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医学科研新动向
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Clinical functional proteomics of intercellular signalling in pancreatic cancer
Nature
<2024年11月13日>
研
究
背
景
研究设计
2. S–PM蛋白质组富集：应用基于氢化肼的化学技术，特异性富集细胞膜和分泌蛋白（S–PM蛋白），并使用PNGase F去糖酶处理糖基化位点，生成独特的糖肽谱，以此进行深层次的糖蛋白质组表征。氢化肼的使用有效结合N-糖基化的蛋白质位点，从而获取高覆盖率的糖基化蛋白质组。
3. 质谱分析：
采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台，通过高pH反相色谱对样品进行五步分级，增强了低丰度糖蛋白的检测敏感性。
使用无标记定量（LFQ）质谱方法，以评价不同样本中蛋白质的相对表达水平，分析差异表达蛋白，并筛选FDA已批准的药物靶标。
4. 空间蛋白质组学分析：
对13例PDAC肿瘤样本进行激光捕获显微切割（LCM），分别分离出癌细胞区域和基质细胞区域。
采用LC-MS/MS对空间分辨的蛋白质组数据进行定量分析，确定特异性富集于癌细胞或基质细胞中的S–PM蛋白，生成细胞类型特异的蛋白质组数据集。
5. 时间动态蛋白质组学：
使用KPC（Kras LSL-G12D/+; Trp53 flox/flox; Pdx1-cre）小鼠模型，采集不同肿瘤进展阶段的样本（3周、5周和7周），以表征S–PM蛋白在肿瘤早期、中期和晚期的表达动态。
定量分析与人类PDAC样本中蛋白的表达趋势一致的蛋白质，以揭示PDAC进展过程中潜在的生物标志物。
6. 磷酸化酪氨酸（pTyr）信号轴富集分析：
采用光反应磷酸化酪氨酸（pTyr）蛋白复合物富集探针（Photo-pTyr-scaffold）和SH2超强结合体为基础的pTyr肽段富集技术，获取pTyr相关的蛋白复合物及其特异性位点。
分析pTyr级联的活性状态，包括pTyr写入者（激酶）、读取者（含SH2或PTB结构域的蛋白）和擦除者（磷酸酶），以构建癌细胞和基质细胞间的信号网络。
7. 膜蛋白剪切分析：
建立生物信息学分析流程，通过计算细胞分泌蛋白与质膜蛋白的胞外域（ECD）和胞内域（ICD）肽段比例筛选出被剪切的膜蛋白。
使用MMP家族蛋白酶的特异性siRNA敲低，验证膜蛋白的剪切调控，确定特定MMP在PDAC肿瘤微环境中对膜蛋白剪切的影响。
核心结果
1：PDAC样本中S–PM蛋白的深度分析
总计鉴定出2741种S–PM蛋白和6181个非冗余的N-糖基化位点，约占人类预测S–PM蛋白质组的一半。
PDAC肿瘤样本中鉴定出1000多种差异表达的S–PM蛋白，且与正常组织相比，上调的蛋白包括31种已知癌症标志物（如MUC1、CEACAM5）和91个FDA批准药物靶标（如IGF1R、AXL）。
其中蛋白质表达量跨度达到四个数量级，大部分差异蛋白在从正常组织到肿瘤的过程中逐步上调。
2：PDAC中S–PM蛋白的空间和细胞类型特异性分布
在空间分辨的蛋白质组数据中，共计鉴定出约1400种S–PM蛋白，其中787种富集于癌细胞区域，584种富集于基质细胞区域。 在分子功能上，基质细胞富集的蛋白主要与细胞外基质和蛋白酶活性相关，如LUM、COL1A1，而癌细胞富集的蛋白包括代谢和转运蛋白，如SLC2A1。 在癌细胞中筛选出6种显著上调的膜蛋白，通过TSA染色验证其在PDAC中的表达，为癌症靶向治疗提供了潜在标志物。
3：KPC小鼠PDAC模型中肿瘤进展过程的时间动态分析
在3周、5周和7周的肿瘤样本中，分别鉴定出约1500种S–PM蛋白。与正常样本相比，3周样本更接近正常组织，而5周和7周样本显著偏离。
基于表达模式的聚类分析将S–PM蛋白分为三大类：第1类为早期高表达蛋白，第2类为中期上调蛋白，第3类为晚期富集蛋白，包括与细胞粘附和基质重构相关的蛋白（如THBS2、CTGF）。
例如，蛋白TNFRSF11B（第2类）和NPTX1（第3类）在PDAC患者血浆中显著升高，显示出其作为PDAC早期生物标志物的潜力。
4：pTyr介导的信号网络分析
在肿瘤样本中，共鉴定出464种pTyr蛋白，其中包括51种激酶、94种含SH2/PTB结构域的蛋白和46种磷酸酶。 PDGFRB、PTPN11、TLN1等pTyr蛋白在肿瘤样本中显著上调，并具有特定pTyr位点，提示其在PDAC TME中信号通路活性增强。 特别是PDGFR–PTPN11–ERK信号轴在PDAC基质细胞中高度活跃，通过抑制PDGFR显著降低LIF分泌水平，揭示其在癌症信号传导中的关键作用。
5：PDAC中膜蛋白的外膜切割及其剪切酶调控
通过ECD和ICD比值计算筛选出PDAC中22种剪切膜蛋白，包括AXL、MET、EPHA4等RTK相关蛋白。
MMP家族蛋白酶在肿瘤组织中显著上调，其中MMP1和MMP11在PDAC剪切事件中起重要作用。敲低MMP1和MMP11显著降低AXL的剪切水平。
剪切的AXL水平（sAXL）在PDAC肿瘤区域显著高于全长AXL，且sAXL与GAS6共表达，提示其在PDAC肿瘤微环境中作为重要的信号调节机制。
6：AXL剪切抑制对PDAC肿瘤生长的协同抑制作用
PRM分析显示PDAC肿瘤组织中剪切AXL的ECD水平约为全长AXL的3.5倍。sAXL与GAS6的水平在41例肿瘤患者样本中与淋巴结转移呈正相关。
R428（AXL抑制剂）与BB-94（MMP抑制剂）的联合治疗显著抑制PDAC肿瘤的增殖，并在PDX模型中表现出协同抗肿瘤效果。
ELISA结果显示sAXL和GAS6在PDAC患者血浆中显著升高，与传统肿瘤标志物CA19-9组合可提高诊断AUC值（0.90），显示出AXL剪切作为血液生物标志物的潜力。
小
结
该研究的核心发现的简要总结：
PDAC中S–PM蛋白的富集：PDAC肿瘤中鉴定出超过1000种差异表达的S–PM蛋白，包括多个已知癌症标志物和药物靶标。 空间和细胞类型特异性蛋白质组分布：癌细胞和基质细胞在特定蛋白质表达上显著不同，基质细胞富集细胞外基质相关蛋白，而癌细胞富集代谢相关转运蛋白。 PDAC进展阶段的动态变化：PDAC进展过程中蛋白质组表现出显著的时间特异性变化，晚期肿瘤中细胞粘附和基质蛋白的上调与肿瘤微环境的重塑密切相关。 pTyr介导的信号通路：在PDAC的基质细胞中，PDGFR–PTPN11–ERK信号轴显著活跃，调控LIF分泌，揭示其在癌细胞和基质细胞相互作用中的重要作用。 膜蛋白的外膜切割：MMP家族蛋白酶在PDAC中高表达，并通过剪切AXL等膜蛋白在肿瘤微环境中发挥关键调控作用。 AXL剪切抑制的协同抗肿瘤效果：R428与BB-94联合抑制PDAC肿瘤生长，剪切AXL和GAS6水平显著升高与淋巴结转移正相关，展现了AXL剪切在PDAC诊断和治疗中的潜力。
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