，并且在物种间具有最大程度的功能同源性。由多重技术引入的当前趋势是，在有限数量的时间点上分析越来越多的细胞因子，这可以产生大量数据，远远超出安全研究设计能够回答的问题的有限数量。

预测免疫毒性测试的需求，可以直接与人类免疫毒性相关联，将在未来十年继续增长，因为免疫调节生物制药和新型基因和细胞疗法的发展速度超过了当前的监管框架。显然需要确定替代测试方法，并扩大测试范围，超出免疫原性、超敏性、免疫抑制和自身免疫。新免疫疗法的作用性质和越来越复杂的机制表明，测试需求应该扩大到包括免疫增强、残留细胞群体表征、抗原表达稳定性和非目标抗原表达。尽管有大量文献针对不同的动物模型和免疫毒理学测定，这些测定可以预测免疫抑制，并且在临床前研究中免疫学评估的复杂性日益增加，但目前的临床前动物模型和测定尚不足以预测人类特定的免疫毒性。这些文献可能表明，我们从以患者为中心的医学角度来解决问题，并实施优化、减少和替代的原则，以消除不必要的测试。预测人类特定的免疫毒性将需要使用人类免疫细胞和组织，鉴于最近在类器官和3D组织培养系统体外系统方面的进步，与推断性动物研究相比，这些系统在特异性、选择性、可重复性和预测能力方面提供了显著的优势。