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医学科研新动向
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Multi-omics reveal immune microenvironment alterations in multiple myeloma and its precursor stages
Blood Cancer Journal
<2024年11月06日>
研
究
背
景
研究设计
收集来自不明意义的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）、惰性多发性骨髓瘤（SMM）、新诊断多发性骨髓瘤（NDMM）患者以及健康供体的骨髓样本。MGUS和SMM患者分别为122例和122例，NDMM患者为704例，健康供体为67例。样本来源于骨髓活检和骨髓抽吸，数据收集时间跨度长达5至20年，以获得充分的临床随访信息。 配对样本选择：包含6例MGUS，4例SMM和4例NDMM样本，用于单细胞RNA测序分析，以便观察个体样本中免疫细胞成分随疾病进展的变化。
使用CIBERSORT算法对基于mRNA的基因表达谱（GEP）数据进行分析。CIBERSORT利用MGSM27基因矩阵从样本中重构出27种骨髓细胞类型。 剔除肿瘤负荷的影响：为避免浆细胞数量在不同阶段的差异导致分析偏差，计算过程中剔除样本中的浆细胞比例，使得总比例加和为100%。 比较MGUS、SMM、NDMM及健康供体之间的细胞成分差异，并对中性粒细胞、肥大细胞和单核细胞等主要细胞类型进行生存分析。
对MGUS、SMM、NDMM患者和健康供体的骨髓样本进行质谱流式细胞术（CyTOF）分析，重点分析细胞表面和功能标志物的表达。 使用FlowSOM聚类算法对样本的细胞类型进行分群，形成17个亚群（metaclusters），其中包括巨核细胞、CD16+单核细胞、终末分化效应记忆T细胞（CD8+ Temra）、中心记忆CD4+ T细胞（CD4+ Tcm）等。 通过CyTOF数据检测关键细胞亚群（如CD16+单核细胞、浆细胞样树突细胞（pDCs）、不成熟粒细胞等）的组成比例，并进一步分析免疫功能标志物的表达，包括补体抑制蛋白CD55、CD59及抗原呈递标志物HLA-DR。
选取一部分MGUS、SMM和NDMM样本进行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）分析，以观察疾病进展过程中的免疫细胞转录水平变化。 利用10x Genomics平台，对来自骨髓的细胞进行RNA测序。通过基因表达水平聚类分析，识别出12个细胞群体，包括髓源性树突状细胞（mDCs）、CD16+单核细胞、NK细胞和T细胞等。 进一步进行mDCs和NK细胞的亚群分析，基于基因标志物（如ADAM8、S100A8、GINS2等）对mDCs进行分亚群，对NK细胞进行子聚类（如CX3CR1+GZMB+、XCL1+GZMK+亚群），以揭示其在不同疾病阶段的功能变化。 对T细胞亚群（如GZMB+ CD8+ T细胞和GZMK+ CD8+ T细胞）进行高分辨率聚类，并分析TME中特异性基因的差异表达，重点关注细胞毒性标志物（如GZMB、PRF1）、干扰素应答基因（如IFI44、OAS2）及细胞应激反应相关基因（如HSPA1B）。
对不同组别样本中各细胞群体的比例差异使用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析。 对临床结局的生存分析（总生存期OS、无事件生存期EFS）使用Kaplan-Meier法，并通过Log-rank检验比较高低组患者的生存率。 对免疫细胞比例和疾病进展时间进行相关性分析，使用Pearson相关系数进行统计显著性检验，评估中性粒细胞、CD8+ T细胞等细胞类型与疾病进展风险的关联。 使用Bonferroni和Benjamin-Hochberg校正多重比较，以确保结果的统计显著性。
核心结果
1：粒细胞比例减少与MM预后不良相关
粒细胞（特别是中性粒细胞）比例显著降低，与新诊断的多发性骨髓瘤（NDMM）患者的不良预后相关。
在惰性多发性骨髓瘤（SMM）患者中，高中性粒细胞比例与较短的疾病进展时间相关；而在NDMM患者中，高中性粒细胞比例预示更高的总生存率（OS）及无事件生存率（EFS）。
高风险GEP-70患者及国际分期系统（ISS）III期患者中中性粒细胞比例显著减少，提示低粒细胞比例可作为NDMM患者不良生存预后的预测因素。
在MGUS阶段即检测到CD16+单核细胞及浆细胞样树突细胞（pDC）表面HLA-DR的表达降低，提示髓源性抗原呈递功能在早期阶段已削弱。 CyTOF分析显示pDC和不成熟粒细胞在MGUS和SMM阶段显著减少，而CD16+单核细胞比例显著增加。
MM及其前驱阶段的mDCs数量减少，且应激反应及免疫应答基因的表达显著降低。 VSIG4+ mDC亚群的比例在MM肿瘤微环境中显著减少，提示其免疫调节功能削弱可能助长了疾病进展。
CyTOF数据表明具有细胞毒性表型的NK细胞在NDMM患者中比例增加，但其表面标志物TIM3和TIGIT的高表达提示NK细胞耗竭状态可能限制了其抗肿瘤能力。
CIBERSORT分析显示，NDMM患者的CD8+ T细胞比例增加，伴随CD4+ T细胞中记忆T细胞比例的下降。 抑制性T细胞PD1及TIGIT的高表达在MM进展过程中增加，可能导致T细胞功能抑制，助长肿瘤免疫逃逸。
scRNA-Seq揭示TME中GZMB+ CD8+细胞毒性T细胞亚群显著增多，并表现出患者特异性，提示这些细胞可能对个体化抗原产生特异性抗肿瘤反应。 TME中CD8+ GZMK+ T细胞亚群减少，而GZMB+亚群显著增加，提示细胞毒性T细胞功能状态的改变。
在进展样本中观察到MM克隆异质性的显著扩展，部分患者主要克隆比例显著增加。 配对样本中未发现补体抑制蛋白（如CD55和CD59）及免疫检查点配体PD-L1表达的显著差异，但可能由于组间表达异质性大。 基因表达分析显示，病态PCs（浆细胞）基因表达模式发生变化，并可归为不同亚型。
小
结
研究发现与意义：多组学分析揭示了多发性骨髓瘤（MM）及其前驱阶段的免疫微环境显著变化，包括粒细胞比例减少、树突细胞功能下降和T细胞抑制性积累。这些发现为理解MM的进展机制提供了新视角，揭示了潜在的免疫治疗靶点。
粒细胞与预后：中性粒细胞和肥大细胞在MM及其前驱阶段显著减少，且低粒细胞比例与NDMM患者的较差预后相关，提示粒细胞比例可作为MM预后的预测因子。
单核细胞和树突细胞：CD16+单核细胞和浆细胞样树突细胞在MGUS阶段即表现出HLA-DR表达下降，暗示髓源性抗原呈递功能早期削弱，可能影响肿瘤免疫逃逸。
NK细胞状态：MM进展中NK细胞表现出耗竭特征，尽管其细胞毒性表型增加，但抑制性标志物TIM3和TIGIT的表达上升，暗示其抗肿瘤活性减弱。
T细胞积累和抑制表型：PD1+CD4+和TIGIT+CD8+抑制性T细胞在MM及前驱阶段逐步积累，可能促使肿瘤逃逸免疫监视。
个体特异性细胞毒性T细胞：TME中GZMB+ CD8+细胞毒性T细胞亚群显著增多并具有患者特异性，提示这些细胞可能对抗特异性抗原产生反应。
MM克隆组成的异质性：在配对样本中观察到MM克隆的异质性增加，尤其在进展病例中主要克隆显著扩展，表明肿瘤细胞克隆性扩增在疾病进展中可能占主导地位。
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