VCP50-14兽医临床病理学的预分析阶段

另一方面，提供的信息量并不总是与临床相关性成正比。例如，几乎所有物种（从鱼类到人类）的血浆、血清、尿液、唾液和粪便中的皮质醇、皮质酮及其分解代谢物都已被研究作为压力标记。如今，这种分析已不再是最常见的需求。

在将人类研究的信息外推到兽医物种时也建议谨慎。显然，严格技术性的分析前效应（例如全血中的糖酵解，或真空管橡胶塞中的锌泄漏）可能适用于所有物种。然而，真正的基质效应只能通过物种特异性验证研究来评估。以下综述将根据已发表的数据简要概述兽医临床病理学的分析前变异。

前分析子阶段

这一子阶段尚无国际公认的定义。其倡导者的想法是明确区分临床医生选择检测的相关行为与实际的标本采集和管理活动。其他定义包括所有“未在临床实验室进行且不在实验室人员控制下的初始程序” 即标本的采集、识别和运输。这代表了兽医学中经常观察到的情况，即标本的采集和处理由非实验室专业人员在实验室外进行。

在兽医临床病理学中，通常会为宠物提供器官或患者队列特定测试，例如“肝脏组”或“老年特征”，基于这样的假设：所选测试在特定临床环境中提供最佳性价比，但通常没有科学证据。根据现有证据，我们假设在兽医临床病理学中可以且应该优化预分析阶段。

技术预分析因素

血液采集

抗凝剂和管的选择

许多针对人类、宠物、珍稀动物和实验动物的教科书章节或专门的评论文章中都发表了一般性建议。

全血、血浆和血清：抗凝全血是大多数血液学变量的首选样本。教科书通常建议哺乳动物使用钠或钾-EDTA，鸟类、爬行动物和其他一些物种使用肝素或肝素盐。在某些哺乳动物（尤其是猫）中，EDTA 通常会导致血小板聚集和凝结，因此也有人建议使用前列腺素或柠檬酸盐、茶碱、腺苷和双嘧达莫 (CTAD) 的混合物等其他化合物来防止血小板聚集。从用 EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝的样本中获得的细胞计数通常是可比的，包括犬和猫的血小板和网织红细胞浓度。但是，可以根据分析仪以及所使用的技术和试剂来指示验证。

大多数教科书建议使用血清或肝素血浆进行常规生物化学分析，使用柠檬酸钠血液进行凝血，使用氟化钠管测量不稳定分子，如葡萄糖或酮。对于大多数分析物，肝素血浆和血清的生化分析结果非常相似。观察到的一些差异对临床解释几乎没有影响，例如许多犬和禽变量。但对于某些分析物，需要建立特定的血浆和血清参考区间，例如，肝素血浆中的人类胆汁酸比血清中的低约 60%。

血清和不同血浆在生化分析方面的可互换性有些令人惊讶，因为血凝块形成会导致某些分析物浓度的改变。例如，细胞内的分子（如钾）会从细胞中泄漏，因此，在细胞内钾水平高的物种或血栓形成病例中，血浆中的钾浓度可能低于血清中的钾浓度。同时，血凝块形成还会导致分析物的隔离；例如，血清中的平均铜浓度比反刍动物血浆中低约 25%，尽管个体间差异似乎很大。此外，血凝块形成引起的延迟可能会导致不稳定肽等物质的降解。因此，应在添加蛋白酶抑制剂（如抑肽酶）的血浆样本中测定此类分析物。由于纤维蛋白原会干扰 β-球蛋白的迁移，因此应使用血清进行蛋白质电泳。对于狗来说，如果只有血浆，纤维蛋白原就会被乙醇沉淀，除非可以用毛细管电泳法替代。

当从同一患者身上采集多个血管时，应避免携带抗凝剂或其他添加剂。人类临床病理学的建议是先用柠檬酸盐管进行凝固，然后是普通血清管，接着是肝素、EDTA 管和氟化物/草酸盐管。据我们所知，尚未在动物身上研究过不同采样顺序的可能影响，但在某些环境中，最好在普通血清管之后填充柠檬酸盐管，以避免标本开始凝固。

试管类型：出于安全和方便的考虑，玻璃试管已基本被塑料试管取代。塑料试管已被证实对血液学、生物化学、内分泌学和凝血中的大多数分析物都能产生与人类血液相当的结果，但尚未在动物标本中得到验证。

建议谨慎使用含有添加剂（如表面活性剂、涂层和凝胶层）的试管，或进行更好的验证测试，以优化样本的回收或分离。例如，已观察到人体总三碘甲状腺原氨酸的干扰（Stankovic AK, Parmar G. Assay interferences from blood collection tubes: a cautionary note. Clin Chem. 2006; 52: 1627–1628.）。重要的是，应遵守试管的有效期，尽管安全范围通常很大。在用于犬血的锂肝素真空试管中，大多数化学分析物的浓度在有效期后 11 个月内没有改变。

标本采集途径和技术的选择

在大型动物中，从不同大静脉采集的样本，其常规血液学和生化数据通常差别不大，而在较小的物种如实验室啮齿动物或猫中，已报告了统计学上显着的差异。据报道，在大鼠中，通过终末心脏穿刺采集的血液中的 HCT、RBC 和 WBC 计数高于活体眼眶窦或尾静脉采集的血液，而 MCV 和 MCH 相同。一般而言，在实验室啮齿动物中，样本的质量还取决于采样方法。

在人类临床病理学中，留置导管标本采集是常规操作。在实际采集样本之前，如果完全去除死体积，狗的凝血时间和马的常规生化和血液学特征等变量与直接静脉穿刺获得的标本中的变量相当。

皮肤清洁在动物中并不常见，而且没有关于对实验室分析的潜在影响的报告，例如在人类中报告的。相反，正确的技术，特别是对小动物来说，是至关重要的，因为不正确的静脉穿刺会导致不适、血肿或更广泛的组织损伤。这不仅对动物福利有潜在意义，而且对凝血启动和酶活性的虚假增加（例如，由于肌肉损伤导致 CK 活性增加）也令人担忧。

从动物身上采集的血液量包括考虑整体体型和相应的总血量，特别是对于实验室大鼠和小鼠等小动物，当然还有分析需求。经验法则是，去除总血量的 7.5% 以下不会对血液学变量产生再生效应。但是，如果直接用真空管采血，采血量可能会大大超过现代仪器的采血量要求，从而导致标本浪费。因此，对于猫和小狗等小动物，微管是合适的。将血液采集到含有抗凝剂的试管中必须考虑血液和抗凝剂之间的适当比例，因为过量的 EDTA 会导致红细胞收缩等伪影 ，或过量的柠檬酸盐会导致犬血凝固时间延长。

针头和注射器的选择

针头规格、自由流量、注射器和真空管的可能影响尚未得到科学研究和报道。在人体临床病理学中，建议使用足够大的针头规格以避免红细胞的强烈剪切和溶血，出于同样的原因，用注射器抽吸血液时仅施加中等程度的负压。在兽医临床病理学中，采集小动物血液时存在特殊的挑战。例如，可以使用毛细管采集少量血液，这似乎不会导致猫和狗的常规血液学和生物化学变量出现临床相关的差异。在动物园和野生动物中，采血特别具有挑战性，因为它们不习惯被处理。一个有趣的替代方案是使用吸血甲虫，如Dipetalogaster maximus。在兔子中，约 50% 的测量变量（例如 HGB 浓度、HCT、网织红细胞计数、白蛋白、总蛋白、葡萄糖、肌酐、尿素、淀粉酶和镁的浓度以及 ALT 活性）的结果与从常规样本获得的结果没有差异。

其他标本

关于其他生物标本的分析前变异因素的信息更为有限。通常建议快速处理细胞学标本，参考人类临床病理学，而不是特定的动物研究。普遍的共识是，对于大多数标本来说，短时间送至实验室并立即进行分析是首选流程。

尿

与人类不同，动物尿液采集需要约束甚至镇静才能进行导尿或膀胱穿刺，这可能会影响尿液成分。自由采集的样本可能被细菌污染，例如马的样本。

点尿很容易获得，但 24 小时尿液需要使用代谢笼。为了有效使用，动物必须先适应代谢笼几天，例如大鼠需要 3-4 天。此外，代谢笼可能发生 2 个主要变化：(1) 分析物可能不稳定；(2) 分析物在笼壁或漏斗中意外丢失；这需要对笼子进行适当的冲洗，例如，用于测定狗的尿液清除率。

唾液

唾液可以很好地替代血浆或血清，用于测定某些变量；然而，在少数物种中，仅描述了与非常选择性的分析物相关的唾液收集和储存。在狗中，皮质醇浓度与采样条件并没有明显差异，并且在被束缚的前 4 分钟内保持不变。

粪

粪便有时是野生动物潜血检测和内分泌标志物等分析的必需样本。应考虑肉食饮食对分析方法的潜在干扰，如狗和猫的潜血所示。粪便中激素分解代谢物的消除可能有所不同，并不反映消化道运输的直接影响。

脑脊液

通过在样本中添加 10% 血清，可以提高狗和猫脑脊液 (CSF) 中细胞的稳定性。狗和猫（而非马）通过腰椎抽吸收集的脑脊液中的蛋白质浓度几乎是通过寰枕穿刺收集的脑脊液中的蛋白质浓度的两倍。2在狗或马中，完整血液或溶血血液的存在对蛋白质浓度、CK 活性或白细胞计数没有影响或影响很小。

其他体液

滑液。在健康马中，化学成分和白细胞计数根据取样的关节而不同。重复犬样本中的细胞计数没有差异。

腹膜液

在马中，蛋白质含量和细胞计数可能在剖腹手术、阉割或肠穿刺后增加，但在 24 小时内重复取样、血液污染或母马产驹后不会增加。

支气管肺泡灌洗。

在健康狗中，支气管肺泡灌洗 (BAL) 中的白细胞分类计数在右肺和左肺之间以及不同肺叶之间没有差异。大约 2/3 的犬类病例的 BAL 和气管冲洗液的细胞学结果不同。

实验室的标准程序

分析前，建议在专门的摇动平台上轻轻混合，避免剧烈摇晃。最常见的不稳定分析物是葡萄糖，这是由于体外糖酵解所致。因此，建议使用氟化钠管进行可靠的葡萄糖测定。或者，还建议快速处理凝胶分离管中收集的血液。

温度

室温。对于持续时间和温度条件，没有通用的建议，也没有国际公认的变量稳定性定义。一般而言，建议在采集后 2 小时内处理样本以获得最佳结果，但许多分析物即使在室温下也能保持更长时间的稳定。一般而言，常见家养物种的血液学变量保持相对稳定。在储存长达 48 小时的猫 EDTA 血液中，发现 MCV、HCT、网织红细胞和嗜酸性粒细胞计数增加，而 MCHC 和单核细胞计数减少。添加 CTAD 后，影响不太明显。在储存长达 48 小时的犬 EDTA 血液中，测得的 MCV 和 HCT 增加，血小板和单核细胞计数减少。在犬细胞散点图上也可以观察到这些变化。相比之下，在 4–10°C 下储存 3 小时后，鲨鱼（Carcharhinus plumbeus）的白细胞形态发生了扭曲。

同样，许多生化分析物在室温下储存 24-48 小时后相对稳定，尽管如此，如果需要储存，在大多数实验室中，收集血清并将其冷冻在 −20°C 是一种标准程序。此外，为了防止胆红素或原卟啉等光敏分析物的降解，样本必须储存在黑暗中。对于尿液，可用的信息很少。在人类尿液中，在室温下 2 小时和 4 小时后的试纸分析结果相当。

冷藏。关于冷藏对血液学结果的影响的报告存在争议，例如，据报道，犬血小板计数在 3 天内保持稳定 ，但在犬血液中，冷藏样本中的血小板凝结增强。

不稳定的分析物（如儿茶酚胺、促肾上腺皮质激素和其他肽）需要立即冷藏；然而，对于铵的报道却相互矛盾。

冷冻。冷冻不适用于血液学标本，因为细胞会因微晶体的形成而变质，从而导致形态变化和细胞质成分的泄漏。对于血浆和血清，冷冻是长期储存的标准程序；但是，应记录或验证每个物种每种分析物的储存条件。冷冻会极大地改变尿液的成分。冷冻离心的人尿会导致沉淀物形成，并降低钙和蛋白质的浓度，除非在室温和分析前剧烈摇晃标本。在狗中，尿蛋白与肌酐比 (UPC)、白蛋白和胱抑素 C 在 −20°C 下可稳定长达 3 个月。然而，血浆酶活性通常在 −20°C 下长期保持稳定，而尿液酶活性（例如大鼠、兔子和马的 GGT 以及狗和猫的 -N-乙酰葡萄糖胺酶 (NAG)）则因冷冻而部分失活。

血清和血浆样本在解冻后具有分析物的浓度梯度，需要仔细但彻底的均质化。通常不建议对激素、细胞因子和酶等分析物进行重复的冻融循环，然而，犬血浆中的许多常规化学分析物即使经过 3 次冻融循环也似乎没有变化。

离心

相对高速离心（例如，2000 g，10 分钟）是将血浆和血清与血液细胞成分分离的基本程序。同样，细胞学样本有时以低速离心以浓缩细胞，同时保留细胞形态。尿液沉淀物离心制备似乎与400–3900 g范围内的细胞和晶体计数速度无关。

分析前的标本最终质量评估

尤其是在商业参考实验室中，仔细评估标本质量非常重要，因为此类样本通常在或多或少最佳的条件下进行运输。标准监测包括记录血浆和血清的颜色。即使使用比色图表，目测颜色变化也相对不准确，应通过客观技术对其进行量化，就像人类标本所建立的那样。

溶血。

颜色由粉红色变为红色表明存在溶血，这是人类临床病理学中最常见的实验室分析前干扰，在提交的样本中发生率超过 3%。这可能是兽医临床病理学中经常发生的分析前错误。游离血红蛋白会吸收光来干扰光谱测量，因此溶血的干扰程度取决于所用的分析仪和方法。在某些情况下，干扰与溶血强度成正比，因此可以使用校正方程，例如牛和羊的结合珠蛋白。此外，溶血会改变血液学变量，细胞内成分（如离子（如钾）、酶（如 ALT、AST）和蛋白质（主要是 HGB））释放后，生化特征可能会发生偏差。

脂血症通常会导致血清或血浆呈白色至乳白色混浊，具体取决于所含脂质的类型和数量。脂滴相关的光散射会干扰血液学测量，如人类样本中的血小板。同样，当用单色法测量时，许多生化分析物（包括血红蛋白）的光度测量也会受到干扰。脂质取代水会导致离子浓度偏差。在此类样本中，应通过直接而非间接电位法进行离子测量。超速离心、冷藏或“澄清剂”可以减少脂质干扰。其中一些澄清剂已被证实可用于动物样本，例如犬血清中的聚乙二醇。严重的脂血症通常与犬样本溶血增加有关。

黄疸。

胆红素浓度升高或黄疸血浆和血清会干扰化学中的光度读数。

凝块。

在采血过程中，如果出现大块或小块凝块，则表明抗凝不足，这可能是兽医标本被拒收的重要原因。如果在处理前没有仔细检查标本，微凝块可能很容易被忽视。微凝块不仅会导致错误的血液细胞计数和凝血结果，还会堵塞仪器管路或污染采样管。猫科动物样本中会出现微凝块和微观血小板凝块，而犬类 EDTA 血液中出现这种情况则较少。有时可以在解冻的肝素血浆中观察到小的白色薄片。它们的来源尚不完全清楚，而且它们对血浆分析物的可能影响尚未被记录下来。

生物学分析前变异因素

物种、品系、性别和年龄等生物因素只是少数几个定义最明确的因素，它们可能会使实验室数据的正确临床解释变得复杂。此外，生理方面，如生殖周期、营养、气候、品种，以及与野生动物物种血液采样有关的所有情况，如诱捕和镇静，都可能影响检测结果。最近，许多研究已经解决了个体内变异问题。

营养状况和饮食

禁食与单胃动物最为相关。尽管普遍接受，但一些作者认为采样前禁食偏离了正常状态，并且不能改善某些测试的医学解释，例如食物摄入量正常的人的血脂。隔夜禁食是从人类医学中借鉴而来，可降低餐后脂血症的发病率。在动物中，即使是短暂的禁食期也能强烈改变某些分析物的浓度，例如马科动物的胆红素和甘油三酯浓度较高，大鼠的胆红素较高。对于大多数分析物来说，大约 12 小时的隔夜禁食期已经足够。例如，在大鼠、绵羊和猴子中，大多数血液学和化学变量在禁食后 16 小时内几乎没有变化。然而，在健康犬中，空腹尿素或甘油三酯浓度可能明显低于非空腹水平。有趣的是，空腹不会导致某些分析物（例如犬游离脂肪酸）的血浆浓度达到稳态。

很早就有报道称，狗的餐后血糖会升高。进餐可能产生的影响来自消化食物和代谢物的吸收、胃肠道分泌物（如胃酸、胰酶、肝胆汁酸）和激素分泌物（如胰岛素）。在狗和猫中，主要变化包括血浆中尿素、葡萄糖、肌酐、铵、胆汁酸、胰蛋白酶原和甘油三酯的浓度升高，碳酸氢盐浓度降低。重要的是，观察到的变化的强度和持续时间因摄入的食物类型和数量而有显著差异，例如，狗的尿素和肌酐增加，后者在摄入熟肉后比生肉后增加得更明显。

大多数常规检测不受饮食成分的影响。然而，在狗中，饮食变化导致空腹血浆胆固醇浓度发生显著变化，但对甘油三酯、磷脂或 FFA 浓度没有影响。在新生儿中，出生后不久摄入初乳会导致血浆总蛋白和免疫球蛋白水平升高。在反刍动物中，可以通过新生儿血清中 GGT或ALP 活性增加来证明初乳摄入成功。

在实验室啮齿动物和兔子中，需要特别注意生理性食粪症。允许食用粪便的大鼠血浆尿素浓度高出 20-40%，但 HCT 不受影响。据我们所知，生理性食粪症对血浆化学变量的一般可能影响尚未见报道。

压力的影响

压力的定义并不简单，但它可以包括导致肾上腺髓质（急性压力）或皮质（亚急性、慢性压力）细胞激活的任何影响。根据物种和个体条件，任何活动，包括运输、束缚或捕获、工作、环境、社会条件以及在候诊室度过的时间都可能导致压力。

猫在压力下采血可导致高血糖（高达 25 mmol/L）、高乳酸血症和淋巴细胞增多症。应避免因捕获和束缚野生动物而导致的应激，这完全出于动物福利的考虑。捕获的动物应有一段恢复和适应期，然后才能进行实验室采样。处理和采样可导致小型实验室动物应激。

据报道，重复采样会导致兔子血浆 CK 活性增加，猴子血浆皮质醇浓度升高，因此动物训练和调理应成为研究机构的标准做法。在增加家禽血浆皮质酮和乳酸浓度方面，处理的持续时间比使用的轻柔或粗暴处理程序的影响更大。据报道，在牛中，搬运以及与运输相关的身体疲劳、脱水和营养不良会影响应激指标水平的浓度（例如，血浆儿茶酚胺和糖皮质激素浓度升高、总白细胞和中性粒细胞计数增加、T 淋巴细胞计数减少、肌肉酶（如 CK）活性增加）。

有趣的是，运输方式本身并不影响应激反应，例如，在被运送到相邻房间进行安乐死的小鼠和通过飞机运输的大鼠中，血浆皮质酮浓度的增加是相似的（大约 2-3倍）。

药物和污染物的影响

药物和污染物既可以影响分子本身，也可以影响其代谢物。干扰分析技术的一个例子是接受溴化物治疗的狗的血浆氯化物浓度假高。药理作用的一个例子是在内在或外在肾上腺皮质刺激增加的情况下，由于特定同工酶的诱导而导致 ALP 活性增加。一种罕见的影响，迄今为止仅在人类中报告过，是干扰含有高浓度肌酐的地塞米松制剂的赋形剂。

在许多情况下，采样前镇静或麻醉是强制性的，要么是为了遵守动物福利法规，要么是如果程序持续时间超过动物的配合时间。镇静效果通常很小，几乎不会造成潜在的临床误解。然而，它们根据所用的药物、关联和剂量而有显著差异，这意味着任何新的和非标准程序都必须在解释镇静动物的结果之前进行验证。在麻醉的人中，体位会导致水分转移，从而导致分析物浓度的相应变化。据我们所知，除了长时间卧位会导致患乳热病的倒地奶牛血浆中 AST、LDH 和 CK 活性增加外，动物中尚未记录体位的影响。

一般而言，法律规定必须解决药物化合物在动物身上可能产生的不良治疗相关影响，有时还会公布导致肾脏或肝脏损伤的化合物及其相应的临床病理学结果。糖皮质激素和非甾体抗炎药 (NSAIDS) 引起的治疗相关影响是研究最多的领域。通常，由于中性粒细胞增多，白细胞数量增加，而淋巴细胞和嗜酸性粒细胞减少。ALP 活性和铁浓度增加在狗身上很常见。

生物节律

虽然短期研究中非常严格的实验设计可以被视为具有代表性，但实验室结果可能受到生物节律或内分泌周期的影响，包括生殖周期，以及野生动物中主要与气候和位置相关的行为、可用食物的数量和类型、长距离迁徙或鸟类换羽等。仔细记录相关参数和变量将有助于避免得出错误的结论。特定分析物的昼夜节律可能因物种而异；例如，血浆糖皮质激素在人类的早晨达到峰值，在大鼠的傍晚达到峰值，而狗几乎没有变化。不同小鼠品系的红细胞和白细胞计数的昼夜波动已被描述。

环境及生活条件

管理和饲养实践也会影响某些血液变量，例如挤奶频率会改变血浆游离脂肪酸 (FFA) 和 β-羟基丁酸浓度。对于野生动物而言，环境因素会显著影响某些变量，建议仔细区分散养动物和圈养动物。寄生虫感染后，营养状况和整体健康评估可能会有很大差异，必须非常仔细地记录下来。在实验室动物中，丰富的举措对常规小鼠血液学结果没有显着影响，除了个体间差异增加。有趣的是，在未经训练的食蟹猴中，血清甲状腺激素浓度随着猴子观察到配偶被放血的滞后时间的增加而降低。

运动

关于训练效果的文献并不多，例如纯种马在高强度训练后心脏肌钙蛋白 I 浓度没有增加。重要的是，训练效果可能取决于受试个体的健康水平，例如，训练有素和适应不良的马的变化可能不一样。体力活动相关的影响因活动类型不同而有很大差异。在狗中，最显著的变化是 PCV 的适度增加以及血浆乳酸和铵浓度的显着增加。由于实验室变量变化的强度和持续时间取决于体力活动的强度和持续时间，因此应避免在运动后不久进行血液采样，因为这些值可能不代表“正常”或“健康”情况。

结论

可能影响实验室分析结果的分析前因素有很多，并且可能具有累积或补偿效应。虽然不可能控制所有分析前因素，但实施明确定义的标准实践可以帮助避免其中许多因素。正如 ECVCP 和 AVCP 所建议的那样，公认的分析前影响以及仔细和详细的记录将有助于进一步提高兽医临床病理学的整体分析性能，并要求认证实验室遵守 SOP。