Nature Genetics | 炎症新靶点-CRISPR筛选揭示TNF mRNA的m6A修饰在巨噬细胞炎症调控中的关键作用

1. 实验设计

研究采用了CRISPR筛选策略，结合了murine骨髓衍生巨噬细胞（mBMDM）和人单核细胞来源巨噬细胞（hMDM）的筛选。

• 第一阶段：在mBMDM中进行全基因组筛选，以识别炎症相关的负调控基因。

• 第二阶段：在人类巨噬细胞中使用单细胞CRISPR筛选，以验证在mBMDM筛选中发现的基因。

• 第三阶段：对靶基因进行细胞因子分泌谱分析，确定其在炎症状态中的功能角色。

2. mBMDM全基因组CRISPR筛选

• 基因编辑方法：在mBMDM中通过慢病毒转染单导向RNA（sgRNA）库，并电穿孔Cas9蛋白，实现基因敲除。sgRNA库包含152,339条sgRNA，每个基因靶向8个sgRNA。

• 细胞处理：实验中使用75只小鼠提取的骨髓细胞，转染后进行IFNγ刺激以诱导炎症状态，使用iNOS（诱导型一氧化氮合酶）表达作为筛选指标。

• 筛选和检测：通过流式细胞术分选iNOS高表达的mBMDM细胞群（iNOShi），提取并测序sgRNA，识别在炎症条件下显著富集的基因。

3. hMDM单细胞CRISPR筛选

• 细胞来源：使用人外周血单核细胞（PBMC），分离CD14+单核细胞，并通过非病毒Cas9电穿孔实现基因敲除。

• 基因编辑方法：采用包含四条sgRNA的Cas9核糖蛋白复合物（Cas9-RNP），电穿孔到巨噬细胞中。每个靶基因使用4条sgRNA，使用两种标签寡核苷酸（HTO）标记不同扰动。

• 单细胞RNA测序：在10× Genomics平台上进行单细胞RNA测序，生成176,564个单细胞表达谱，用于解析每个基因敲除的转录响应。

• 降维分析：使用统一流形近似和投影（UMAP）和主成分分析（PCA）来评估细胞状态，区分不同的基因扰动效应。

4. 细胞因子分泌谱分析

• 目标基因选择：选择在炎症状态（P01–P05）中具有显著效应的7个靶基因，验证其对细胞因子分泌的影响。

• 检测方法：在IFNγ刺激条件下，利用ELISA或Luminex平台定量检测不同扰动条件下的细胞因子（如TNF、CXCL10、SPP1、CCL3等）分泌量，以确定特定基因对细胞因子谱的调控作用。

5. m6A修饰分析

• m6A-eCLIP实验：在hMDM中进行m6A增强交联和免疫沉淀（m6A-eCLIP）分析，检测TNF mRNA的m6A修饰位点。使用WTAP或ZC3H13敲除细胞作为对照，比较修饰位点变化。

• TNF mRNA稳定性测定：在敲除WTAP或ZC3H13后，通过actinomycin D处理抑制转录，检测TNF mRNA的降解速率以评估m6A对mRNA稳定性的影响。

• 位点特异性突变实验：构建TNF 3′UTR的m6A突变体，将其与报告基因融合，并比较WT和突变体TNF的表达稳定性。

6. PheWAS分析

• 数据来源：使用UK Biobank的全基因组测序（WGS）数据和1,695种表型的二分类分析，检测可能影响TNF m6A修饰的SNP与人类疾病的关联。

• 分析方法：聚合DRACH序列上与m6A修饰位点相关的SNP，通过PheWAS分析评估与各种炎症性疾病（如多囊肾病）的关联。

1. 巨噬细胞状态的调控网络

基因扰动对五种炎症性巨噬细胞状态（P01-P05）的影响分析显示，这些状态分别具有特定的基因特征和功能。

• 抗原呈递（P01）：与MHC II相关的IFNγ反应基因显著富集，敲除SOCS1（抑制JAK/STAT信号的主要调控因子）导致P01的上调，表明SOCS1是该程序的负调控因子。

• 髓系细胞募集（P02）：由CCL2和S100A8/A9主导，与细胞迁移相关。RFWD2的敲除显著上调P02，增强了JUN和CEBPD等转录因子的活性，表明RFWD2可能通过调控AP-1和CEBP家族蛋白的降解来调控髓系细胞的募集。

• 炎症性细胞因子（P03）：特征性为CCL3、CCL18、CCL4等炎症因子的高表达。TNFAIP3、WTAP和ZC3H13的敲除显著上调P03，显示m6A修饰在抑制NFκB介导的炎症信号中具有重要作用。

• 骨桥蛋白（P04）：SPP1表达显著，表明该状态与缺氧环境下的巨噬细胞状态相关。EGLN1的敲除（缺氧条件下的负调控因子）导致P04上调，提示该状态可能代表一种缺氧适应状态。

• 载脂蛋白（P05）：特征为APOE和APOC1高表达，mTORC1通路的抑制与该状态显著相关，表明营养代谢失调与肿瘤微环境中的巨噬细胞状态密切相关。

2. 细胞因子分泌谱的影响

• P01的CXCL9和CXCL10分泌：如预期，SOCS1敲除后显著增加了CXCL9和CXCL10的分泌，表明SOCS1对抗原呈递相关的细胞因子具有负调控作用。
• P03的TNF、CCL3和CCL4分泌：敲除TNFAIP3、WTAP和ZC3H13显著提升了TNF、CCL3和CCL4的分泌，显示了m6A修饰在NFκB信号下游的抑制作用。这一结果表明m6A修饰是巨噬细胞炎症反应的重要负调控机制。

3. WTAP在多种疾病状态下的表达特征

• P03富集和WTAP表达：在类风湿性关节炎、系统性硬化症和Crohn病等炎症病灶的巨噬细胞中，P03状态显著富集，且WTAP表达明显上调。RNA原位杂交验证了WTAP在这些病理条件下的表达，尤其是与CCL3的共定位，表明WTAP可能在这些炎症状态中作为一个内在调控机制来限制TNF驱动的炎症。

4. WTAP和ZC3H13对旁分泌效应的调控

• 内皮细胞激活：WTAP或ZC3H13扰动的hMDM条件培养基处理人类内皮细胞显著增加了ICAM-1和VCAM-1的表达，表明TNF驱动的旁分泌效应。
• 肠上皮屏障破坏：相同条件下的培养基破坏了肠上皮屏障，TNFRII-Fc抑制剂能够有效逆转该效应，显示WTAP和ZC3H13扰动可能通过旁分泌TNF影响肠道屏障完整性。

5. TNF mRNA的m6A修饰和稳定性

• TNF mRNA的半衰期延长：WTAP或ZC3H13的敲除延长了TNF mRNA的半衰期并增加了TNF蛋白水平，表明m6A修饰通过促进mRNA降解来抑制TNF表达。
• 位点特异性分析：m6A修饰位点集中于TNF mRNA的3′UTR区域，突变该位点显著延长TNF mRNA的半衰期并提高TNF蛋白水平，进一步确认了m6A在调控TNF稳定性中的关键作用。

6. m6A相关SNPs与多囊肾病的关联

使用PheWAS分析了可能影响TNF m6A修饰的SNPs与多种人类疾病的关联。

• P03在多囊肾病中的富集：多囊肾病的巨噬细胞中P03状态显著富集，并且该状态在TNF调控的炎症过程中起到重要作用。这表明TNF mRNA的m6A修饰位点变异可能通过调控TNF的稳定性影响特定炎症疾病的易感性。

7.TNF mRNA的m6A修饰与多系统炎症的关联

• 图8a - IFNγ诱导的m6A修饰机制：在IFNγ诱导条件下，TNF mRNA低水平表达，并通过m6A写入复合物（如WTAP、ZC3H13、METTL3和METTL14）进行m6A修饰。这种m6A标记可被特异性m6A读取蛋白（如YTHDF2）识别，YTHDF2通过促进转录物的降解来维持TNF表达的低水平状态，限制炎症信号的过度激活。
• 图8b - m6A修饰缺失对TNF表达的影响：当m6A写入复合物的任一组分被敲除或耗竭时，TNF mRNA无法被修饰，这使得其无法被YTHDF2等m6A读取蛋白识别并降解。未修饰的TNF mRNA因此得以积累，导致TNF蛋白水平显著增加。TNF的升高通过自分泌和旁分泌作用激活TNF受体，驱动P03状态的表达，增强炎症反应。

1.研究目标：通过基因组筛选和功能组学分析，系统解析巨噬细胞中m6A修饰在炎症状态调控中的作用，特别是其对TNF mRNA稳定性的影响。

2.筛选方法：

• 使用CRISPR筛选技术在murine骨髓衍生巨噬细胞（mBMDM）和人类单核细胞来源巨噬细胞（hMDM）中识别调控巨噬细胞炎症状态的基因。

• 重点验证了m6A写入复合物的四个核心组分：METTL3、METTL14、WTAP和ZC3H13。

3.m6A修饰机制：

• 正常情况下，m6A修饰通过m6A读取蛋白（如YTHDF2）识别并降解TNF mRNA，维持TNF的低水平表达，限制炎症反应。

• 当m6A写入复合物被敲除时，TNF mRNA未修饰的累积导致TNF蛋白水平升高，从而驱动巨噬细胞进入TNF驱动的P03炎症状态。

4.PheWAS分析：

• 分析UK Biobank数据表明，与TNF m6A修饰相关的SNP可能与炎症性疾病（如多囊肾病）显著相关。

• 提示m6A调控的TNF稳定性可能影响特定的炎症病理。