IF-23.5 | 单细胞转录组学解析嗅觉神经母细胞瘤的分子亚型、肿瘤微环境异质性及精准治疗潜在靶点

1. 样本采集

• 收集10例未经治疗的ONB患者肿瘤样本及1例正常嗅觉粘膜样本（OM2）。

• 使用10x Genomics平台对96,325个单细胞进行转录组测序。

2. 数据预处理

• 质控：过滤低质量细胞，保留基因表达数>200和UMI计数>500的细胞。
• 降维与聚类：基于主成分分析（PCA）和UMAP进行降维，采用图形化聚类识别细胞簇。

3. 肿瘤细胞鉴定

• 使用推断的拷贝数变异（CNV）评估恶性潜力，将肿瘤上皮细胞与正常样本中的非恶性细胞区分。

4. 肿瘤亚型分类

• 应用非负矩阵分解（NMF）从10例ONB样本中提取表达程序，聚类生成meta-program模块，注释为神经型（Neural）、基底型（Basal）和间质型（Mesenchymal）。

5. 肿瘤微环境分析

• 对免疫细胞、基质细胞和恶性细胞进行重新聚类，探讨细胞亚群的功能及其在肿瘤中的分布。

• 采用GSVA和CellPhoneDB分析细胞间的信号通路及功能富集。

6. 功能验证

• 使用患者来源的异种移植（PDX）模型验证肿瘤亚型的药物敏感性。

• 通过免疫组化（IHC）检测NBM分类标志物的表达水平，评估分类在临床中的适用性。

7. 数据分析

• 差异表达分析（DEG）：比较正常细胞与恶性细胞之间的基因表达差异。

• Pseudotime分析：重建正常嗅觉细胞到恶性细胞的分化轨迹，解析肿瘤的发病机制。

1：单细胞转录组图谱

• Fig. 1a: 研究共采集10例ONB样本和1例正常OM样本，单细胞转录组测序覆盖96,325个细胞，其中ONB细胞85,452个，OM细胞10,873个。
• Fig. 1b: UMAP分析分为11个细胞簇，包括7种免疫细胞（如巨噬细胞和T/NK细胞），3种基质细胞和1种上皮细胞。
• Fig. 1c: 恶性上皮细胞（24,641个）分为7个亚群，其他细胞类型（如T/NK细胞和巨噬细胞）进一步细分。
• Fig. 1d: 恶性上皮细胞具有最高的基因表达量（平均2,300个基因），细胞群体间基因表达差异显著。

• Fig. 2a: 恶性上皮细胞分为7个亚群（C1-C7），空间分布显示显著异质性，其中C1和C2为神经型，C3为基底型，C4-C6为间质型，C7与纤毛相关。
• Fig. 2b: 神经型细胞富集CHGB和NEUROD1，基底型细胞富集MKI67和UBE2C。
• Fig. 2c: 非负矩阵分解（NMF）提取40个表达程序，聚类为5个模块，揭示神经型、基底型及间质型的独特表达特征。
• Fig. 2d: 神经型模块关联嗅觉发育和神经发生，基底型模块关联细胞周期，间质型模块富集TGF-β信号和EMT通路。
• Fig. 2e: 模块评分显示神经型、基底型和间质型在恶性亚群中有显著差异。
• Fig. 2f: 恶性上皮细胞的7个亚群根据特征分为神经型、基底型、间质型及纤毛相关亚群。
• Fig. 2g: 高Hyams分级（III-IV）肿瘤中基底型细胞比例更高（P < 0.01）。
• Fig. 2h: 神经型细胞富集神经发育途径，基底型细胞富集细胞周期，间质型细胞关联EMT、血管生成和炎症信号。

3: NBM分类及临床意义

• Fig. 3a: NBM分类系统通过三元图显示神经型、基底型和间质型的分布，部分样本混合表达多个特征，少数为单一亚型。
• Fig. 3b: bulk RNA-seq数据中，23名患者的肿瘤按NBM分类分为神经型（CHGB高表达）、基底型（Ki-67高表达）和间质型（CTGF高表达）。
• Fig. 3c: IHC验证显示Ki-67、CHG和CTGF分别标志基底型、神经型和间质型患者。
• Fig. 3d: 基于IHC的分型显示，30例患者按NBM分类的一致性达100%。
• Fig. 3e: Hyams分级显示，基底型肿瘤分级显著更高（P = 0.002）。
• Fig. 3f: 无病生存率分析表明，间质型患者的无病生存率最高（P = 0.024）。

4: 肿瘤细胞的起源

5: 肿瘤免疫微环境中的T细胞特征

• Fig. 5a: T/NK细胞的UMAP聚类显示5个CD8+亚群、5个CD4+亚群和2个NK亚群，其中CD8+ T细胞主要分布在肿瘤组织。
• Fig. 5b: 热图显示耗竭性CD8+ T细胞（PDCD1高表达）在ONB中显著富集。
• Fig. 5c: CD8+细胞分化轨迹揭示效应细胞（GZMH高表达）向耗竭细胞（PDCD1和LAG3高表达）转变。
• Fig. 5d: CD8+细胞的功能评分显示，基底型肿瘤中细胞周期和耗竭特征显著（P < 0.01）。
• Fig. 5e: CD4+细胞分化轨迹显示从初始细胞向Treg和TFH细胞的分化路径。
• Fig. 5f: Treg细胞显示CTLA4和FOXP3高表达，为肿瘤免疫抑制的关键成分。
• Fig. 5g: 细胞功能评分表明，基底型患者可能更适合免疫检查点抑制剂治疗。

6: 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的异质性

• Fig. 6a: UMAP聚类显示巨噬细胞的5个主要亚群（Macro-C1QA、Macro-CD163等），SPP1亚群与肿瘤促血管生成相关。
• Fig. 6b: TAM中Macro-SPP1亚群在低氧和基质重塑相关通路中显著富集（P < 0.01）。

7: 肿瘤微环境的细胞互作

• Fig. 7a: CellPhoneDB分析显示间质型肿瘤细胞通过TGF-β信号与巨噬细胞的相互作用最显著。
• Fig. 7b: 信号通路分析表明，EMT和血管生成在间质型肿瘤中占主导地位。

8: 药物敏感性和治疗策略

• Fig. 8a: PDX模型显示间质型肿瘤对抗血管生成药物Endostatin敏感，基底型肿瘤对细胞周期抑制剂Doxorubicin敏感。
• Fig. 8b: 联合治疗（放疗+Endostatin）对间质型肿瘤的抑制效果显著优于单独放疗（P < 0.01）。

1. 肿瘤亚型分类

• ONB被分为三种主要亚型：神经型（Neural）、基底型（Basal）和间质型（Mesenchymal）。

• 基底型与细胞周期和增殖相关，间质型与EMT和血管生成相关，神经型与嗅觉发育和神经发生相关。

2. 肿瘤内部异质性

• 恶性上皮细胞表现出显著的分子异质性，7个亚群对应不同的分子特征和功能路径。

• 基底型细胞比例与高Hyams分级（III-IV）显著相关。

3. 肿瘤微环境特征

• TME中免疫细胞（如CD8+耗竭T细胞）和巨噬细胞（Macro-SPP1亚群）显著富集，与肿瘤促进相关。

• 间质型肿瘤细胞通过TGF-β和VEGF信号与TME的巨噬细胞显著互作。

4. 肿瘤细胞起源

• 神经型肿瘤细胞来源于嗅觉神经前体细胞，基底型来源于球状基底细胞（GBCs），间质型来源于支持细胞谱系。

5. 差异基因与功能分析

• 肿瘤细胞高表达TUBB3（与耐药性相关）、HES6等促进肿瘤发生和发展的基因。

• GSVA分析显示，不同亚型分别富集神经发育、细胞周期及基质重塑功能通路。

6. 临床意义与验证

• 基于NBM分类的IHC标志物（Ki-67、CHG和CTGF）在临床上验证了分类的可操作性。

• 无病生存率显示间质型患者预后最佳（P = 0.024）。

7. 药物敏感性研究

• PDX模型验证显示基底型对细胞周期药物（Doxorubicin）敏感，间质型对抗血管生成药物（Endostatin）敏感。

• 联合治疗（放疗+Endostatin）显著提高间质型肿瘤的抑制效果（P < 0.01）。