单细胞与空间转录组联合多组学分析揭示肝细胞癌异质性及时空动态特征

文摘   2024-11-17 19:06   美国  

医学科研新动向

Single cell-spatial transcriptomics and bulk multi-omics analysis of heterogeneity and ecosystems in hepatocellular carcinoma

npj Precision Oncology

<2024年11月15日>

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是全球范围内高发且致死率较高的恶性肿瘤,因其病程进展伴随显著的肿瘤内异质性(Intratumoral Heterogeneity, ITH),导致患者对治疗的反应性和预后存在显著差异。ITH不仅表现为基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的多层次多样性,还通过重塑肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)和肿瘤免疫微环境(Tumor Immune Microenvironment, TIME)驱动癌症的进化及治疗抵抗。然而,传统高通量组学手段难以解析肿瘤异质性与微环境之间的复杂关系,而单细胞RNA测序(scRNA-seq)与空间转录组学(ST-seq)的结合,为分子特征的动态时空研究提供了前所未有的高分辨率工具。基于此,本文旨在通过多组学整合分析,构建HCC生态系统的时空动态图谱,揭示其异质性来源和生态位特征。

研究设计

1. 样本采集

  • 从6名HCC患者收集6例HCC组织及1例肝硬化组织样本。

  • 从1名非癌性肝组织供者获取正常对照组织和血液样本。

  • 病理诊断及血管生成相关检查通过组织学确认。

2. 实验设计

单细胞RNA测序(scRNA-seq);空间转录组学(ST-seq);全外显子测序。

转录组测序(全转录组和全长转录组);蛋白质组学分析;非靶向代谢组学。

3. 数据分析

  • scRNA-seq和ST-seq的单细胞与空间数据通过UMAP降维进行可视化和聚类。

  • 数据整合通过“Seurat”包构建全局异质性图谱。

  • 基因组、转录组和蛋白质组的共识特征通过基因标志物和模块分析确认。

  • 时间序列分析用于解读细胞亚群的动态演化。

4. 验证

  • 免疫组织化学(IHC)用于验证特定标志物在快速复发患者中的表达。

  • 在外部队列(如TCGA和ICGC)中进行独立验证。

核心结果

1:HCC异质性生态系统的全局图谱
  • 通过多组学整合,生成了25,624个高质量空间点和81,698个单细胞的转录组数据,成功构建了HCC的异质性和空间动态图谱。
  • UMAP降维分析显示,细胞类型包括HCC细胞(标志物:GPC3、AFP)、内皮细胞(标志物:VWF、CD34)、免疫细胞(包括CD8+ T细胞、巨噬细胞等)在空间上的分布差异明显。
  • 各细胞群的比例差异(通过热图展示)在不同患者样本间呈现显著变化,表明肿瘤微环境的个体差异性。
2:HCC异质性的主要来源
  • HCC内异质性(ITH)主要由HCC细胞的多样性引起。通过聚类分析,识别出55个细胞簇,其中11种细胞类型显示了不同的标志物表达(例如HCC细胞簇表现出AFP、GPC3等标志物)。
  • 免疫细胞(CD8+ T细胞、巨噬细胞等)在所有患者中均有较为一致的存在,但其空间分布和比例差异显著。空间分辨热图显示,不同类型的免疫细胞在肿瘤及非肿瘤区域的分布存在显著差异(P < 0.05)。
  • 基于空间转录组学分析,HCC细胞与免疫细胞的相互作用对肿瘤微环境的形成和异质性具有重要影响。
3:HCC细胞的特异性标志物
  • 通过多组学分析,识别了NPW、IFI27等新型HCC细胞标志物,并在UMAP图中显示这些标志物在HCC亚群中的特异性分布。
  • 在蛋白质组和转录组数据中,NPW和IFI27的表达在不同患者的HCC细胞中具有一致性,且与肿瘤侵袭性相关。
  • 代谢组数据进一步表明,在HCC细胞中,特定代谢物(如20-羟基ecdysone、胆固醇硫酸酯)与HCC病灶及周围组织中的表达水平存在显著相关性(P < 0.01)。
4:免疫微环境的重编程
  • 通过空间转录组学,我们发现M1型TAM表现出高代谢活动(如ENO1、GAPDH、LDHA)但免疫细胞杀伤和抗原呈递功能受损。
  • 热图和空间图分析显示,M1型TAM的代谢途径(如氨基酸代谢、糖酵解)在HCC患者中显著上调,而其抗肿瘤功能(如抗原呈递、免疫杀伤)却显著下调(P < 0.05)。
  • M2型TAM在HCC病灶中显著表达免疫抑制因子(如TGF-β、PD-L1),通过CD86-CTLA4相互作用,增强免疫抑制效应。
5:肝硬化与HCC的平行演化
  • 通过单细胞RNA-seq和全外显子组学分析,发现患者#4的肝硬化(CIR4)和HCC(HCC4)病灶具有共同的祖细胞起源。
  • 基因组分析显示,CIR4和HCC4的染色体拷贝数变异(CNV)存在高度重叠,表明两者具有共同的演化起源。
  • HCC4和CIR4的转录组分析显示,CIR4细胞主要激活了肝病相关信号通路(如炎症通路),而HCC4细胞则激活了癌变和增殖相关的信号通路(如Wnt/β-catenin、PI3K-Akt)。
  • 空间分布分析显示,CIR4区域主要聚集肝病相关的基因模块,而HCC4区域则富含癌变和代谢异常相关基因模块。
6:免疫微环境的动态变化
  • 免疫细胞的伪时间序列分析显示,CD8+ T细胞在CIR4和HCC4中经历了显著的免疫耗竭。CD8+ T细胞在HCC4周围逐渐转变为“疲劳型”(表面标志:CTLA4、PD-1),而在CIR4区域,CD8+ T细胞则恢复为高效的抗肿瘤状态。
  • 空间图和热图进一步表明,HCC细胞通过HAVCR2-Galectin9和CD86-CTLA4轴直接抑制CD8+ T细胞的抗肿瘤功能,形成了免疫抑制的微环境。
  • 统计结果表明,HCC细胞与TAM和CD8+ T细胞之间的相互作用频率显著高于其他细胞类型(P < 0.05)。
7:HCC的血管生态位
  • HCC的高血管生成特征通过空间转录组学确认,患者#3、#4和#5的病灶均表现出显著的微血管密度(MVD ≥ 50血管/200×高倍视野)。
  • 内皮细胞(En)的多样性较低,但通过聚类分析发现,HCC细胞通过外泌体与内皮细胞的相互作用促进血管生成和肿瘤进展。
  • 空间图和功能通路分析显示,En细胞表现出明显的表型保守性,但其功能在HCC患者中通过HIF-1和EMT信号通路被动态调控(P < 0.01)。
8:快速复发的生态位基因
  • 通过UMAP图和热图分析,鉴定了与HCC快速复发相关的特异性生态位基因(如KRT8、KRT18、KRT20),这些基因在患者#2中表达显著高于其他患者(P < 0.05)。
  • 在快速复发的患者中(患者#2和#5),这些基因的表达在空间分布上呈现一致性,且在基因组、转录组和蛋白质组层面均高度表达。
  • 通过IHC验证,KRT8、KRT18和KRT20在快速复发患者的组织中显著高表达(P < 0.05),并通过外部队列(TCGA)进一步验证了其作为快速复发标志物的潜力。


1. 异质性来源

  • HCC的肿瘤内异质性(ITH)主要由HCC细胞亚群的多样性驱动,贯穿基因组、转录组、蛋白质组和代谢组。

  • 肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和CD8+ T细胞的比例和功能表现因患者而异,是免疫微环境异质性的核心。

2. 肝硬化与HCC的演化关系

  • 肝硬化(CIR)和HCC病灶具有共同的祖细胞起源,但其演化轨迹平行且各自独立。

  • CIR主要激活炎症和纤维化相关信号,而HCC激活癌变、增殖和代谢异常相关通路。

3. 免疫微环境重编程

  • M1型TAM代谢活性增强,但抗肿瘤功能受损,而M2型TAM通过与调节性T细胞的相互作用,显著促进免疫抑制。

  • HCC细胞通过强效的免疫检查点信号轴(HAVCR2-Galectin9和CD86-CTLA4)直接调控免疫细胞的耗竭和免疫抑制。

4. 血管生成与微环境调控

  • HCC细胞通过外泌体介导的细胞间通讯,动态调控内皮细胞(En)的功能,促进血管生态位的形成。

  • 血管生成与HIF-1信号通路相关,患者间的差异可能与复发风险密切相关。

5. 快速复发的分子特征

  • 识别出KRT8、KRT18、KRT20等与快速复发相关的生态位基因,这些基因在患者#2和#5中显著高表达。

  • IHC和外部队列验证表明,这些基因可作为快速复发的潜在分子标志物,为复发风险预测提供依据。

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