IF-14.7/Q1 基于多组学整合分析的鸡腹部脂肪沉积及其肥胖与代谢相关遗传调控机制研究

鸡因其高效的肉蛋生产和代谢特性，是全球范围内广泛饲养的农业动物。然而，腹部脂肪沉积（AFD）不仅影响鸡肉品质，还严重降低饲料转化效率，影响产蛋率和孵化率。因此，控制鸡的AFD成为家禽育种中亟待解决的重要问题。此外，由于鸡在早期代谢病尤其是类似于人类2型糖尿病的特性（如高血糖和胰岛素抵抗），它们被用作肥胖和代谢性疾病的理想动物模型。这种模型有助于揭示人类肥胖及其相关基因调控的潜在机制。尽管全基因组关联研究（GWAS）已帮助识别出与AFD相关的基因变异，但这些变异的功能机制特别是在非编码区的功能机制仍不清楚。这导致许多基因调控机制仍处于“黑箱”状态，而三维基因组学的进展为跨越长距离的调控基因识别带来了新的可能。本研究将通过三维基因组学、多组学数据的整合，并结合功能验证，系统地揭示鸡AFD的关键遗传调控机制。

• 样本选择：本研究选用东北农业大学肉鸡系品系（NEAUHLF）作为实验对象，涵盖了自1996年以来在腹部脂肪沉积（AFD）性状上表现出显著分化的肥胖品系（FL）和瘦体品系（LL）。

• 全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）：对330只鸡进行全基因组测序，通过变异分析识别全基因组范围内的单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失变异（InDels），为后续功能注释和选择信号分析奠定基础。

• 选择信号分析：利用基因组分化指数（FST）和核苷酸多样性比率（θπ）分析脂肪沉积性状的选择信号，通过筛选显著的变异位点锁定可能参与AFD调控的候选变异。

• 开放染色质区域检测（ATAC-seq）：在鸡腹部脂肪组织中使用ATAC-seq技术，分析FL和LL品系的染色质开放状态，识别差异性开放染色质区域（Differentially Open Chromatin Regions, DOCRs），进一步筛选可能具有功能性影响的变异位点。

• 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）：通过ChIP-seq标注DOCRs中的特定调控元件，包括启动子（H3K4me3、H3K27ac标记）、增强子（H3K4me1、H3K27ac标记）、沉默子（H3K27me3标记）及CCCTC结合因子（CTCF）结合位点，为识别和注释DOCRs的功能提供表观遗传证据。

• 高分辨率染色质三维结构分析（Hi-C）：利用Hi-C技术生成腹部脂肪组织的染色质三维空间结构图谱，解析FL和LL品系中拓扑关联结构（TADs）和染色质环（Loops）等高阶染色质构象差异，定位变异对基因调控网络的远程调控作用。

• 加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis, WGCNA）：通过构建基因共表达网络，分析调控基因的共表达模式，确定与AFD相关的关键基因模块及其潜在的调控变异，以揭示AFD的潜在调控网络。

1. 鸡品系间腹部脂肪特征的差异

2. 差异开放染色质区域与调控元素的鉴定

3. 染色质三维结构分析

4. 基因共表达网络分析与脂肪特征关联

5. IMVGI变异位点与调控基因的互作网络

6. IMVGI变异位点rs734209466作为特异性增强子促进IGFBP2和IGFBP5的转录

IMVGI模型所鉴定的关键变异位点rs734209466的功能性验证结果显示，通过Sanger测序确认rs734209466为13bp的插入/缺失（InDel）位点，并位于一个活性增强子区域内（此区域富集H3K27ac和H3K4me1标记），在肥胖品系（FL）中显示出更高的信号强度。

• 变异位点与脂肪沉积的关系：在分析rs734209466的基因型与脂肪沉积性状的关系时，发现携带rs734209466-InIn基因型的个体表现出显著更高的腹部脂肪重量（AFW）和腹部脂肪百分比（AFP）相比于携带rs734209466-DelDel基因型的个体（p < 0.0001）。这表明rs734209466-In等位基因可能与脂肪沉积性状的增加有关。

• 增强子活性实验：通过等位基因特异性荧光素酶报告基因实验，验证了rs734209466-In等位基因的增强子活性。实验结果显示，携带rs734209466-In等位基因的报告基因片段的荧光素酶活性显著高于rs734209466-Del等位基因（p < 0.0001），确认rs734209466-In作为特异性增强子，具有显著增强基因表达的功能。

• 目标基因分析：IMVGI模型显示rs734209466-In可能通过染色质环与远程靶基因IGFBP2和IGFBP5的启动子区域相互作用，从而增强这两个基因的转录。同时，实时定量PCR（RT-qPCR）分析表明，在FL品系的脂肪组织中，IGFBP2和IGFBP5的mRNA表达水平显著高于LL品系（p < 0.05），进一步证实了rs734209466-In等位基因的特异性增强作用。

• 特异性验证：相比之下，近距离靶基因CXCR1和TNS1的表达水平未因rs734209466-In等位基因的存在而显著改变（p > 0.05），这进一步表明rs734209466-In通过远程调控作用特异性地增强IGFBP2和IGFBP5的转录活性。

7. rs734209466增强子活性验证

关键变异rs734209466在增强子区域的功能验证。电泳迁移率变动实验（EMSA）显示带有rs734209466–In等位基因的探针能够与核提取物结合，而带有rs734209466–Del等位基因的探针未显示相同的结合能力。此外，超迁移实验显示IRF4能够直接结合rs734209466–In位点的探针。过表达IRF4进一步显示rs734209466–In等位基因的增强子活性显著上调（p < 0.0001），特别是对远程靶基因IGFBP2和IGFBP5的转录活性产生显著增强，但对近距离靶基因CXCR1和TNS1无影响。这些结果表明，rs734209466–In等位基因作为特定增强子通过IRF4结合促进了IGFBP2和IGFBP5的表达，进而促进脂肪细胞的分化与增殖。

• 研究背景：本研究针对鸡的腹部脂肪沉积（AFD）特性，通过揭示其关键的遗传调控机制，为家禽育种和人类代谢性疾病的研究提供了重要参考。选择了具有显著脂肪沉积差异的东北农业大学肉鸡品系（NEAUHLF）作为研究模型。

• 多组学整合分析：通过全基因组测序、表观遗传学、三维基因组学（3D genomics）和转录组学的多组学数据整合，系统构建了鸡AFD的染色质三维调控网络，鉴定了与AFD相关的关键基因变异位点和远程调控机制。

• 关键变异位点的鉴定：筛选出rs734209466等关键变异位点，该位点位于活跃增强子区域并作为等位基因特异性增强子，能够远程调控IGFBP2和IGFBP5基因的表达，从而影响脂肪细胞的分化和增殖，最终影响AFD性状。

• 转录因子的作用机制：研究发现rs734209466–In等位基因能够通过特异性招募转录因子IRF4来增强其调控活性，进一步激活IGFBP2和IGFBP5的表达，从而促进腹部脂肪沉积。

• 3D基因组调控结构：Hi-C数据揭示FL和LL品系在拓扑关联结构（TADs）和染色质环（loops）上存在显著差异。rs734209466等位基因与目标基因通过染色质环结构进行远程相互作用，从而对特定基因实现跨距离调控。

• 基因共表达网络与脂肪沉积的关联：通过WGCNA分析，研究构建了AFD相关的基因共表达网络，识别出一系列与脂肪沉积相关的关键基因模块，为理解AFD的基因调控网络提供了新的视角。