2024 年10 月 23 日，来自Washington University School of Medicine, St. Louis的Darryl A. Wesener等人在Nature Chemical Biology上发表了一篇题为In vivo manipulation of human gut Bacteroides fitness by abiotic oligosaccharides的研究性论文。

在自然界中，多糖是通过模板独立的过程合成的，该过程使用特定的糖基转移酶和活化的单糖载体供体糖作为底物。天然存在的多糖的结构多样性受到几种机制的限制，包括编码糖基转移酶的基因的表达模式，这些酶的连锁特异性，以及活化的单糖供体和合适受体的产生和可用性。拟杆菌门的成员擅长代谢多糖，并通过横向基因转移和/或基因重组，使其基因组功能多样化，以利用各种天然多糖。虽然对天然多糖结构多样性的估计很难得出，但基于拟杆菌门基因组中编码的降解碳水化合物活性酶(CAZyme)基因簇的数量和多样性的估计表明，存在数千种独特的天然结构。该值比理论上可能的值小多个数量级，强调了在生命系统中运行的生物合成过程的限制。

合成生成的多糖可以包含以前在自然界中未发现的结构和连锁组合。最近开发的一种可推广的合成多糖(SGs)的方法涉及单糖构建块和两性离子树脂，该树脂催化单糖的还原端与生长的SG上的受体羟基之间形成糖苷键。通过改变单糖的起始材料和反应条件，可以以一种与生物催化或生物相容性无关的方式获得一组不相同、不重复的寡糖。而是由热力学原理(单糖环构象和异位物)和动力学原理(给定糖苷键的形成)驱动。这种合成方法可以捕获巨大的化学多样性，其中给定的单糖(1)以不同的环确认表示(例如，吡喃糖与呋喃糖)，(2)通过α-或β-异构体键连接，(3)与生长中的寡糖上的任何羟基共价结合。此外，该方法可用于优化所产生的结构类型，并产生所需的公斤数量，以支持将从临床前模型获得的结果转化为概念验证的人体研究。

与肠黏膜相关的膳食碳水化合物和糖复合物被肠道微生物群的成员消耗；它们的降解/代谢产物对宿主生理具有直接和间接的广泛影响。SGs的一个潜在应用是作为治疗药物选择性地改变人类肠道微生物群的组成和表达功能。在以前的研究中，SGs被添加到人类粪便群落的离体培养物中或常规饲养的小鼠中，并通过培养独立方法表征其对细菌分类群相对丰度的影响。在目前的研究中，研究了某些人类肠道拟杆菌对体外和非生物小鼠SG制剂的反应机制。研究结果不仅表明SGs可以通过其作为碳源来改变肠道微生物群的组成和功能，而且还为优化其选择性生物学效应提供了路线图。

1.SGs对体外人体肠道细菌生长的影响  

从数百个先前报道的池中选择了8个SG池；选择基于它们在不同的化学空间中的占据，该空间由从SGs和天然多糖7收集的无监督聚类的糖-酰基连锁数据定义。8个SG池分别由1-3个单糖构建块生成，单糖起始原料的含量<3%，平均聚合度(DP)中位数为12.45(范围为8.09-15.03)。8个sg池中的每一个都含有不同长度和结构组成的寡糖，如它们的多分散性指数(PDI；范围1.29-2.10)。利用从5个健康供体获得的完整人类粪便样本进行体外发酵实验，初步表征了8个SG池对细菌生长的影响(通过600 nm测量光密度的变化(OD600)或培养物pH值的变化来定义)。从甜菜中分离的阿拉伯多糖 (SBABN)被用作参考对照。根据记录的最小pH值(发酵的生物标志物)，得出结论SG池发酵程度低SBABN。孵卵45 h后进入固定期，采用聚合酶链反应(PCR)扩增菌群中细菌16S核糖体RNA(rRNA)基因可变区4 (V4)。与未补充的对照组相比，只有SG池10(SG10)产生了拟杆菌属的分数代表增加(5个粪便群落中的4个；中位拟杆菌群的log2倍变化= 0.13±0.15(平均值±标准差(s.d.))；n=每个群落3个重复)(图1a)。SBABN增加了所有五个群落中拟杆菌的分数丰度(中位数变化为log2倍；0.57±0.02(均数±s.d)；n=每个群落3个重复)在比较单个粪便群落-SG池时，记录的额外分类群的代表性增加和减少的数据；例如，其他SG池对增加了Parabacteroides属的分数丰度，正如前面所观察到的)。

SG10是一个结构复杂的非完全相同的寡糖链，仅来自L-阿拉伯糖。11种可能的糖基键(包括环构象，不包括异构体)都存在，吡喃苷比呋喃糖环形式更丰富(例如，比较t-Arap和t-Araf的分数丰度。对吡喃糖环结构的偏好与平衡l-阿拉伯糖单糖突变数据相符。此外，二维核磁共振波谱支持SG10的多种化学组成，其多个峰位于与α-或β-糖苷键一致的(1H,13C)-异核单量子相干(HSQC)光谱的异构体区域)。

图1.SG10在非生物小鼠模型中调节拟杆菌丰度。a，在添加了指定的碳水化合物制剂的培养基中，人类粪便样品离体培养中拟杆菌的分数丰度的log2倍变化(FC)。每个点代表来自五个人类供体群落之一的三次发酵的平均值(以形状表示)。数据来自生长45 h后微生物群落DNA中存在的细菌16S rRNA基因V4扩增子测序。未补充的对照仅代表培养基。箱形图中的中央条形代表中位数，铰链代表第一和第三个四分位数，箱形图须形代表1.5倍内的数据点四分位数范围。b，无菌小鼠模型的实验设计，以测试SG10对定义的92个细菌群落的影响。c，添加或不添加SG10的饮用水的小鼠之间细菌绝对丰度(每克盲肠内容物的基因组当量)的差异。所有30个分类群在两组小鼠之间的丰度差异显著(单因素方差分析，经fdr校正的P值<0.01)。柱状图表示两组间平均细菌绝对丰度的差异(n = 8只/组);误差条表示繁殖的s.d。细菌在两组中按最大丰度递减的顺序排列。插图:低丰度细菌的变化。

根据体外发酵实验的结果，选择SG10进行二次筛选，以检查其对拟杆菌的体内作用的特异性。为此，将92个成员的人类肠道源性细菌分离物引入成年无菌小鼠，这些分离物具有不同的分类特征，共包含326186个已知或预测的蛋白质编码基因。给药2 d后，将动物分为两组。在美国，两组都被单调地喂食饱和脂肪摄入量较高和水果蔬菜摄入量较低的饮食（hif - lofv）。第一组小鼠饮水中添加了经乙醇沉淀纯化的SG10制剂(5% wt:wt；相当于每只小鼠每天约250毫克SG10)；该制剂含有微量l-阿拉伯糖原料(1.7% wt:wt)，给药7d。第二组只喝不补充的水。第三组小鼠在整个实验期间保持无菌状态，同时食用这种饮食和补充SG10的水(每个治疗组n=8只小鼠；图1 b)。

细菌分类群的绝对丰度采用鸟枪法对灌胃后2、6和8天（dpg）和安乐死时盲肠内容物（dpg 9）中分离的微生物群落DNA进行测序。在引入小鼠的92株菌株中，56株满足定植标准(两个治疗组成员在任意一个时间点的平均相对丰度百分比>0.05%)。与未处理的小鼠相比，SG10处理小鼠盲肠内容物中30种细菌的绝对丰度显著不同(错误发现率(FDR)校正的P值<0.01，单向方差分析(ANOVA))(图1c)。添加SG10后，其中8株的绝对丰度增加≥1.5倍，20株的绝对丰度下降≥1.5倍。盲肠群落的响应与粪便群落相似(29个类群的丰度差异显著;线性混合效应模型（高斯），经fdr校正的P值<0.01；图2b)。两组定殖小鼠在盲肠（经fdr校正的P值0.32，单因素方差分析）和粪便（经fdr校正的P值0.026，线性混合效应模型（高斯））中的群落绝对生物量均无差异。先前的研究发现，当将不同的SG制剂添加到人类粪便样本的离体培养物中或常规饲养的小鼠中时，丙酸是最具反应性的短链脂肪酸（SCFA）。与这些报道一致，盲肠内容物的气相色谱-质谱（GC-MS）显示，在补充SG10的小鼠中，丙酸在总SCFAs中的分数代表增加，而其他SCFAs的代表减少（最明显的是乙酸）。这些SCFAs相对比例的变化，在没有改变盲肠群落总生物量的情况下发生，不是由丙酸绝对水平的净变化引起的(P = 0.45，具有Tukey 's诚实显著差异（HSD）的单因素方差分析；图3)。

在92种灌胃混合物中的17种拟杆菌中，15种是定植菌，其中9种在SG10处理后盲肠中的绝对丰度有统计学显著差异。9种拟杆菌中有3种的丰度显著增加，分别是B. intestinalis DSM 17393（10.1倍）、卵形芽孢杆菌American Type Culture Collection (ATCC) 8483（7.1倍）和芽孢杆菌ATCC 43185（1.5倍）(经fdr校正的P值<0.01，单因素方差分析；图2a)。大肠杆菌是SG10处理小鼠盲肠微生物群的主要成员(14.6±4.8 × 109（平均±s.d）基因组当量/克盲肠内容物；23.6±5.8（平均±s.d） %相对丰度)。群落中的其他拟杆菌的绝对丰度也经历了实质性和快速的下降，包括B. xylanisolvensXB1A，B. eggthii DSM 20697和B. thetaiotaomicronVPI-5482。

3.SG10改变多糖利用位点的表达

在这项研究之前，一个悬而未决的问题是，非生物多糖是否可以诱导多糖利用位点（PULs）的表达，而拟杆菌群成员利用PULs来感知、获取和代谢天然存在的多糖。PULs被定义为具有至少一对相邻的susC/ susd样基因，这些基因编码结合细胞外多糖并将其导入周质的蛋白质。PULs还编码各种负责多糖解聚的酶（糖苷水解酶（GHs）、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶）以及转录调节因子。因此，PUL基因的表达模式，以及它们编码的CAZymes已知或预测的功能，可以用来推断拟杆菌所利用的多糖的结构/活性关系。因此，通过比较从属于两个治疗组的定植小鼠收集的盲肠内容物的微生物RNA测序（RNA-seq）结果开始了机制分析。在56株定植菌株中，有33株符合测序深度和覆盖标准，并进行了差异基因表达分析。这些群落成员的每个基因组最初都使用亚系统技术（RAST）进行了快速注释对糖酶（CAZymes，糖酶数据库（CAZy））进行了额外的注释，重点是糖酶利用位点（PULs）。多糖利用位点数据库（PULDB）)和利用序列注释和探索数据库（SEED）平台（微生物群落SEED (mcSEED)）中实现的比较基因组学方法在计算机上重建的代谢途径。在33个生物体的82,708个注释基因中，15,421个（18.6%）在SG10处理下的表达有统计学显著差异(DESeq2 fdr校正P值<0.01；图2)。33个群落成员的基因组编码571个预测的PULs。基因集富集分析（GSEA）显示，在包含至少5个开放阅读框的PULs （n = 316）中，63个在在SG10处理期间，基因上调，而59个基因下调显著富集(fdr校正P值<0.05)。B. intestalis编码大量预测的CAZymes，属于不同的CAZyme家族，尽管在SG10无反应的B. cellulosilyticus菌株的糖生物群系中较少。在B. intestinalis中表现出统计学显著差异表达的1,281个基因中，284个指定了预测的CAZymes或位于PULs内(DESeq2 fdr校正P值<0.01)。GSEA显示，在补充SG10期间，有5个B. intestinalis PULs(在由至少5个基因组成的53个PULs中)显著富集了表达增加的基因(图2a；经fdr校正的P值<0.05)。PUL8(图2b)在所有肠芽胞杆菌PULs中表现出最大的上调(归一化富集评分(NES) 2.43；fdr校正P值2.41×10−12)。此外，该PUL在社区中所有63个上调PUL中具有最高的NES，其13个上调基因的平均变化为4.2±0.92 log2倍(平均±s.d) (DESeq2 fdr校正P值<0.01)。

B. intestinalis PUL8的天然底物，或其他与PUL8同源的拟杆菌中的PUL8，目前尚不清楚。B. intestinalis PUL8编码4个CAZy GH家族的5种酶；这5种酶中有4种属于具有β-L-阿拉伯糖靶向活性的CAZyme家族（GH127、GH146和GH97）。β-L-阿拉伯糖是植物多糖中的低丰度结构；它作为一些阿拉伯半乳糖的稀疏末端表位存在，存在于富含羟基脯氨酸的糖蛋白中。GH127和GH146家族酶已被鉴定β-L-阿拉伯葡萄糖苷酶活性，而据报道GH97酶可裂解末端β-L-阿拉伯葡萄糖苷。在PUL8中的这四个CAZymes中，除了BACINT_00515编码的GH146（预测β-L-阿拉伯糖铀苷酶活性）外，其他所有CAZymes都具有信号肽，使其能够分泌到质周间隙或细胞外。

PUL43是另一种SG10诱导的B. intestinalis PUL，在SG10处理下高表达（图2a）。它含有来自生长激素家族的多种酶，具有预测的α-或β-L-阿拉伯糖苷酶或阿拉伯糖酶活性，加上L-阿拉伯糖利用操纵子，该操纵子指定突变酶、渗透酶、异构酶、激酶和表观酶活性，对于将释放的阿拉伯糖转移到中心碳代谢至关重要（图2b）。PUL43的注释基因含量及其与B. thethetaiotaomicron VPI-5482 PUL7的相似性表明它用于降解阿拉伯植物。

SG10衍生的阿拉伯糖对群落反应的贡献的另一个证据来自于发现，参与利用阿拉伯糖或阿拉伯寡糖的mcSEED代谢途径在B. intestinalis、其他拟杆菌（B. cellulosilyticus WH2和B.）的SG10诱导基因中富集。uniformisATCC 8492)和其他群落成员。后者包括Enterocloster（原Clostridium）bolteae ATCC BAA-613，这是一个重要的群落成员，其绝对丰度在SG10处理后显著增加（图1c）；它上调了多种代谢途径，包括利用单糖或其他社区成员在碳水化合物分解代谢后产生的碳源，包括阿拉伯糖、己糖酸盐、鼠李糖、木糖和丙二醇42。

图3.用于量化MFABs体内SG10降解的分析方法的发展。a，与MFAB绑定的SG10原理图。b，在存在或不存在寡糖活化试剂CDAP的情况下，与SG10偶联的MFABs的中性单糖组成分析。每个数据点代表一个独立的样品制备(n = 3)，条形图高度代表平均值。误差条表示游离SG10或固定在MFAB表面的SG10的s.d.c, glysyl连锁分析。一致观察到完全支化的2,3,4- arap /2,3,5- araf的比例丰度增加这与MFAB-SG10界面上初始过甲基化反应的空间抑制一致。每个数据点代表一个独立的样品制备(n = 3)。柱高代表平均值和误差柱，其中标准差P值是使用双侧、未配对的Welch’s t检验计算的，未经校正。* p = 0.0007。d、提出的氢氧化铵从MFABs中释放SG10的机理。e，从MFABs释放的SG10 MALDI质谱的放大部分，描绘了每个DPmer之间一个阿拉伯糖单位的特征质量位移。表示峰m/z及其同一性。

考虑到在定植小鼠的拟杆菌基因组中仅在另外两个PULs中发现了B.intestinalis PUL8基因的同源物，可以进一步解释B.intestinalis的反应：B. cellulosilyticus WH2中的PUL26和B. cellulosilyticus DSM14838中的PUL42。在这两个PUL26中，只有B. cellulosilyticus WH2 PUL26在SG10补充期间上调(在整个群落中所有63个上调的PUL26中，其NES排名第五；图4b)。尽管与SG10相关的PUL26表达增加，但B. cellulosilyticus WH2在盲肠群落、饮食和SG背景下的绝对丰度没有统计学上的显著增加（经fdr校正的P值为0.8，单向方差分析）。

总之，这些发现促使了更多的机制研究，重点是开发和应用分析方法，以提供SG10寡糖成分如何被B. intestinalis加工的细节。

图4. 来自SG10的选择键在体内被降解。a，在体外暴露于过量的指定纯化GHs后，SG10-MFABs上剩余阿拉伯糖的绝对丰度。每个数据点代表一个独立的样品制备(n =6)。条形图高度代表平均值。误差条表示标准差。P值是使用双侧Mann-Whitney U检验计算的，未经校正。b，体外酶解、化学释放和MALDI-TOF ms分析后的SG10DPmers比例丰度峰高度归一化为该样品中最丰富的峰，使得每个样品中的最大值等于1。线条相交于样品中每个DPmer的比例丰度。c，暴露于过量的体外指示生长激素后，麦芽糖糊精- MFABs上剩余葡萄糖的绝对丰度。每个数据点代表一个独立的样本准备(n = 6)。柱高代表均值和误差柱，标准差值使用双侧Mann-Whitney U检验计算，未经校正。d，麦芽糖糊精DPmers的比例丰度体外酶解、化学释放和MALDI-TOF ms分析的峰高归一化为该样品中最丰富的峰，使得每个样品中的最大值等于1。这些线相交于样品中每个DPmer的比例丰度。e，SG10-MFABs在灌胃前(输入)或从小鼠盲肠内容物中恢复后剩余的阿拉伯糖绝对丰度。每个数据点代表单个小鼠(n = 8)，是重复独立样品制备的平均值。条形高度表示均值。误差条表示s.d。与输入组相比，每组小鼠的P值大于0.5(未校正)，并使用双侧Mann-Whitney U检验计算。f，SG10-MFABs的糖基连锁分析。每个点代表一只小鼠(n=8)，是三次独立样品制备的平均值。柱高描述均值和误差柱，标准差值使用Tukey’s HSD(置信水平0.95)的单向ANOVA计算。水平虚线表示“无酶”对照组的平均值。

将这些SG10结果与含有相似量结合麦芽糊精的MFAB所得的结果进行了比较。麦芽糖糊精的长度分布与SG10相似(13-17葡萄糖当量;估计分子数约为1300 Da)。麦芽糖糊精-MFAB用过量的酶孵育，这些酶已知对这种寡糖的α(1,4)和α(1,6)键具有特异性。单糖组成分析显示，用α-淀粉酶加淀粉葡萄糖苷酶消化后，固定化的麦芽糊精可去除66.5±11.8%(平均±s.d；n = 6个独立的样品制备)(图4c)。释放的麦芽糖糊精的MALDI-MS表明，消化后主要的低聚物从DP5还原为DP3(图4d)。

在体外确定了MFAB固定寡糖对可溶性降解酶的可及性后，用25个×10-6SG10 -MFAB灌胃三个处理组的每只小鼠。灌胃4小时后，大部分MFAB存在于盲肠内。在这个时间点，对小鼠实施安乐死，用磁性方法从其盲肠内容物中收集MFAB并纯化(方法)。GC-MS单糖组成分析显示，与输入珠粒相比，三组小鼠在MFAB表面残留的阿拉伯糖绝对质量无统计学差异(P值>0.5；双侧Mann-Whitney U检验)(图4e)。然而，对回收的MFAB进行糖基连锁分析显示，定植动物对t-Arap、3-Araf、4-Arap/5-Araf、3-Arap和2-Arap的优先去除具有统计学意义(P值<0.05;Tukey’s HSD的单因素方差分析(图4f)。没有预料到SG10寡糖中所代表的任何给定连接的全部被降解，因为(1)可能存在两种异构体(α-或β-)，(2)SGs不受酶催化的限制，因此与给定连接相邻的结构可以变化，(3)没有重复的结构。因此，精确量化与MFAB结合的糖基键的能力对于确定所假设的剩余键的比例丰度的细微差异至关重要。

6.诱导B. intestinalisGHs降解SG10

B. intestinalis PUL8和PUL43编码的基因的诱导，以及从小鼠盲肠中回收的MFAB结合的SG10的适度变化，使用SG10或SBABN作为底物来量化诱导的GHs的酶活性。PUL8的4个GHs（共5个）和PUL43的7个GHs（共7个）在大肠杆菌中表达，并得到足够量的纯化用于生化分析。

通过定量测定反应产物还原端和释放L-阿拉伯糖来表征糖的降解。总之，这两种方法可以量化和区分内水解活性和外水解活性。用已知活性的市售酶作为对照。正如预期的那样，一种α-阿拉伯糖酶和两种α-L-阿拉伯糖醛酸苷酶降解了SBABN。这些酶中的每一种也能够降解SG10，尽管程度较小（经fdr校正的P值<0.01，单侧Mann-Whitney U检验）。与α-淀粉酶或β-木聚糖酶孵育时，SBABN和SG10未见显著降解（fdr校正P值>0.01，单侧Mann-Whitney U检验）。

研究发现了多个由PUL8和PUL43编码的GHs，它们可以降解SG10（图5）。在PUL8中，BACINT_00526 （GH127）和BACINT_00520 （GH97）降解SG10，与不添加酶的对照培养相比，在反应产物中检测到的L-阿拉伯糖量显著增加(图5a；fdr校正P值<0.01，单侧Mann-Whitney U检验)。在PUL43编码的7个GHs中，SG10的降解被5种具有不同CAZy家族注释和预测活性的酶催化(图5b；fdr校正P值<0.01，单侧Mann-Whitney U检验)与SBABN（BACINT_00526和BACINT_002784）相比，预计靶向β-L-阿拉伯糖键的酶（GH127、GH146和部分GH97酶）在SG10孵育期间产生的L-阿拉伯糖反应产物更多。单个α-L-阿拉伯糖醛酸苷酶要么优先选择SBABN作为底物（BACINT_02766和BACINT_02786），要么以相似的程度降解阿拉伯糖和SG10 （BACINT_02767）。所有预测的α-L-阿拉伯糖醛酸苷酶都不倾向于SG10。虽然PUL43中的两种内缩-L-阿拉伯糖酶都能降解阿拉伯糖，但以SG10为底物时，它们都没有表现出明显的酶活性（图5b）。综上所述，这些结果确定了SG10对单个GHs降解的敏感性，这些GHs的基因在体内由B.intestinalis表达，并证明大多数SG10水解是由外显活性和L-阿拉伯糖的释放引起的（图5中比较检测到的L-阿拉伯糖与还原端的条高）。后一点很重要，因为PUL43编码的阿拉伯糖利用位点可以促进其作为碳源使用（图2）。

图5.由PUL8或PUL43编码的GHs可降解SG10。a,b，用SBABN或SG10作为底物，对B.intestinalis PUL8 (a)或PUL43 (b)编码的纯化GHs孵育30分钟产生的酶促产物进行定量。对于每个测试的GH，使用偶联酶测定法(黑色)测量释放的L-阿拉伯糖，并使用BCA测定法(灰色)定量生成的还原端。基因座标签id, GH家族注释和预测活性(基于最高的氨基酸序列认同实验表征GH家族成员)显示。每个点代表平均值(n=2；技术重复)的独立生物重复(n=3)。柱高描述均值和误差柱，使用单侧Mann-Whitney U检验计算与无酶对照的s.d.p值，并进行Benjamini-Hochberg校正。

7.单栽培条件下B.intestinalis对SG10的降解

在添加SG10期间，肠道芽孢杆菌的丰度显著增加，以及其PUL8或PUL43基因编码降解SG10的GHs的能力，促使进一步研究SG10的体外利用。为此，监测拟杆菌菌株在特定的拟杆菌培养基中单培养的生长情况，培养基中添加葡萄糖、SBABN或两种SG10制剂中的一种。制剂1通过柱层析纯化，去除低分子量低聚物和单糖起始物质，用于所有体外实验和体内测试的SG10-MFABs。制剂2未进行柱纯化，仅在小鼠实验中用于补充饮用水。考虑到SBABN具有类似阿拉伯糖的特性，通过在体内表达B. intestinalis PUL43和纯化的GHs在体外降解SG10，选择SBABN作为对照植物多糖。

B.intestinalis能够在含有两种SG10制剂的培养基中生长，尽管在这两种情况下，与葡萄糖或SBABN的生长相比，它的最大OD600都较低(n = 3个技术重复/条件；2个独立实验)（图6a）。

测试了在定植小鼠中存在的其他五种拟杆菌（B. cellulosyliticus WH2，B. xylanisolvens XB1A，B. thetaiotaomicron VPI-5482，B. ovatus ATCC 8483和B. caccae ATCC 43185）以及非定植Phocaeicola vulgatus ATCC 8482菌株在SG10上的生长能力。在SG10上，只有两株具有与B. cellulosilyticus WH2和P. vulgatus编码β-L-阿拉伯糖靶向酶基因同源的PUL的菌株生长（见图6b）。令人惊讶的是，在B.intestinalis在SG10上的体外生长过程中，没有诱导PUL8的表达。相反，发现SG10或SBABN作为唯一的碳源诱导相似水平的PUL43表达。因此，B.intestinalis PUL8或类似PULs对SG10体外生长的贡献仍不确定。这突出了将生化、体外和体内方法结合起来的重要性，并表明一种尚未确定的机制负责诱导PUL8在体内的表达。在被测试的7种拟杆菌中，只有B. caccae不能在SBABN上作为唯一的碳源生长，这表明在SBABN上生长的能力本身并不能预测在SG10上的生长。

在第一次有证据表明生长饱和时，从这些单一培养基中收集的条件培养基的定量单糖组成分析显示，葡萄糖或SBABN中含有的阿拉伯糖的利用动力学相似(21.4±1%葡萄糖剩余（平均±s.d）；剩余17.1±1.7%阿拉伯糖（平均±s.d）；n = 3个独立的样品制备)（图6c，d）。相比之下，SG10的阿拉伯糖在第一次饱和时（42 h时间点）仍有92.1±2.3%的阿拉伯糖留在培养基中，96 h后仍有85.8±1.3%（平均±s.d）。n = 3个独立样品制备；图6e)。在所调查的每个时间点剩余的阿拉伯糖单糖的量用于标准化从相同样品中收集的糖基连锁数据。在SG10上比较B.intestinalis生长过程中的连锁丰度，发现3-Araf丰度有统计学意义的降低(P = 0.008；3-Arap、2、4-Arap/2、5-Araf和4-Arap/5-Araf丰度呈下降趋势（P分别为0.07、0.07和0.09）；单向方差分析;每个时间点n = 3个独立的样品制备)（图6f）。值得注意的是，3-Araf、3-Arap和4-Arap/5-Araf也被优先地从MFAB结合的SG10中去除（图4f）。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-024-01763-6