IF-21.4/Q1 | 单细胞多组学cis-孟德尔随机化饮酒行为研究：皮层蛋白质组和细胞特异性转录组因果靶标筛选

酒精使用障碍（AUD）和问题饮酒行为在全球范围内普遍存在，对公共健康构成了严重威胁，每年导致超过5%的全球死亡率。尽管在AUD领域已取得一些进展，目前FDA仅批准了三种治疗药物，且其治疗效果有限。近年来，研究逐渐转向更精细的饮酒行为指标，例如饮酒频率（AIF）、每周饮酒量（DPW）、酗酒频率和AUD的分类，而非仅以完全戒酒作为结局。遗传学在揭示酒精使用行为的遗传易感性上取得了重要突破，通过全基因组关联研究（GWAS），研究人员已识别出多种相关的遗传变异，但确定与这些变异相关的致病因子及其分子机制仍面临挑战。

使用孟德尔随机化（MR）将遗传变异作为工具变量以评估暴露和结果之间的因果关系，为理解这些复杂机制提供了新的途径。MR能够克服传统流行病学中混杂因素和反向因果的局限性，通过cis-MR的策略可以评估与特定基因位点紧密相邻的遗传变异在酒精使用行为中的作用，进而有望发现新的治疗靶标。然而，蛋白质组学和转录组学在大脑皮层层面的结合应用仍不多见，限制了对这些靶标的系统性识别。此外，大脑皮层蛋白与细胞类型特异性基因表达在酒精使用行为中的分子机制方面存在较大差异。基于上述背景，本研究整合了蛋白质组和单细胞转录组数据，通过MR方法系统性地筛选与AUD和饮酒行为相关的靶标，评估其对酒精行为的因果影响，并通过神经影像和独立人群验证其生物学意义。

1. 数据来源

• 蛋白质组数据：分析来自3个关键皮层区域（背外侧前额叶皮层、眶额皮层和海马旁回区域）的蛋白质表达数据，共约3,500个皮层蛋白，其中722种用于分析。

• 转录组数据：基于8种大脑细胞类型，包括星形胶质细胞（AST）、兴奋性神经元（EXC）、抑制性神经元（INH）、少突胶质前体细胞（OPC）、血管周细胞（PER）、内皮细胞（END）、小胶质细胞（MIC）和少突胶质细胞（OLI），筛选出6,100多个基因（每种细胞类型192个），以便在不同细胞类型中比较。

• GWAS数据：数据来自多个大型酒精相关行为的GWAS（总样本量≤537,349），包括饮酒频率（AIF）、每周饮酒量（DPW）、酗酒频率和AUD。

2. 孟德尔随机化筛选

• 使用两样本cis-工具MR方法（IVW、MR Egger、最大似然法），根据紧邻基因的SNPs（±100 kb）进行筛选。

• 为皮层蛋白质构建了2,269种以多SNPs表示的MR工具变量，对皮层蛋白的F统计量均值为42.0（范围12.12-825.70）；细胞类型转录组工具变量的平均F统计量为20.21（范围12.12-238.60），解释了基因表达方差的9%左右。

3. 共定位分析

• 通过共定位分析筛选出显著相关的蛋白质和基因，对具有PP.H4（共因果变异概率）> 0.7的靶标视为高置信度靶标，明确是否存在共因果变异。

4. 神经影像学分析

• 利用MR分析对灰质厚度、皮层表面积、皮层厚度和白质微结构进行评估，识别蛋白质和基因表达水平对脑部结构和连接性的影响。

• 数据涵盖78个结构性MRI结局和110个白质弥散张量成像（DTI）特征，探索非重叠基因如何通过共因果路径影响脑部结构。

5. 独立验证

• 使用芬兰电子健康记录（EHR）数据对筛选出的靶标进行独立验证，队列样本量为377,277，评估其对AUD相关精神和物理结局的作用方向一致性。

1：皮层蛋白质组和细胞类型特异性转录组分析

• AIF：β = 0.180（95% CI = [0.127, 0.233]，P = 2.92×10−11）
• DPW：β = 0.149（95% CI = [0.116, 0.183]，P = 1.94×10−17）
• 酗酒频率：β = 0.278（95% CI = [0.193, 0.363]，P = 1.49×10−10）

• AIF：β = 0.064（95% CI = [0.0544, 0.083]，P = 8.11×10−11）
• DPW：β = 0.031（95% CI = [0.018, 0.043]，P = 9.52×10−7）

②细胞类型特异性转录组分析

在八种大脑细胞类型中识别了486种基因组合，这些组合中包含了255个独立基因，其中230个基因在特定细胞类型中表现出特异性，另有25个与皮层蛋白质组结果重叠。

例如，RBM6基因在五种细胞类型（AST、EXC、OLI等）中均与AIF显著相关：

• 星形胶质细胞（AST）：β = 0.045（95% CI = [0.028, 0.062]，P < 1.0×10−5）

• 兴奋性神经元（EXC）：β = 0.056（95% CI = [0.033, 0.079]，P < 5.0×10−6）

• 少突胶质细胞（OLI）：β = 0.038（95% CI = [0.021, 0.055]，P < 1.5×10−5）

此一致性关联表明RBM6在不同细胞类型中可能均参与调控AIF。

另一个关键基因FAM118A在所有八种细胞类型中均表现出降低AIF的效应，尤其是在OLI中，效应值为β = -0.065（95% CI = [-0.084, -0.046]，P < 2.0×10−8），提示其在抑制饮酒行为方面可能发挥重要作用。

③ 蛋白质与转录组靶标的重叠和独特性

• 兴奋性神经元（EXC）：β = -0.043（95% CI = [-0.06, -0.025]，P < 3.0×10−6）
• 抑制性神经元（INH）：β = -0.034（95% CI = [-0.048, -0.020]，P < 4.0×10−5）

• 通过共定位分析筛选出具有较高可信度的靶标，PP.H4值超过0.7的蛋白和基因被视为具有显著共因果变异。VIPAS39是饮酒频率（AIF）的一个新靶标，PP.H4达到0.85，表明该基因在饮酒行为中有高度显著的遗传关联。
• MAPT蛋白在AIF、DPW和酗酒频率中均达到显著共定位，例如，AIF的共定位概率为0.78，DPW的共定位概率为0.82。这种高可信度的共定位结果支持MAPT在多种饮酒行为中的重要性（图3a）。

• 皮层蛋白质组和细胞类型转录组的非重叠靶标在神经影像数据中表现出一致的脑结构和连接性特征。例如，在神经元细胞类型中，与RBM6和DDHD2相关的基因在灰质厚度和白质微结构上显示出显著关联，这些特征与酒精消费行为的遗传易感性存在潜在的共同神经机制（图3b）。

3：基于芬兰EHR数据的独立验证

• 在独立芬兰队列中验证了蛋白质组的主要靶标，其中35.5%的蛋白质（例如RHOA和SAMHD1）在多个酒精相关结局中显示出一致的方向性关联。RHOA在三种酒精相关结局中的OR值在0.58至0.63之间（P < 9.34×10−6），表明其在减少AUD风险中的潜在保护作用。
• SAMHD1的验证结果也支持其在降低AIF和AUD风险方面的一致作用方向，提示该蛋白在限制酒精使用行为方面的潜力。

• VIPAS39在芬兰队列中显示其对AUD风险的显著保护作用（OR = 0.91，95% CI = [0.862, 0.957], P = 9.2×10−5），进一步验证了其作为高置信度治疗靶标的潜力。

4：高置信度靶标对神经精神结局的影响

• MAPT的神经精神结局：MAPT蛋白水平增加与抑郁情绪降低（β = -0.050，95% CI = [-0.073, -0.028]，P = 1.46×10−5）及情绪波动降低（β = -0.086，95% CI = [-0.104, -0.067]，P = 3.79×10−20）有关，但其增加却与AUD风险增加相关。MAPT在这些神经精神结局中表现出显著的负向效应，而在AUD中表现正向效应，提示其在治疗AUD时可能增加某些神经精神风险。
• VIPAS39的神经精神结局：VIPAS39在5种神经精神结局上方向一致，表现出增加该蛋白水平能降低AUD风险的显著效果，同时也与认知功能改善（β = 0.051, 95% CI = [1.027, 1.082]，P = 8.43×10−5）和减少注意缺陷多动障碍风险（OR = 0.81, 95% CI = [0.714, 0.908], P = 3.97×10−4）相关，这支持其作为潜在的AUD治疗靶标。

• 识别出293种与酒精使用行为相关的蛋白质，其中48种与AUD、139种与饮酒频率（AIF）、79种与每周饮酒量（DPW）、27种与酗酒频率显著相关。MAPT和mTOR蛋白在多种行为中均表现出显著关联，表明它们可能是关键的调控因子。

• 在八种大脑细胞类型中识别出486种基因组合，包含255个独立基因，其中230个基因在特定细胞类型中表现特异性。RBM6和FAM118A基因在多种细胞类型中与AIF显著相关，可能在饮酒行为调控中起重要作用。

• 蛋白质组与转录组靶标重叠少，仅25个基因在所有酒精相关行为中表现一致性。DDHD2和CAB39L在不同行为中均表现出显著关联，显示它们在广泛的酒精使用行为中具有核心调控功能。

• 基于芬兰EHR数据的验证显示，多数蛋白质和基因在酒精使用行为中具有一致的方向性关联。VIPAS39和其他关键基因在减少AUD风险中发挥潜在作用。神经影像分析进一步揭示了这些靶标在灰质厚度和白质微结构上的显著影响。

• 本研究系统性筛选了多个新靶标和调控途径，为酒精使用行为的分子机制提供了重要的候选靶标。