IF-14.7/Q1 | 胃肠道间质瘤的基因组特征与亚型分类：YLPM1突变的功能解析

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的胃肠道源性肉瘤，通常起源于胃或小肠。GIST的形成多与KIT或PDGFRA基因的激活突变相关，已知约75-80%的GIST患者具有KIT基因突变，5-10%的患者具有PDGFRA基因突变。这些基因突变驱动了GIST的发生，但GIST患者的临床病程差异极大，低风险GIST可能多年无明显进展，而高风险GIST可迅速发展至转移性疾病。目前，临床上主要通过酪氨酸激酶抑制剂（如伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼等）治疗，但疗效在部分患者中有限，且会产生耐药突变。虽然已有小规模研究揭示了GIST的部分基因组特征，如DEPDC5、SETD2、SDH等基因的突变，但尚缺乏对GIST系统全面的基因组和转录组分析。本研究通过整合全基因组测序、全外显子组测序和全转录组测序的多层次分析，首次绘制了GIST的基因组和转录组全景图，提出了GIST的四个亚型，并挖掘了潜在的新驱动基因YLPM1，旨在揭示GIST的分子机制和精准治疗新策略。

1. 样本收集与分组：研究纳入了117个GIST样本（包括113个冷冻肿瘤样本和4个GIST细胞系），共涉及105名患者。根据NIH临床病理标准，将GIST样本分为低风险、中风险、高风险和转移性组。

2. 多组学测序：

• 对59个GIST样本及其对应的正常样本进行全外显子组测序（WES），平均测序深度达131.99×。

• 对19个GIST样本及其对应的正常样本进行全基因组测序（WGS），平均测序深度为54.09×。

• 对116个样本（107个冷冻肿瘤样本、4个细胞系和5个匹配的正常样本）进行全转录组测序（WTS），以分析基因表达模式。

3. 突变分析：

• 使用MutSigC2V软件进行突变筛选，确定了KIT和YLPM1为显著突变基因。

• 对YLPM1的突变和失活进行功能验证，包括CRISPR/Cas9敲除YLPM1后的生长和增殖实验。

4. 结构变异和拷贝数变异分析：

• 通过Manta软件识别结构变异（SV），分析染色体碎裂（chromothripsis）和突变簇（kataegis）现象。

• 使用GISTIC2.0软件分析拷贝数变异（CNV）并识别基因拷贝数与基因表达的相关性。

5. 基因表达与功能验证：

• 基因集合富集分析（GSEA）以评估YLPM1对基因表达谱的调控作用。

• 利用小鼠模型验证YLPM1对肿瘤生长的影响。

• 每个肿瘤样本的体细胞编码突变（SNVs/Indels）、拷贝数变异（CNVs）和结构变异（SVs）等特征表现出随风险水平增加而递增的趋势。中位突变负担（TMB）为0.67突变/百万碱基对（Mb），与其他低突变负担癌症（如慢性淋巴细胞白血病）相似。
• GIST的TMB显著低于TCGA报道的其他6种成人肉瘤（平均1.06/Mb），但CNV负担较高，平均覆盖基因组的19%（0-78%）。
• 具体来看，检测到2126段拷贝数增益和6246段拷贝数丢失，SV事件（如BND、DEL等）在样本间变化较大，范围从0到39个SVs。
• 在高风险和转移性GIST中，体细胞突变、CNV和SV均显著增加，特别是在高风险GIST中，克隆和亚克隆突变负担更高（图1b，p < 0.001），提示肿瘤进展过程中基因组复杂性增加。

• KIT、PDGFRA和YLPM1是GIST中主要突变的基因，其中KIT突变主要集中在外显子11、9、13和17（图2a和2c）。例如，KIT外显子9中的A502_Y503insFA突变为功能获得性突变，对伊马替尼和舒尼替尼敏感。
• YLPM1是除KIT外突变最频繁的基因（10.3%，7/68患者），且多为截断性突变，具有潜在的肿瘤抑制功能。SETD2的失活突变在高风险/转移性GIST中发生较多（图2a）。
• YLPM1、ARID1A和SETD2等基因突变富集于染色体组织、蛋白磷酸化、细胞周期等生物学过程，表明这些过程的异常参与了GIST的发生机制。

• YLPM1失活的GIST细胞（通过CRISPR/Cas9系统敲除）表现出增殖和氧化磷酸化增强。在小鼠实验中，YLPM1失活后肿瘤生长显著加快（图3j-l），恢复YLPM1表达则显著抑制肿瘤生长（p < 0.001）。
• YLPM1蛋白表达丢失在47%的样本中发生，且与基因拷贝数丢失（40/68例，59%）相关，提示YLPM1失活可能是早期事件。
• 免疫组化显示，低风险和中风险GIST患者中分别有38%和59%的样本缺乏YLPM1表达（图3e），表明其失活在GIST不同风险水平中广泛存在。

• GISTIC分析识别了22q、1p、9q等染色体臂区域的CNV，特别是在转移性GIST中更为常见（p < 0.05）。如22q的拷贝数丢失频率高达57%，与已知的肿瘤抑制基因CDKN2A和SETD2等相关。
• 共15个CNV峰区（涉及211个基因），其中大多数为基因丢失（12个丢失区域，对比3个扩增区域）。高风险或转移性GIST样本中，CNV区域包含许多重要的肿瘤抑制基因，如CDKN2A和SETD2（图4b）。
• 基因拷贝数与mRNA表达高度相关（ρ > 0.535），如CDKN2A（ρ = 0.73）、DEPDC5（ρ = 0.8）和SETD2（ρ = 0.74），这些基因的表达与MYC靶基因、氧化磷酸化和DNA修复通路的活性增加相关。

• 在19个WGS样本中，10.5%的GIST中观察到染色体碎裂（chromothripsis），其中2例为TKI初治患者。染色体碎裂的区域通常表现为连续的拷贝数振荡，且这些事件集中在高风险或转移性GIST中（45%，p < 0.0001）。
• 在3个GIST样本中观察到突变簇（kataegis），表现为大量C > T或C > G突变，突变簇事件多出现在转移性GIST中，这提示这些复杂结构变异可能与晚期肿瘤进展相关。

• YLPM1失活后，GIST细胞的氧化磷酸化显著增强，包括氧气消耗率（OCR）和ATP生成量显著上升（图6）。这表明在失活的YLPM1状态下，GIST细胞更依赖于氧化磷酸化以促进生长和增殖。

• 第一亚型：以KIT突变为主，低TMB，表现为低免疫活性，适合使用KIT酪氨酸激酶抑制剂。
• 第二亚型：富含高CNV负担和染色体碎裂事件，适合更激进的治疗方式。
• 第三亚型：基于新发现的YLPM1突变，以氧化磷酸化为特征，可能对氧化磷酸化抑制剂敏感。
• 第四亚型：具有较高的免疫细胞浸润，可能对免疫治疗敏感。

• 本研究通过整合WGS、WES和WTS数据，系统性描绘了GIST的基因组和转录组特征，揭示了低突变负担和普遍的拷贝数变异，特别是在高风险和转移性GIST中观察到的复杂基因组改变。

• 研究确认了KIT和PDGFRA是GIST的主要驱动基因，且它们的突变呈互斥分布。新发现的突变基因YLPM1可能具有抑癌功能，其失活显著促进了肿瘤增殖和氧化磷酸化。

• 实验证实了YLPM1失活对GIST生长的促进作用，并且YLPM1失活状态下的GIST更依赖氧化磷酸化通路，提示YLPM1可能是GIST进展中的关键分子。

• 染色体碎裂（chromothripsis）和突变簇（kataegis）事件主要集中在高风险或转移性GIST中，提示这些复杂的基因组变异可能与晚期GIST的快速进展相关。

• 研究提出了四个GIST亚型，每个亚型具有独特的基因组特征、免疫特征和治疗敏感性。